一种抗原多肽和包含该抗原多肽的试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术检测技术领域，具体涉及一种抗原多肽和包含该抗原多肽的试剂盒。

背景技术

血清4型禽腺病毒(fadv-4)属于禽腺病毒属，近年来，国内鸡群由fadv-4引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。fadv-4不仅感染3～7周龄肉鸡，还感染10～20周龄的蛋鸡，给养鸡业造成了巨大的经济损失。由于灭活疫苗的研制及应用，今后如何来鉴别鸡群是自然感染还是处于免疫状态，对fadv-4有效及时防控至关重要。病毒的非结构蛋白一般只在病毒感染的细胞中表达，而在全整的成熟病毒颗粒中是不存在的。因此，在活病毒感染机体后，由于可产生非结构蛋白，一般能诱导机体产生针对非结构蛋白的特异性抗体；而病毒灭活疫苗中由于不存在非结构蛋白，免疫机体后一般也不产生针对非结构蛋白的抗体。所以针对某些非结构蛋白抗体的检测能够鉴别鸡群是自然感染还是处于灭活疫苗免疫状态。虽然国内外有学者利用血清1型禽腺病毒(fadv-1)的非结构蛋白33k和100k，建立了可区分fadv-1自然感染和灭活疫苗接种鸡群的elisa方法，但目前尚无基于非结构蛋白检测fadv-4的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗原多肽，能够检测血清中的非结构蛋白22k抗体，进而能够检测fadv-4病毒感染。

本发明提供了一种抗原多肽，所述抗原多肽具有seqidno.1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述抗原多肽、辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg、洗涤液、阳性对照、阴性对照、稀释液、封闭液和硫酸溶液。

优选的，所述洗涤液包括pbs缓冲液和吐温-20，所述pbs缓冲液的ph值为7.4，所述pbs缓冲液与吐温-20的体积比为(900～1100):(0.4～0.6)。

优选的，所述稀释液包括pbs缓冲液、吐温-20和牛血清白蛋白，所述pbs缓冲液的ph值为7.4，所述pbs缓冲液的体积与吐温-20的体积、牛血清白蛋白的质量比为(900～1100)ml:(0.4～0.6)ml:(15～25)g。

优选的，所述封闭液包括pbs缓冲液和牛血清白蛋白，所述pbs缓冲液的ph值为7.4，所述pbs缓冲液与牛血清白蛋白的质量比为(90～110)ml:(1～3)g。

优选的，所述硫酸溶液的浓度为1～3mol/l。

优选的，所述阳性对照包括抗fadv-4病毒的禽类的血清。

优选的，所述阴性对照包括spf禽类血清。

本发明提供了一种抗原多肽，本发明以fadv-4的非结构蛋白中的22k为靶点，合成所述抗原多肽，通过检测fadv-4中的非结构蛋白22k蛋白抗体来检测fadv-4感染。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的抗原多肽能够检测血清中的非结构蛋白22k抗体，进而能够检测fadv-4病毒的感染，而且能够区别自然感染以及灭活疫苗免疫鸡群。

附图说明

图1基于非结构蛋白22k的不同多肽反应性；

图2试剂盒特异性检测。

具体实施方式

本发明提供了一种抗原多肽，所述抗原多肽具有seqidno.1所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：

agedkenspptippkrsrnassv。

本发明通过dnastar对非结构蛋白22k氨基酸的序列的亲水性、抗原性及二级结构进行了分析，合成所述抗原多肽。在本发明中，所述抗原多肽中包含了22k蛋白的b细胞优势表位。在本发明中，所述抗原多肽优选由上海杰肽生物技术有限公司合成。

本发明还提供了试剂盒，包括上述技术方案所述抗原多肽、辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg、洗涤液、阳性对照、阴性对照、稀释液、封闭液和硫酸溶液。

