甲基吲哚和芳香氨基酸修饰的2,5-二酮哌嗪,其合成,活性和应用的制作方法

本发明涉及3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(aa)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪。涉及它们的制备方法以及它们的抗肿瘤转移活性，因而本发明涉及它们在制备抗肿瘤转移药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术：

肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，肿瘤并发的转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90％以上肿瘤患者都是死于转移。由于现有抗肿瘤药物没有抗肿瘤转移作用，所以肿瘤化疗的临床疗效不理想。发明抗肿瘤转移的药物是临床的迫切需求。此前，发明人曾公开s,s-,r,r-,r,s-和s,r-四种构型的的二酮哌嗪在0.5μm浓度可抑制hcclm3(高转移人肝癌细胞)迁移和侵袭。后来发明人又公开r,r-构型的二酮哌嗪在最低有效剂量为5μmol/kg/天的剂量时可抑制c57bl/6小鼠的肿瘤向肺转移。为了降低最低有效剂量，发明人对r,r-构型的二酮哌嗪的丁氨基展开了各种修饰。经过3年探索，发现用芳香侧链氨基酸l-phe,l-trp和l-tyr酰化侧链氨基的l-lys酰化r,r-构型的二酮哌嗪的4-氨基正丁基可使抗肿瘤转移的最低有效剂量降至0.5μmol/kg/天。最低有效剂量降低10倍表明，这种结构修饰有突出的技术效果。根据这些发现，发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供下式的3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(aa)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(式中aa为l-phe残基,l-trp残基和l-tyr残基)。

本发明的第二个内容是提供下式的3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(aa)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(式中aa为l-phe残基,l-trp残基和l-tyr残基)的合成方法，该方法包括：

(1)d-boc-lys(cbz)与d-trp-obzl偶联得d-boc-lys(cbz)-d-trp-obzl；

(2)d-boc-lys(cbz)-d-trp-obzl在浓度为4n的氯化氢/乙酸乙酯溶液中脱除boc保护基得d-lys(cbz)-d-trp-obzl；

(3)d-lys(cbz)-d-trp-obzl在含5％碳酸氢钠水溶液的乙酸乙酯中环合生成3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)；

(4)1催化氢解脱苄氧羰基得3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)；

(5)2与l-boc-lys(cbz)偶联得3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(cbz)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(3)；(6)3催化氢解脱除苄氧羰基得3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-boc-lys-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(4)；

(7)4与boc-aa(aa为l-phe残基,l-trp残基和l-tyr残基)偶联得化合物3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(boc-aa)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(5a-f)；

(8)5a-f在浓度为4n的氯化氢/乙酸乙酯试剂中脱除boc保护基得3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(aa)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(6a-f)。

本发明的第三个内容是评价3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(aa)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(aa为l-phe残基,l-trp残基和l-tyr残基)抑制c57bl/6小鼠肺癌转移活性。

附图说明

图13r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(aa)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(aa为l-phe残基,l-trp残基和l-tyr残基)6a-c的合成路线.5a,6a中aa为l-phe残基；5b,6b中aa为l-trp残基；5c,6c中aa为l-tyr残基；i)二环己基碳二亚胺(dcc),1-羟基苯并三氮唑(hobt),n-甲基吗啉(nmm),四氢呋喃(thf)；ii)4n氯化氢-乙酸乙酯试剂；iii)乙酸乙酯,5％碳酸氢钠；iv)二甲基甲酰胺(dmf),pd/c,h2。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备d-boc-lys(cbz)-trp-obzl

将7.7g(20mmol)d-boc-lys(cbz)混悬于100ml无水四氢呋喃(thf)中，在冰浴下依次往悬浮液中加2.7g(20mmol)1-羟基苯并三氮唑(hobt)及5.0g(25mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)，然后搅拌30min。之后，加8.0g(25mmol)d-trp-obzl。反应混合物逐滴加入n-甲基吗啉(nmm)调节ph至9。反应混合物先在冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用150ml乙酸乙酯溶液溶解。得到的乙酸乙酯溶液依次用5％khso4水溶液洗3次，饱和nacl水溶液洗3次。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12h，过滤，滤液减压浓缩至干。得到的黄色糖浆物经硅胶柱层析纯化(ch2cl2/ch3oh,100:1)得到12.0g(88％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):657[m+h]⁺。

实施例2制备d-lys(cbz)-d-trp-obzl

在冰浴与搅拌下3.8g(5mmol)d-boc-lys(cbz)-d-trp-obzl与52ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)缓慢混合。得到的溶液在冰浴中搅拌5h。之后，反应混合物减压浓缩。残留物用50ml无水乙酸乙酯溶解，得到的溶液减压浓缩。该操作重复三次。残留物用无水乙醚充分洗，得到3.41g(93％)标题化合物，为黄色粉末。esi-ms(m/e):557[m+h]⁺。

