结核分枝杆菌38KD蛋白DNA提取、重组载体构建表达方法与流程

本发明涉及结核分枝杆菌38kd蛋白dna提取、重组载体构建、蛋白表达等原核功能表达方法及相应设备器材.属于病原菌蛋白dna提取、重组载体构建、蛋白原核功能表达的技术领域。

背景技术

谈到结核，大家就闻之色变，这是为什么，首先来看一组数据。从世界卫生组织公布的情况来看，结核病已成为威胁人类健康的最严重疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一，我国约有5.5亿的人感染结核。由此可见，探寻结核病的感染机制尤为重要。结核分枝杆菌是结核病的病原菌，其为胞内寄生菌。当结核分支杆菌感染机体后，其疾病的发生、发展与机体的免疫应答状态有关。在此过程中，抗原提呈细胞起到了重要作用，它可通过识别结核分枝杆菌的多种成份，将抗原信息递呈给初始t细胞，引起以细胞免疫为主的抗结核免疫反应。而树突状细胞作为功能最强、唯一能激活初始t细胞的专职抗原提呈细胞作用尤为重要，已引起科学家的广泛关注。已有研究显示，mtb的抗原成分可通过影响树突状细胞的功能来调节机体的抗结核免疫反应。有趣的是：如rv0315蛋白可促进树突状细胞的成熟而诱导抗结核免疫反应。manlam成分则可抑制树突状细胞的成熟而抑制抗结核免疫反应，使得mtb在体内长期存活。由于结核分枝杆菌成分的复杂性，其有众多的蛋白抗原，每种蛋白对树突状细胞的影响不同，38kd蛋白作为其中一种重要的蛋白成分，可引起机体的免疫反应！但未见到38kd蛋白和树突状细胞的相关研究报道；对树突状细胞会有什么影响，我们了解一下38kd蛋白。

38kd蛋白是mtb复合群特异性膜脂蛋白，有7个抗原表位包括t细胞抗原决定簇，可引起机体的免疫应答。haslov等通过比较5种结核分枝杆菌抗原，发现38kd蛋白的免疫学活性最强，诱导机体产生抗体及t淋巴细胞反应，分泌ifn-β。38kd蛋白作为mtb的一种主要免疫原，在结核分枝杆菌感染人体过程中，它起到什么作用，38kd蛋白对树突状细胞有什么影响，使树突状细胞分泌哪些免疫分子，这些免疫分子的作用又是什么，均需要作更深入的研究。

技术实现要素：

本发明的发明目的是提供一种结核分枝杆菌38kd蛋白dna提取方法、重组载体构建方法、蛋白表达方法。38kd蛋白能促进树突状细胞成熟或者特异性表达免疫分子或因子，将可以为结核病的早期诊断、早期治疗、预防以及疫苗研究提供新路径。另外38kd蛋白具有人和鼠的t细胞表位，mtb潜伏感染过程中重要的靶抗原，其也有可能成为新型结核病疫苗。为后续抗mtb感染机制的研究提供理论基础。

本发明是这样实现的:

材料和方法

1.1材料：菌株e.colidh5α、e.colibl21(de3),质粒pet28a由本实验室保存。结核分枝杆菌h37rv临床株由遵义医学院附属医院呼吸科提供。pcr预混液、extaq连接酶购自takara公司。dna小量质粒提取试剂盒、dna提取试剂盒、ecl显色液、溶菌酶等购自碧云天生物科技有限公司。限制性内切酶(bamhⅰ、hindⅲ)、pcｒ引物(primer1:38kd上游引导物5’-cgcggatccattcgtttgcatacgct，（下划线部分为bamhi酶切位点）primer2:38kd下游引导物5'-cccaagcttctagctggaaatcgtcgc，(下划线为hind酶切位点)经过pag纯化，每管od值为1)合成由invitrogen公司完成。dna测序由华大公司完成。dna回收和纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司。dna回收和纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司。镍柱纯化试剂盒购自promega公司。pcr引物合成由invitorgen公司完成，dan测序由北京华大公司完成。考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液购自solarbio公司。镍柱纯化试剂盒购自promega公司。