在本发明中，所述洗涤液优选包括pbs缓冲液和吐温-20，所述pbs缓冲液的ph值优选为7.4。本发明对所述所述pbs缓冲液的配制方法没有特殊限定，采用常规配制ph值为7.4的pbs缓冲液即可。在本发明中，所述pbs缓冲液与吐温-20的体积比优选为(900～1100):(0.4～0.6)，更优选为(950～1050):(0.45～0.55)，最优选为1000:0.5。

在本发明中，所述稀释液优选包括pbs缓冲液、吐温-20和牛血清白蛋白，所述pbs缓冲液的ph值优选为7.4。本发明对所述所述pbs缓冲液的配制方法没有特殊限定，采用常规配制ph值为7.4的pbs缓冲液即可。在本发明中，所述pbs缓冲液的体积与吐温-20的体积、牛血清白蛋白的质量比优选为(900～1100)ml:(0.4～0.6)ml:(15～25)g，更优选为(950～1050)ml:(0.45～0.55)ml:(18～22)g，最优选为1000ml:0.5ml:20g。

在本发明中，所述封闭液优选包括pbs缓冲液和牛血清白蛋白，所述pbs缓冲液的体积与牛血清白蛋白的质量比优选为(90～110)ml:(1～3)g，更优选为(95～105)ml:(1.5～2.5)g，最优选为100ml:2g。

在本发明中，所述水优选为去离子水。

在本发明中，所述硫酸溶液的浓度优选为1～3mol/l，更优选为1.5～2.5mol/l，最优选为2mol/l。

在本发明中，所述阳性对照优选包括抗fadv-4病毒的禽类血清，本发明对制备抗fadv-4病毒的禽类血清的方法没有特殊限定，采用常规制备血清的方法即可。

在本发明中，所述阴性对照优选包括spf禽类血清，本发明对制备spf禽类血清的方法没有特殊限定，采用常规制备血清的方法即可。

本发明对所述抗原多肽、辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg、洗涤液、阳性对照、阴性对照、稀释液、封闭液和硫酸溶液在试剂盒中放置的量没有特殊限定，采用本领域技术人员常规在试剂盒中放置试剂的量即可。

在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：

1)将上述技术方案所述的抗原多肽经稀释液稀释后，得到抗原多肽溶液，将所述抗原多肽溶液包被固体载体12～14h，得到包被后的固体载体；

2)将所述步骤1)得到的包被后的固体载体在35～42℃下水浴40～50min，经洗涤液洗涤后，得到水浴后的固体载体，向所述水浴后的固体载体中加入封闭液封闭0.5～1.5h，经洗涤液洗涤后，得到封闭后的固体载体；

3)将阳性对照、阴性对照和样品分别用稀释液稀释后加入封闭后的固体载体中，在35～42℃下孵育0.5～1.5h，经洗涤液洗涤后，得到孵育后的固体载体；

4)将辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg经稀释液稀释后得到酶标溶液，将所述酶标溶液加入所述步骤3)得到的孵育后的固体载体中，在35～42℃下孵育0.5～1.5h，得到酶标后的固体载体；

5)将显色液加入所述步骤4)得到的酶标后的固体载体中，在35～42℃下反应5～15min后，加入硫酸溶液，在450nm波长下检测吸光度值，当吸光度值od450≥0.1668时，所述样品中含有非结构蛋白52k抗体。

在本发明中，所述固体载体优选为酶标板。

本发明将所述抗原多肽经稀释液稀释后，得到抗原多肽溶液，将所述抗原多肽溶液包被固体载体12～14h，得到包被后的固体载体。

在本发明中，所述固体载体的每孔中加入抗原多肽溶液的量优选为90～110μl，更优选为100μl。

在本发明中，所述抗原多肽溶液的浓度优选为4～6μg/ml，更优选为5μg/ml。

在本发明中，所述包被的温度优选为4℃。在本发明中，所述包被的时间为12～14h，优选为13h。

本发明将包被后的固体载体在35～42℃下水浴40～50min，经洗涤液洗涤后，得到水浴后的固体载体，向所述水浴后的固体载体中加入封闭液封闭0.5～1.5h，经洗涤液洗涤后，得到封闭后的固体载体。

