氨基酸和氨甲环酸修饰的二酮哌嗪,其制备和应用的制作方法

本发明涉及3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(aa-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪和3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪。涉及它们的制备方法,涉及它们的抗肿瘤兼抗炎作用,涉及它们在制备抗肿瘤兼抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

技术背景

近年来多项流行病学及相关研究结果已证实多种肿瘤的发生及发展与炎症有关，占所有肿瘤的15％左右，通过抑制慢性炎症，可降低癌前病变患者的癌症发病和(或)复发的风险，此前，公开了r,r-构型的二酮哌嗪在最低有效剂量为5μmol/kg/天的剂量时可抑制icr小鼠的肿瘤增殖及具有抗炎活性。为了降低最低有效剂量，发明人对r,r-构型的二酮哌嗪的丁氨基展开了各种修饰。经过3年探索，发现用氨基酸l-gly和l-gln酰化r,r-构型的二酮哌嗪的4-氨基正丁基可使抗肿瘤及抗炎的最低有效剂量降至0.5μmol/kg/天。最低有效剂量降低10倍表明，这种结构修饰有突出的技术效果。根据这些发现，发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供下面结构的3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪和3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪。

本发明的第二个内容是提供3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪和3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪的制备方法,该方法包括：

(1)d-trp-obzl与boc-d-lys(cbz)反应得到boc-d-lys(cbz)-d-trp-obzl；

(2)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4m)boc-d-lys(cbz)-d-trp-obzl脱除boc得到d-lys(cbz)-d-trp-obzl；

(3)boc-d-lys(cbz)-d-trp-obzl在弱碱性环境下自动环合生成3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)；

(4)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)经催化氢解脱除苄氧羰基得到3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)；

(5)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)与boc-氨甲环酸反应生成3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(3)；

(6)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4m)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(3)脱除boc得3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)；

(7)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)与boc-l-gly或boc-l-gln缩合得化合物3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5a)或3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5b)；

(8)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4m)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5a)或3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5b)脱除boc得3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(6a)或3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(6b)。

本发明的第三个内容是3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪和3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪对s180小鼠肿瘤生长的抑制作用及对icr小鼠抗炎作用。

附图说明

图1.3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(6a)和3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(6b)的合成路线；i)n,n-二环己基碳二亚胺(dcc),n-羟基苯并三氮唑(hobt),n-甲基吗啉(dmm),四氢呋喃(thf)；ii)4n氯化氢-乙酸乙酯试剂；iii)乙酸乙酯,5％碳酸氢钠；iv)甲醇,n,n-二甲基甲酰胺(dmf),pd/c,h2；v)n,n-二环己基碳二亚胺(dcc),n-羟基苯并三氮唑(hobt),n-甲基吗啉(dmm),无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备boc-d-lys(cbz)-d-trp-obzl

将1.930g(5mmol)boc-d-lys(cbz)混悬于100ml干燥四氢呋喃(thf)，在冰浴下依次向悬浮液中加入0.747g(5.5mmol)的1-羟基苯并三氮唑(hobt)及1.243g(6.0mmol)的n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)，然后搅拌30分钟。之后加入1.620g(5.2mmol)d-trp-obzl·hcl。反应混合物逐滴加入n-甲基吗啉(nmm)调节ph值至8-9。反应混合物先在冰浴下搅拌1h，然后在室温下搅拌反应12h。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残余物用150ml的乙酸乙酯溶解。分别用饱和5％硫酸氢钾水溶液、饱和氯化钠水溶液各萃洗三次。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，减压浓缩至干。得到黄色糖浆经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯:石油醚＝1:3～1:1)，得到2.423(73.2％)g标题化合物，为粉红色固体粉末。esi-ms(m/e):657[m+h]⁺。

实施例2制备d-lys(cbz)-d-trp-obzl

冰浴搅拌下1.9g(2.5mmol)boc-d-lys(cbz)-d-trp-obzl与40ml氯化氢的乙酸乙酯(4m)缓慢混合。得到的溶液在冰浴中搅拌3小时。之后，反应混合物减压抽干，残留物用干燥乙酸乙酯充分搅匀后抽干，重复三次。残留物再用无水乙醚磨洗三遍得到1.7g(93％)标题化合物，为深红色固体粉末。esi-ms(m/e):557[m+h]⁺。

实施例3制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)