1.2方法

1.2.138kd蛋白cdna的扩增与鉴定

mtb基因组dna提取：采用碱裂解法提取h37rv基因组dna，具体操作见碧云天dna提取试剂盒说明书进行。以提取的mtb-dna为模板，用mtb-38kdprimer1和primer2为引物（5'端分别引入限制性内切酶bamhi和hind酶切位点），38kd上游引导物5’-cgcggatccattcgtttgcatacgct，（下划线部分为bamhi酶切位点）primer2:38kd下游引导物5'-cccaagcttctagctggaaatcgtcgc，(下划线为hind酶切位点)经过pag纯化，每管od值为1)，用提取的目的基因为模板对目的片段进行pcr扩增。扩增条件:95℃预变性5min，95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸50s，共30个循环。pcr反应体系体积为50μl，以2μl的h37rv基因组dna为模板，pcr扩增条件为：95℃预变性5min后，95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环后，再于72℃延伸10min结束扩增，pcr产物用纯化试剂盒进行纯化。取扩增产物3μl于20g/l琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像分析系统观察记录结果。结果详见图1。

1.2.2mtb38kd原核表达载体的构建

用bamhⅰ和hindⅲ双酶切质粒pet28a和纯化后的pcｒ产物，分别纯化后将pcｒ产物与质粒载体pet28a混合，t4连接酶进行连接，构建含有目的基因的重组质粒pet28a-38kd，用cacl2法转化宿主菌e．colidh5α。以碱裂解法从阳性克隆提取质粒，进行双酶切鉴定并送测序。

1.2．.3mtb38kd蛋白的表达与鉴定

将构建好的重组质粒pet28a-38kd转化到宿主菌bl21(de3)中，挑单克隆接种于含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃振荡培养过夜(a=0．4～0．6)后，取100μl培养菌接种于100ml含50μg/ml卡那霉素的lb培养基，于37℃振荡培养过夜(a=0．4～0．6)后，加入iptg(终浓度为1mmol/l)诱导表达4h。以转化空质粒pet28a的细菌为对照。收集菌体，冰浴超声破碎，4℃，5000r/min，离心15min后分别收集上清和沉淀进行120g/lsds-page，考马斯亮蓝ｒ-250染色显示蛋白条带，通过扫描观察结果。

1.2.438kd蛋白的纯化将诱导的100ml菌液离心后，菌体用4mltris-hcl缓冲液重悬后超声裂解，12000r/min，离心30min，分别取上清和沉淀进行120g/lsds-page，结果提示大部分蛋白存在于上清中，故收集上清，用镍柱纯化试剂盒进行蛋白纯化，具体操作按promega镍柱纯化试剂盒(v1320)说明书进行。取少量纯化后蛋白进行sds-page鉴定，纯化后蛋白通过滤器除菌，并进行浓度检测，具体操作按碧云天bca测定试剂盒进行。最后得到纯化后的表达蛋白。

2结果

1mtb38kd蛋白的克隆与构建鉴定以h37ｒv基因组dna为模板，经pcｒ扩增38kd基因片段，扩增产物经20g/l琼脂糖凝胶电泳，可见1条大小约为1000bp左右处出现目的条带。

1:pcｒ产物;m:1000bpdnamarker．

图1pcｒ产物琼脂糖凝胶电泳分析

将此pcｒ产物连接到pet28a质粒中，经过酶切，连接和转化，获得重组质粒pet28a-38kd，经bamhⅰ和hindⅲ双酶切鉴定，获得的插入片段大小与预期结果一致，20g/l琼脂糖凝胶电泳结果发现在1000bp处出现有明显目的条带(图2)。

dna测序结果显示hsp16．3编码区序列与理论序列一致且读码框正确，表明重组质粒pet28a-38kd构建成功（图3）。

本发明的意义：

本发明在此基础上进一步探讨38kd蛋白可能的生物学效应。首先根据genbank中mtb38kd序列设计特异性引物，以临床分离株h37ｒv为模板，克隆38kd编码区基因序列，构建pet28a-38kd重组载体，经双酶切、pcｒ及dna序列分析证实克隆构建成功。表达蛋白经sds-page及westernblot分析结果显示，可见mr约为1000bp的阳性融合蛋白的表达。38kd蛋白具有人和鼠的t细胞表位，是mtb潜伏感染过程中重要的靶抗原，其也有可能成为新型结核病疫苗。

