本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物及其制备方法与应用。
背景技术：
l-亮氨酸取代马来酰亚胺，化学结构式如下：
目前，1,3-偶极环加成反应以其良好的区域和主体选择性而成为合成五元杂环化合物最主要的方法，也是杂环药物化学研究中较为活跃的一类反应。三氮唑分子结构中具有芳香性和丰富的电子，可通过形成氢键与生物体内酶和受体相互作用，具有多种生物活性。近几年来，由于哒嗪酮类化合物因其特有的生理活性而成为药物学界研究的热点，有很强的抑制癌细胞扩散、抗菌、抗病毒、降血脂以及良好的降血糖、促进代谢等作用。所以，无论是从药理学还是从合成角度考虑，这类杂环化合物都有很高的合成价值。
吡唑衍生物作为一类有用的中间体以及它们本身所显示出来的多种药物活性而受到人们的广泛关注，为了更好地研究不同杂环在同一分子中聚集而对药理活性所产生的影响，合成不同基团修饰的吡唑衍生物仍然是科研人员热衷的研究课题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物及其制备方法，制备l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物。
为了实现上述目的，本发明技术方案如下：
一种l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物，所述l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物的化学结构式如下：
其中：
r＝(s)-ch2ch(ch3)2。
本发明还提出了一种l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物的制备方法，所述制备方法包括：
步骤1、将1,2,4-三氮唑溶解于乙醇溶剂中，再加入氢氧化钾，常温下超声0.5～1小时，减压蒸馏除去乙醇后加入dmso，将1-芳基-3-甲基-4-甲酰基吡唑分批加入，50℃～60℃超声2～3小时,tlc检测待原料反应完后，将混合物倒入冰水中，析出淡黄色固体，抽滤，固体物质烘干后，乙醇-水重结晶得第一化合物1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑；
步骤2、取6-氧-1,6-二氢哒嗪-3-碳酸肼加入盛有乙醇的烧瓶中，沸水浴回流搅拌至溶解，然后缓慢滴加入溶有1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑的无水乙醇溶液，继续沸水浴回流搅拌1～2小时，滴加盐酸，有淡黄色沉淀出现，连续沸水浴回流搅拌5～7小时，停止水浴，加入蒸馏水搅拌，淡黄色沉淀颜色变深，抽滤得黄红色针状产物，用无水乙醚冲洗多次，乙醇重结晶并真空干燥得第二化合物；
步骤3、将顺丁烯二酸酐和l-亮氨酸加入经过分子筛干燥的dmf溶剂中，搅拌回流8～10小时，冷却至室温后加入乙酸乙酯稀释，饱和氯化铵溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤后有机相减压蒸馏旋干，用乙酸乙酯重结晶得l-亮氨酸取代马来酰亚胺；
步骤4、将l-亮氨酸取代马来酰亚胺和第二化合物溶于乙醇中，再加入氯胺t，回流7～8小时，tlc检测反应完成后，得到淡黄色沉淀，减压过滤出沉淀，沉淀用甲醇重结晶，真空干燥后得到含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物。
进一步地，所述1,2,4-三氮唑与1-芳基-3-甲基-4-甲酰基吡唑物质的量之比为7:5。
进一步地，所述1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑与6-氧-1,6-二氢哒嗪-3-碳酸肼物质的量之比为2:3。
进一步地，所述顺丁烯二酸酐和l-亮氨酸物质的量之比为1:1。
进一步地，所述第二化合物、l-亮氨酸取代马来酰亚胺、氯胺t物质的量之比为10:11:12。
本发明还提出了一种l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物在抗肿瘤药物方面的应用，具有较强的肿瘤细胞抑制效果。
本发明提出的一种l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物及其制备方法，首先合成1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑，然后采用1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑与6-氧-1,6-二氢哒嗪-3-碳酸肼脱水反应生成席夫碱腙的方法，再制备l-亮氨酸取代马来酰亚胺，用1,3-偶极环加成方法在l-亮氨酸取代马来酰亚胺结构中引入吡唑环，从而合成一个同时含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)结构与哒嗪酮结构的吡唑类l-亮氨酸取代的马来酰亚胺衍生物。本发明制备的含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物，具有较强的肿瘤细胞抑制效果，为其进一步的医药领域应用提供了基础。