实施例3制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)

将3.45g(6.2mmol)d-lys(cbz)-d-trp-obzl用150ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液用浓度为5％的碳酸氢钠水溶液洗三次，之后乙酸乙酯溶液室温搅拌12h使无色固体充分析出。滤出1.8g(51％)标题化合物。esi-ms(m/e):449[m+h]⁺。

实施例4制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)

向1.9g(4.2mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)与20ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)的溶液中加200mgpd/c，通入h2，室温搅拌反应12h。滤去pd/c，滤液减压浓缩得1.2g(92％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):315[m+h]⁺。

实施例5制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(cbz)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(3)

采用实施例1的方法从4.18g(11mmol)boc-lys(cbz)和3.14g(10.0mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)得到5.17g(76％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):677[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.852(s,1h),8.045(d,j＝1.8hz,1h),7.916(d,j＝1.8hz,1h),7.581(m,2h),7.345(m,6h),7.223(t,j＝5.4hz1h),7.025(m,2h),6.930(t,j＝6.9hz,1h),6.714(d,j＝8.4hz,1h),4.115(m,1h),3.812(m,1h),3.499(m,1h),3.206(dd,j1＝16.5hz,j2＝3.9hz,1h),3.172(d,j＝3.9hz,1h),2.993(m,3h),2.764(m,2h),1.478(m,2h),1.381(m,11h),1.426(m,2h),0.971(m,3h),0.600(m,3h)。

实施例6制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-boc-lys-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(4)

采用实施例4的方法从1.65g(2.44mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(cbz)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(3)得到1.49g(90％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):543[m+h]⁺；

实施例7制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(boc-phe)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(5a)

采用实施例1的方法从954mg(3.6mmol)boc-phe和1.62g(3mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-boc-lys-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(4)得到1.20g(87％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):790[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.854(s,1h),8.035(d,j＝2.1hz1h),7.926(d,j＝2.1hz1h),7.859(m,1h),7.592(m,2h),8.302(d,j＝8.1hz1h),7.220(m,5h),7.049(s,1h),7.024(t,j＝8.1hz1h),6.952(t,j＝8.1hz1h),6.931(d,j＝8.1hz1h),6.616(d,j＝8.1hz1h),4.118(m,2h),3.801(m,2h),3.496(m,1h),3.258(dd,j1＝14.4hz,j2＝3.9hz,1h),2.998(m,3h),2.738(m,2h),1.461(m,2h),1.376(m,10h),1.302(m,10h),1.228(m,2h),0.970(m,3h),0.587(m,3h)。

实施例8制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(boc-trp)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(5b)

采用实施例1的方法从1.094g(3.6mmol)boc-trp和1.62g(3mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-boc-lys-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(4)得到1.61g(65％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):829[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.856(s,1h),10.785(s,1h),8.044(d,j＝1.8hz1h),7.931(d,j＝1.8hz1h),7.859(m,1h),7.597(m,1h),7.571(m,2h),7.313(m,2h),7.114(m,1h),7.052(s,1h),6.998(t,j＝7.8hz2h),6.931(t,j＝7.8hz2h),6.703(m,2h),4.129(m,2h),3.810(m,1h),3.499(m,1h),3.262(dd,j1＝14.4hz,j2＝3.9hz,1h),3.031(m,4h),2.900(m,1h),2.781(m,2h),1.461(m,2h),1.375(m,10h),1.315(m,10h),1.153(m,2h),0.972(m,3h),0.587(m,3h)。

实施例9制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(boc-tyr)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(5c)

采用实施例1的方法从1.01g(3.6mmol)无色粉末的boc-tyr和1.62g(3mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-boc-lys-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(4)得到1.62g(67％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):806[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.860(s,1h),9.150(s,1h),8.052(s,1h),7.934(s,1h),7.827(m,1h),7.594(s,1h),7.567(d,j＝8.1hz1h),7.302(d,j＝8.1hz1h),7.026(m,4h),6.928(t,j＝7.2hz1h),6.732(m,2h),6.640(d,j＝8.1hz1h),4.118(m,1h),4.005(m,1h),3.814(m,1h),3.495(m,1h),3.259(dd,j1＝14.1hz,j2＝3.0hz,1h),3.028(m,3h),2.771(m,3h),2.615(m,1h),1.478(m,2h),1.372(m,10h),1.312(m,10h),1.246(m,2h),0.965(m,3h),0.578(m,3h)。

实施例10制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(phe)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(6a)