在本发明中，包被后的固体载体在35～42℃下水浴40～50min，优选为在37℃下水浴45min。

在本发明中，所述水浴后的载体的每孔加入封闭液的量优选为350～370μl，更优选为360μl。

在本发明中，所述封闭的时间为0.5～1.5h，优选为1h。

本发明将阳性对照、阴性对照和样品分别用稀释液稀释后加入封闭后的固体载体中，在35～42℃下孵育0.5～1.5h，经洗涤液洗涤后，得到孵育后的固体载体。

在本发明中，所述阳性对照、阴性对照和样品稀释的倍数独立的优选为350～450倍，更优选为400倍。

在本发明中，所述阳性对照、阴性对照和样品经稀释后得到的溶液加入封闭后的固体载体的每孔的量优选为100μl。

本发明将辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg经稀释液稀释后得到酶标溶液，将所述酶标溶液加入所述步骤3)得到的孵育后的固体载体中，在35～42℃下孵育0.5～1.5h，得到酶标后的固体载体。

在本发明中，所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg稀释的倍数优选为15000倍。

在本发明中，所述孵育后的固体载体的每孔加入酶标溶液的量优选为90～110μl，更优选为100μl。本发明在孵育后的固体载体中加入酶标溶液后在35～42℃下反应5～15min，优选在37℃下反应10min。

在本发明中，硫酸溶液在酶标后的固体载体中加入的量优选为50μl。

本发明对上述各个步骤洗涤的次数和方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规洗涤的次数和方法即可。

在本发明中，所述显色液优选包括tmb显色液。在本发明中，所述酶标后的固体载体的每孔中加入显色液的量优选为100μl。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种抗原多肽和包含该抗原多肽的试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

检测fadv-4中非结构蛋白22k抗体的步骤包括：

1)包被：抗原多肽用稀释液稀释至5μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜(12-14h)，释液的组分包括pbs缓冲液、吐温-20和牛血清白蛋白，pbs缓冲液的ph值为7.4，pbs缓冲液的体积与吐温-20的体积、牛血清白蛋白的质量比为1100ml:0.5ml:20g；

2)封闭：第二天将酶标板放置37℃恒温水浴锅回温45min，洗涤液洗2遍拍干，每孔加入360μl封闭液封闭1h，洗涤液的组分包括pbs缓冲液和吐温-20，pbs缓冲液的ph值为7.4，pbs缓冲液与吐温-20的体积比为1000:0.5，封闭液的组分包括pbs缓冲液和牛血清白蛋白，pbs缓冲液的体积与牛血清白蛋白的质量比为100ml:2g；

3)洗涤液洗2遍拍干，阳性对照、阴性对照和待检血清分别1:400稀释后，每孔加100μl，37℃孵育1h；

4)洗涤液洗3遍拍干，辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg1:15000稀释后，每孔加100μl，37℃孵育1h；

5)洗涤液洗3遍拍干，每孔加100μltmb显色液，37℃孵育10min；

6)每孔加50μl2mh2so4溶液终止反应；

7)酶标仪测定各孔在450nm波长的吸光值；

8)计算结果，根据临界值od≧0.1668确定待检血清中含有非结构蛋白22k抗体，进而确定fadv-4病毒的感染。

实施例2

利用生物软件分析对fadv-4非结构蛋白22k的氨基酸序列，抗原性较好的氨基酸序列，进行常规抗原多肽合成，多肽抗原包被酶标板，制备用于特异性检测基于非结构蛋白22k的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒，检测步骤同实施例1，检测结果图1所示。从图1中可以看出，fadv-4病毒非结构蛋白22k的抗原多肽(即22k-4p)短肽与人工感染鸡阳性血清反应性最佳。