将1.7g(3.1mmol)d-lys(cbz)-d-trp-obzl用100ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液用浓度为5％的碳酸氢钠水溶液洗三次，乙酸乙酯层减压浓缩并于室温搅拌12小时，待白色固体充分析出后过滤得0.76g(46.5％)标题化合物。esi-ms(m/e):449[m+h]⁺。

实施例4制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)

于0.900g(2mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)加入10ml甲醇与10ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，加入90mgpd/c至上述溶液中，抽尽茄瓶中的空气，通入氢气室温搅拌反应12小时。滤去pd/c，滤液减压浓缩至干得到白色固体粉末0.600(95％)标题化合物。esi-ms(m/e):315[m+h]⁺。

实施例5制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(3)

采用实施例1的方法从0.668g(2.6mmol)boc-氨甲环酸和0.813g(2.6mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)得到0.77g(53.8％)标题化合物，为淡黄色粉末。esi-ms(m/e):554[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.88(s,1h),8.05(s,1h),7.94(s,1h),7.58(d,j＝7.8hz,1h),7.50(t,j＝4.8hz,1h),7.30(d,j＝7.8hz,1h),7.03(s,1h),7.02(m,1h),6.93(t,j＝7.4hz,1h),6.81(t,j＝5.6hz,1h),4.11(m,1h),3.50(m,1h),3.25(dd,j1＝4.0hz,j2＝14.2hz,1h),3.00(dd,j1＝4.0hz,j2＝14.4hz,1h),2.76(m,4h),1.97(m,1h),1.68(m,4h),1.37(s,9h),1.27(m,3h),0.96(m,3h),0.83(m,2h),0.58(m,3h)。

实施例6制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)

按照实施例2的方法，从0.75g(1.35mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(3)得到0.65g(98.3％)标题化合物，为淡黄色固体。esi-ms(m/e):454；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.94(s,1h),8.04(s,1h),8.02(br,3h),7.94(s,1h),7.58(m,2h),7.31(d,j＝8.0hz,1h),7.04(s,1h),7.03(m,1h),6.93(t,j＝7.2hz,1h),4.11(m,1h),3.50(m,1h),3.24(dd,j1＝3.4hz,j2＝14.2hz,1h),3.02(dd,j1＝3.4hz,j2＝14.4hz,1h),2.76(m,2h),2.63(m,2h),2.02(m,1h),1.76(m,4h),1.53(m,1h),1.32(m,2h),0.97(m,5h),0.60(m,3h)。

实施例7制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5a)

按照实施例1的方法，从0.33g(2.1mmol)boc-gly和0.99g(2mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)得到0.92g(73.8％)标题化合物，为淡黄色固体粉末。esi-ms(m/e):611[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.88(s,1h),8.03(s,1h),7.93(s,1h),7.69(m,1h),7.58(d,1h,j＝7.8hz),7.50(m,1h),7.30(d,1hj＝7.8hz),7.04(s,1h),7.02(m,1h),6.93(m,2h),·4.01(m,1h),3.50(m,3h),3.25(dd,1h,j1＝4.2hz,j2＝14.4hz),3.01(dd,1h,j1＝3.8hz,j2＝14.4hz),2.91(m,2h)2.75(m,2h),1.98(m,1h),1.70(m,4h),1.38(s,9h),1.28(m,3h),0.97(m,3h),0.84(m,2h),0.60(m,3h)。

实施例8制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5b)

按照实施例1的方法，从0.56g(2.2mmol)boc-gln和0.99g(2mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)得到0.60g(43.5％)标题化合物，为白色固体粉末。esi-ms(m/e):682[m+h]⁺；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.92(s,1h),8.05(s,1h),7.94(s,1h),7.75(m,1h),7.56(m,2h),7.30(m,2h),7.04(s,1h),7.02(m,1h),6.92(m,1h),6.84(d,j＝7.8hz,1h),6.76(s,1h),4.1(m,1h),3.83(m,1h),3.49(m,1h),3.25(dd,j1＝3.5hz,j2＝14.4hz,1h),3.01(dd,j1＝3.5hz,j2＝14.6hz,1h),2.90(m,2h),2.74(m,2h),2.07(m,2h),1.96(m,1h),1.78(m,2h),1.70(m,4h),1.38(s,9h),1.26(m,3h),0.96(m,3h),0.84(m,2h),0.59(m,3h)。

实施例9制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(6a)