附图说明

图1为本发明所述的经pcｒ扩增38kd基因片段，扩增产物凝胶成像条带图。

图2为本发明所述的重组质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳凝胶成像条带图。

图3为本发明所述的dna基因克隆测序图。

具体实施方式

本发明所述的结核分枝杆菌38kd蛋白dna提取、重组载体构建、蛋白表达方法，再说明如下：

步骤及方法

1、38kd蛋白cdna的扩增与鉴定

mtb基因组dna提取：采用碱裂解法提取h37rv基因组dna，具体操作见碧云天dna提取试剂盒说明书进行。以提取的mtb-dna为模板，用mtb-38kdprimer1和primer2为引物（5'端分别引入限制性内切酶bamhi和hind酶切位点），38kd上游引导物5’-cgcggatccattcgtttgcatacgct，（下划线部分为bamhi酶切位点）primer2:38kd下游引导物5'-cccaagcttctagctggaaatcgtcgc，(下划线为hind酶切位点)经过pag纯化，每管od值为1)，用提取的目的基因为模板对目的片段进行pcr扩增。扩增条件:95℃预变性5min，95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸50s，共30个循环。pcr反应体系体积为50μl，以2μl的h37rv基因组dna为模板，pcr扩增条件为：95℃预变性5min后，95℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环后，再于72℃延伸10min结束扩增，pcr产物用纯化试剂盒进行纯化。取扩增产物3μl于20g/l琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像分析系统观察记录结果。结果详见图1。

2、mtb38kd原核表达载体的构建

用bamhⅰ和hindⅲ双酶切质粒pet28a和纯化后的pcｒ产物，分别纯化后将pcｒ产物与质粒载体pet28a混合，t4连接酶进行连接，构建含有目的基因的重组质粒pet28a-38kd，用cacl2法转化宿主菌e．colidh5α。以碱裂解法从阳性克隆提取质粒，进行双酶切鉴定并送测序。

3、mtb38kd蛋白的表达与鉴定

将构建好的重组质粒pet28a-38kd转化到宿主菌bl21(de3)中，挑单克隆接种于含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，于37℃振荡培养过夜(a=0．4～0．6)后，取100μl培养菌接种于100ml含50μg/ml卡那霉素的lb培养基，于37℃振荡培养过夜(a=0．4～0．6)后，加入iptg(终浓度为1mmol/l)诱导表达4h。以转化空质粒pet28a的细菌为对照。收集菌体，冰浴超声破碎，4℃，5000r/min，离心15min后分别收集上清和沉淀进行120g/lsds-page，考马斯亮蓝ｒ-250染色显示蛋白条带，通过扫描观察结果。

4、38kd蛋白的纯化将诱导的100ml菌液离心后，菌体用4mltris-hcl缓冲液重悬后超声裂解，12000r/min，离心30min，分别取上清和沉淀进行120g/lsds-page，结果提示大部分蛋白存在于上清中，故收集上清，用镍柱纯化试剂盒进行蛋白纯化，具体操作按promega镍柱纯化试剂盒(v1320)说明书进行。取少量纯化后蛋白进行sds-page鉴定，纯化后蛋白通过滤器除菌，并进行浓度检测，具体操作按碧云天bca测定试剂盒进行。最后得到纯化后的表达蛋白。

结果

1mtb38kd蛋白的克隆与构建鉴定以h37ｒv基因组dna为模板，经pcｒ扩增38kd基因片段，扩增产物经20g/l琼脂糖凝胶电泳，可见1条大小约为1000bp左右处出现目的条带。

1:pcｒ产物;m:1000bpdnamarker．

图1pcｒ产物琼脂糖凝胶电泳分析

将此pcｒ产物连接到pet28a质粒中，经过酶切，连接和转化，获得重组质粒pet28a-38kd，经bamhⅰ和hindⅲ双酶切鉴定，获得的插入片段大小与预期结果一致，20g/l琼脂糖凝胶电泳结果发现在1000bp处出现有明显目的条带(图2)。

dna测序结果显示hsp16．3编码区序列与理论序列一致且读码框正确，表明重组质粒pet28a-38kd构建成功（图3）。