实施例3

采用与实施例1相同的检测步骤检测fadv-4中的非结构蛋白22k抗体、抗鸡贫血病毒血清(cav)、抗血清8型禽腺病毒血清(fadv-8)、抗禽网状内皮组织增生症病毒(rev)、抗传染性支气管炎病毒血清(ibv)、抗马立克氏病病毒血清(mdv)、抗新城疫病毒血清(ndv)、抗禽流感病毒血清(aiv)以及spf鸡血清，考察抗原多肽的特异性，结果见图2。

从图2中可以得出，本发明提供的抗原多肽能特异性的检测出fadv-4中的非结构蛋白22k抗体，而与抗鸡贫血病毒血清(cav)、抗血清8型禽腺病毒血清(fadv-8)、抗禽网状内皮组织增生症病毒(rev)、抗传染性支气管炎病毒血清(ibv)、抗马立克氏病病毒血清(mdv)、抗新城疫病毒血清(ndv)、抗禽流感病毒血清(aiv)以及spf鸡血清不反应，表明抗原多肽具有良好的特异性。

将fadv-4阳性血清分别做1:400、1:800、1:1600、1:3200倍稀释，检测方法同实施例1，读取od450值，结果见表1。

表1敏感性试验

从表1中可以得出，当阳性血清稀释度为1:400～1:3200时，通过酶标仪检测，od450值均大于0.1668，为阳性。

实施例4

(1)检测fadv-4人工感染鸡群血清样品

本实施例中，抗原多肽对fadv-4人工感染鸡群血清样品进行了检测，与基于结构蛋白fiber2的检测fadv-4抗体的elisa以及间接免疫荧光(ifa)方法进行了比较，结果见表2。

表2抗原多肽、f2-elisa、ifa检测人工感染鸡群结果的比较

从表2中可以得出，抗原多肽与f2-elisa以及ifa的阳性符合率均为100％。

(2)检测临床发病鸡群血清样品

本实施例中，抗原多肽对临床发病鸡群血清样品进行了检测，检测方法同实施例1，与基于结构蛋白fiber2的检测fadv-4抗体的elisa以及ifa方法进行了比较，结果见表3。

表3抗原多肽、f2-elisa和ifa检测临床发病鸡群结果的比较

从表3中可以得出，抗原多肽与f2-elisa的阳性符合率为99.4％，与ifa的阳性符合率为97.5％。

(3)检测灭活疫苗免疫鸡群血清样品

将抗原多肽对灭活疫苗免疫鸡群血清样品进行了检测，检测方法同实施例1，并与基于结构蛋白fiber2的检测fadv-4抗体的elisa方法进行了比较，结果见表4和5。

表4抗原多肽检测灭活疫苗免疫鸡群血清结果

表5f2-elisa检测灭活疫苗免疫鸡群血清结果

从表4和5中可以得出，抗原多肽的阳性检出率为2.5％(od为弱阳性值)。基于结构蛋白fiber2的检测fadv-4抗体的elisa阳性率为100％。灭活疫苗免疫鸡群中能产生针对结构蛋白的抗体，而不产生针对非结构蛋白22k的抗体；抗原多肽几乎不能检测出灭活疫苗免疫鸡群中的抗体，而基于结构蛋白的f2-elisa能检测出其中的抗体。因此，抗原多肽能用来区别自然感染以及灭活疫苗免疫鸡群，基于结构蛋白的f2-elisa则不能区别自然感染以及灭活疫苗免疫鸡群。

由以上实施例可以得出，本发明提供的抗原多肽能够检测血清中的非结构蛋白22k抗体，进而能够检测fadv-4病毒的感染，而且能够区别自然感染以及灭活疫苗免疫鸡群。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种抗原多肽和包含该抗原多肽的试剂盒

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

alaglygluasplysgluasnserproprothrileproprolysarg

151015

serargasnalaserserval

20