采用实施例2的方法从789mg(1mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(boc-phe)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(5a)得到483.2mg(82％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):590[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝11.014(s,1h),8.666(m,1h),8.532(m,1h),8.102(m,1h),7.947(m,1h),7.572(d,j＝7.8hz,1h),7.291(m,3h),7.262(m,3h),7.041(s,1h),7.020(t,j＝7.2hz,1h),6.924(t,j＝7.2hz,1h),4.125(m,1h),3.961(m,1h),3.673(m,1h),3.262(dd,j1＝14.4hz,j2＝3.9hz,1h),3.021(m,5h),2.788(m,2h),1.673(m,2h),1.294(m,4h),0.970(m,3h),0.554(m,3h)。

实施例11制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(trp)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(6b)

采用实施例2的方法从1.66g(2mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(boc-trp)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(5b)得到1.14g(91％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):629[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝11.067(s,1h),10.998(s,1h),8.699(m,1h),8.526(m,1h),8.263(m,2h),8.220(m,2h),8.105(s,1h),7.701(s,1h),7.688(d,j＝7.8hz,1h),7.678(d,j＝7.8hz,1h),7.338(d,j＝7.8hz,1h),7.304(d,j＝7.8hz,1h),7.023(m,1h),7.086(m,2h),7.020(s,1h),6.970(m,2h),4.122(m,1h),3.966(m,1h),3.713(m,1h),3.491(m,1h),3.288(m,1h),3.166(m,1h),3.112(m,4h),2.835(m,2h),1.682(m,2h),1.306(m,4h),1.012(m,3h),0.573(m,3h)。

实施例12制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-lys(tyr)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(6c)

采用实施例2的方法从1.36g(1.6mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-boc-lys(boc-tyr)-氨基正丁基]-2,5-二酮哌嗪(5c)得到726mg(47％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):606[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6):¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝11.003(s,1h),9.413(m,1h),8.624(m,1h),8.512(m,1h),8.200(m,2h),8.100(d,j＝1.8hz,1h),7.952(d,j＝1.8hz,1h),7.577(d,j＝7.8hz,1h),7.314(d,j＝7.8hz,1h),7.020(m,4h),6.946(t,j＝7.5hz,1h),6.710(d,j＝8.4hz,1h),4.120(m,1h),3.885(m,1h),3.694(m,1h),3.497(m,1h),3.257(dd,j1＝14.1hz,j2＝3.6hz,1h),2.999(m,4h),2.848(m,2h),1.685(m,2h),1.340(m,2h),1.306(m,2h),0.988(m,3h),0.559(m,3h)。

实施例13测定化合物6a-c的抗肿瘤转移活性

本测定模型用lewis小鼠肺癌细胞(llc,购自atcc)接种，选用dmem培养基(含10％经灭活的胎牛血清,1×10⁵u/l青霉素和100mg/l链霉素),按照贴壁细胞培养方法每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好并处于对数生长期时消化细胞，用生理盐水调整细胞密度至1×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。取近交系c57bl/6雄性小鼠(spf级,体重20±2g)，左手固定小鼠。用75％乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器往小鼠腋部皮下注射llc肿瘤细胞悬液，每只小鼠注射0.2ml。小鼠接种10天后，长出直径约4-5mm的肿瘤即为瘤源。接种10天的lewis肺癌荷瘤小鼠乙醚麻醉，脱颈椎处死。用75％乙醇浸泡10min，消毒，在超净工作台上剥离瘤体。选择生长良好的肿瘤组织在无菌平皿中剪碎，置于玻璃制造的组织匀浆器内。按瘤块重比生理盐水体积为1比3(g比ml)的比例加温度为4℃的生理盐水，轻轻研磨制成细胞悬液。细胞悬液过200目细胞筛制单细胞悬液。用生理盐水调单细胞悬液的细胞密度至1.5×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。左手固定近交系c57bl/6雄性小鼠，用75％的乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液，每只注射0.2ml。接种10天后小鼠长出直径4-5mm的肿瘤，按测得的肿瘤体积将接种小鼠随机分组。每组12只小鼠。接种肿瘤的第11天小鼠或口服公认的抗肿瘤转移肽rgds的生理盐水溶液(剂量为20μmol/kg/天)或口服化合物6a-f的生理盐水溶液(剂量为0.5μmol/kg/天)或口服生理盐水(剂量为10ml/kg/天)，每天给1次药，连续给药12天，每隔两天测量并记录肿瘤体积。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，取小鼠的肿瘤称重，取小鼠的肺并计算肿瘤肺部转移的瘤节数。用t检验对数据进行统计分析。结果见表1。在0.5μmol/kg/天(即最低有效剂量降低10倍)剂量下化合物6a-c不仅有效地抑制肿瘤肺转移，而且活性与20μmol/kg/天剂量的rgds没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表1化合物6a-c的抗肿瘤转移活性

a)与生理盐水比p<0.01,与rgds比p>0.05；b)与生理盐水比p<0.05；n＝10。