附图说明
图1为本发明制备方法流程图；；
图2为本发明第一化合物与第二化合物的制备过程示意图；
图3为本发明l-亮氨酸取代马来酰亚胺制备化学结构式示意图；
图4为本发明含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基取代的l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物制备化学结构式示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以下实施例不构成对本发明的限定。
吡唑衍生物作为一类有用的中间体以及它们本身所显示出来的多种药物活性而受到人们的广泛关注。为了更好地研究不同杂环在同一分子中聚集而对药理活性所产生的影响，本发明通过偶极环加成反应合成了具有生物活性的同时含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)结构与哒嗪酮结构的吡唑类l-亮氨酸取代的马来酰亚胺衍生物，也称为含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代的马来酰亚胺衍生物，在本实施例中也简称为l-亮氨酸取代的马来酰亚胺衍生物。
本发明提供了一种l-亮氨酸取代的马来酰亚胺衍生物，其化学结构式如下：
其中：
r＝(s)-ch2ch(ch3)2。
如图1所示，本发明一种l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤s1、将1,2,4-三氮唑溶解于乙醇溶剂中，再加入氢氧化钾，常温下超声0.5～1小时，减压蒸馏除去乙醇后加入dmso，将1-芳基-3-甲基-4-甲酰基吡唑分批加入，50℃～60℃超声2～3小时,tlc检测待原料反应完后，将混合物倒入冰水中，析出淡黄色固体，抽滤，固体物质烘干后，乙醇-水重结晶得第一化合物1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑；
步骤s2、取6-氧-1,6-二氢哒嗪-3-碳酸肼加入盛有乙醇的烧瓶中，沸水浴回流搅拌至溶解，然后缓慢滴加入溶有1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑的无水乙醇溶液，继续沸水浴回流搅拌1～2小时，滴加盐酸，有淡黄色沉淀出现，连续沸水浴回流搅拌5～7小时，停止水浴，加入蒸馏水搅拌，淡黄色沉淀颜色变深，抽滤得黄红色针状产物，用无水乙醚冲洗多次，乙醇重结晶并真空干燥得第二化合物；
步骤s3、将顺丁烯二酸酐和l-亮氨酸加入经过分子筛干燥的dmf溶剂中，搅拌回流8～10小时，冷却至室温后加入乙酸乙酯稀释，饱和氯化铵溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤后有机相减压蒸馏旋干，用乙酸乙酯重结晶得l-亮氨酸取代马来酰亚胺；
步骤s4、将l-亮氨酸取代马来酰亚胺和第二化合物溶于乙醇中，再加入氯胺t，回流7～8小时，tlc检测反应完成后，得到淡黄色沉淀，减压过滤出沉淀，沉淀用甲醇重结晶，真空干燥后得到含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物。
以下通过具体的实施例来详细阐述该制备方法：
实施例1、
将21mmol的1,2,4-三氮唑溶解于50ml的乙醇溶剂中，再将25mmol氢氧化钾加入，常温25℃下超声半小时，减压蒸馏除去乙醇后加入40mldmso(二甲基亚砜)，将15mmol1-芳基-3-甲基-4-甲酰基吡唑分批加入，50℃超声2h,tlc检测待原料反应完后，将混合物倒入200ml冰水中，析出淡黄色固体，抽滤；固体物质烘干后，乙醇-水重结晶得第一化合物1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑。
其中，超声是指在超声波条件下反应，在化工技术领域，超声的应用也已经比较成熟，这里不再赘述。
采用1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑与6-氧-1,6-二氢哒嗪-3-碳酸肼脱水反应生成第二化合物的方法：
具体操作：取3mmol的6-氧-1,6-二氢哒嗪-3-碳酸肼加入盛有20ml乙醇的烧瓶中，沸水浴回流搅拌至溶解，然后缓慢滴加入15ml溶有2mmol1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑的无水乙醇溶液，继续沸水浴回流搅拌1小时，滴加10滴盐酸，有淡黄色沉淀出现。连续沸水浴回流搅拌5小时，停止水浴，加入20ml蒸馏水搅拌，淡黄色沉淀颜色变深，抽滤得黄红色针状产物。用无水乙醚冲洗多次，乙醇重结晶并真空干燥得第二化合物。