按照实施例2的方法，从0.099g(0.16mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-gly-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5a)得到0.082g(92.4％)标题化合物，为淡黄色粉末。esi-ms(m/e):511[m+h]⁺；＝+7.74,(c0.16,ch3oh)；ir(cm^-1):3206,3064,2928,2862,1657,1565,1454,1327,1261,1096,1010,902,742；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.94(s,1h),8.43(m,1h),8.11(s,3h),8.05(s,1h),7.94(s,1h),7.57(m,2h),7.30(d,j＝8.0hz,1h),7.04(s,1h),7.01(m,1h),6.92(m,1h),4.10(m,1h),3.54(m,1h),3.52(m,1h),3.50(m,1h),3.24(dd,j1＝3.9hz,j2＝14.3hz,1h),3.01(dd,j1＝4.6hz,j2＝14.3hz,1h),2.97(m,2h),2.75(m,2h),1.99(m,1h),1.72(m,4h),1.32(m,3h),0.94(m,5h),0.59(m,3h)。

实施例10制备3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(6b)

按照实施例2的方法，从0.116g(0.15mmol)3r-(吲哚-3-甲基)-6r-[4-(boc-gln-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5b)得到0.102g(90.2％)标题化合物，为白色粉末。esi-ms(m/e):582[m+h]⁺；＝+12.16,(c0.13,ch3oh)；ir(cm^-1):3190,3056,2928,2859,1652,1556,1452,1328,1263,1152,1095,1010,735,698；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.97(s,1h),8.64(m,1h),8.35(s,3h),8.07(s,1h),7.95(s,1h),7.58(m,3h),7.30(d,j＝7.8hz,1h),7.03(s,1h),7.02(m,1h),6.92(m,2h),4.10(m,1h),3.79(m,1h),3.48(m,1h),3.23(dd,j1＝4.0hz,j2＝14.4hz,1h),2.99(m,3h),2.74(m,2h),2.18(m,2h),1.97(m,3h),1.71(m,4h),1.33(m,3h),0.93(m,5h),0.57(m,3h)。

实验例1评价化合物6a,b的抗肿瘤活性

1)化合物6a,b用生理盐水溶解,阿霉素用生理盐水溶解作为阳性对照,生理盐水作为阴性对照；

2)化合物6a,b的口服剂量为0.5μmol/kg，生理盐水的口服剂量为0.2ml/20g，阿霉素腹腔注射剂量为2μmol/kg。肿瘤接种5天后开始给药，连续给药10天，共给药10次。

3)实验动物为icr雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)瘤源为小鼠s180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)无菌条件下抽取接种生长旺盛的s180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞。按细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml计算细胞浓度。按细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞存活率。

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/ml的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2ml/只，制造s180荷瘤小鼠。肿瘤接种5天后给药。治疗组小鼠每日口服化合物6a,b剂量为0.5μmol/kg。空白组小鼠每日口服生理盐水剂量为0.2ml/20g。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素剂量为2μmol/kg。连续给药十天，第十一天称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以(均值±sdg)表示。结果见表1。由表1可以看出，在0.5μmol/kg口服剂量下，化合物6a,b可有效地抑制小鼠的瘤重生长。本发明有显著的技术效果。

表1化合物6a,b的抗肿瘤活性

a)与生理盐水组比p<0.05；n＝12.

实验例2评价化合物6a-b的抗炎活性

1)化合物6a,b用生理盐水溶解；阿司匹林用生理盐水溶解作为阳性对照；生理盐水作为阴性对照。

2)化合物6a,b的口服剂量为0.5μmol/kg，生理盐水的口服剂量为0.2ml/20g，阿司匹林口服剂量为1.11mmol/kg。均为每日单次给药。

3)实验动物为icr雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)icr雄性小鼠静息一天后，随机分组，每组12只。采用序贯法按照药物相应剂量对各组小鼠灌胃给药。给药30分钟后按照给药顺序用移液枪在小鼠右耳外廓均匀涂抹30μl二甲苯，使造模完成。涂完二甲苯后，可观察到小鼠右耳变为红色，然后变白变厚。造模2小时后将小鼠摘眼球取血并断颈处死，将小鼠左右两耳沿耳根剪下，让两耳重合叠放，用直径为7mm的电动打孔器在两耳的相同位置打孔，取圆形耳片，分别称取重量，按以下公式计算耳肿胀度：

耳肿胀度＝右耳原片重量-左耳原片重量

实验数据采用t检验和方差分析。结果见表2。由表2可以看出，在0.5μmol/kg口服剂量下，化合物6a,b具有显著的抗炎活性。本发明有显著的技术效果。

表2化合物6a,b的抗炎活性

a)与生理盐水组比p<0.05；b)与生理盐水组比p<0.01；n＝12。