如图表示了第一化合物和第二化合物的制备过程，1表示第一化合物的化学结构式，2表示第二化合物的化学结构式，其中1,2,4-三氮唑与1-芳基-3-甲基-4-甲酰基吡唑物质的量之比为7:5，1-芳基-3-甲基-4-甲酰基-5-(1,2,4-三唑基)吡唑与6-氧-1,6-二氢哒嗪-3-碳酸肼物质的量之比为2:3。
将顺丁烯二酸酐2.45克(25mmol)和l-亮氨酸3.28克(25mmol)加入经过分子筛干燥的dmf溶剂(n,n-二甲基甲酰胺)15毫升中，搅拌回流8小时，冷却至室温后加入乙酸乙酯50毫升稀释，饱和氯化铵溶液洗涤6次，每次30毫升，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤后的有机相减压蒸馏旋干，用乙酸乙酯重结晶得白色固体化合物l-亮氨酸取代马来酰亚胺。
图3表示了l-亮氨酸取代马来酰亚胺的制备过程，3表示l-亮氨酸取代马来酰亚胺的化学结构式，其中r＝(r)-ch2ch(ch3)2，所述顺丁烯二酸酐和l-亮氨酸物质的量之比为1:1。
将1mmol白色固体化合物l-亮氨酸取代马来酰亚胺和1.1mmol化合物2于30ml95％乙醇中，再加入1.2mmol氯胺t，回流7小时，tlc检测反应完成后，得到淡黄色沉淀，减压过滤出沉淀，沉淀用甲醇重结晶，真空干燥后得到含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物。
图4示出了含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物的制备过程，4表示含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物的化学结构式，其中：
r＝(s)-ch2ch(ch3)2。
所述第二化合物、l-亮氨酸取代马来酰亚胺、氯胺t物质的量之比为10:11:12。
需要说明的是，本发明给出了各步骤中参与制备的各物质的物质的量之比，并给出了一个实施例，本领域技术人员可以根据本技术方案的方法采用不同的物质的量进行制备，本发明对此不做限制。
本实施例还提供了如下实验数据：
l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物，淡黄色粉末，产率17.6％，熔点：152-153℃，其核磁氢谱数据和元素分析数据如下：
1hnmr(cd3od)δ:10.07(s,1h,nhn),8.04(s,2h，n＝c-h),7.34-7.18(m,5h,ar-h),6.49(s,1h,c＝c-h),5.81(d,j＝10.2hz,1h),5.35(d,j＝10.2hz,1h),4.47(ch,1h,hc-n-c＝o)，2.63-2.73(m,1h,ch),2.37(s,3h,ch3)2.00-2.07(m,1h,ch),1.30-1.34(m,1h,h1ofch2),1.57-1.68(m,1h,h2ofch2),0.77-0.80(dd,6h,j＝2.4hz,6.8hz,2ch3)。
ir(kbr)v/cm-13456(n-c＝o),3083(arh),1771(c＝o,pyridazinone),1720(c＝o),1575(c＝n),1295(c-o-c)cm-1,1694(c＝o)cm-1
m/e:598(100.0％)
anal.calcd.forc28h26n10o6：c,56.15；h,4.42；n,23.36。
本实施例采用mtt法测定含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物(以下以化合物4来表述)对不同瘤株的体外抑制作用，l-亮氨酸取代马来酰亚胺衍生物的抗肿瘤活性测定结果如下：
将化合物4用dmso溶解，稀释，肿瘤细胞bel-7402(人肝癌细胞)、kb(口腔癌细胞)、sgc7901(胃癌细胞)、ho8901(卵巢癌细胞)、hl-60(白血病细胞)、eca109(肠癌细胞)在96孔板上种入4000个/200μl/孔，每孔加入化合物2μl，终浓度为12.0μm，6.0μm，3.0μm，1.5μm，共同于37℃、5％co2细胞培养箱中孵育72小时，以dmso(1％)为空白对照。72小时后，加入终浓度为0.25mg/ml的mtt，置于37℃、5％co2细胞培养箱中4小时，之后吸干溶剂，每孔加入100μldmso，用酶联免疫仪于570nm处测定吸光度(od值)，所得数据用于计算ic50值。挑选抑制活性高的化合物，测定不同浓度下的化合物作用时间不同对人肿瘤细胞周期和凋亡的影响。
不同浓度的受试化合物用96孔板进行粗筛，根据所得的抑制率，计算ic50值，结果见下表。
表1
在表1中，表示出了含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-三唑基)取代的l-亮氨酸取代的马来酰亚胺衍生物(化合物4)对六种肿瘤细胞株的ic50值，说明化合物对hl-60(白血病细胞)、bel-7402(人肝癌细胞)、ho8901(卵巢癌细胞)都有较强的肿瘤细胞抑制效果，为其进一步的医药领域应用提供了基础。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。