本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及在真菌纤维素酶发酵生产的过程中利用凹凸棒土来提高纤维素酶发酵效率的方法。
背景技术
纤维素是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的高聚多糖分子。纤维素酶具备水解木质纤维素成单糖的能力，这使得其广泛地被应用于造纸、食品、纺织、饲料、生物能源等领域。纤维素酶为复合酶，由三类酶组成：内切葡聚糖苷酶(eg，内切酶)、外切葡聚糖苷酶(cbh，外切酶)和β-葡萄糖苷酶(bg，β酶)。eg作用于不溶性纤维素的表面，破坏其晶体结构，将内部的纤维素链暴露出来使其易于水解；cbh将暴露出来的纤维素链水解为2～4个单位的寡糖；bg最终将其降解为葡萄糖单糖。里氏木霉（trichodermareesei）能够分泌大量高效的纤维素酶，是目前纤维素酶工业生产中最主要的菌种之一，其胞外纤维素系统由60%-80%的外切葡聚糖苷酶，20%-36%的内切葡聚糖苷酶和1%的β-葡聚糖苷酶组成。
纤维素酶是一种诱导酶，在里氏木霉发酵过程中是需要有诱导物存在的。乳糖、纤维二糖和槐糖等一系列二糖衍生物和木质纤维素可以诱导产生纤维素酶，其中槐糖和木质纤维素被认为对里氏木霉纤维素酶的诱导能力最为显著。槐糖的价格高昂，只能被应用于科学研究，无法直接应用于工业生产纤维素酶；有些生产厂家会利用其自有方法合成槐糖和葡萄糖的混合物利用于发酵纤维素酶，缺点是工艺复杂，设备要求高。利用槐糖诱导产纤维素酶有个最大的不足就是生产出的纤维素酶里的内切葡聚糖苷酶比例过高，其余酶组分比例低，在降解木质纤维素等自然界来源的纤维素的效果上不理想。木质纤维素具有价格低廉，来源广泛，以木质纤维素诱导产生的纤维素酶在酶组分的配比上最优化，降解自然界来源的纤维素的效果理想。木质纤维素也有缺点，其以不可溶于水的形式存在，影响了其被直接吸收利用；木质纤维素在发酵过程中，因为纤维素酶的存在，大部分被降解成单糖，被应用于菌体的生长作用，没有起到诱导作用；因为发酵过程中不能被杂菌污染，木质纤维素密度低，且不像其他可溶性物质，很难通过在中途补加来维持诱导效果，只能在初始培养基中添加消毒。
凹凸棒土是一种层链状结构的含水富镁铝硅酸盐粘土矿物，其晶体形状为棒状、纤维状、针状，结构属2：1型粘土矿物。在每个2：1单位结构层中，四面体晶片角顶隔一定距离方向颠倒，形成层链状。凹凸棒土具有非常大的比表面积和一定的离子交换性，因此广泛用作吸附剂、催化剂载体、混合饲料添加剂和抗菌剂载体等。
技术实现要素：
本发明的目的是：设计一种利用凹凸棒土高效发酵纤维素酶的方法，利用凹凸棒土具有很好的吸附作用，在纤维素酶发酵过程中，凹凸棒土吸附培养基中的木质纤维素，形成相应的吸附缓释效应，延长木质纤维素被纤维素酶降解的时间，维持长时间的诱导效果，从而提高纤维素酶发酵效率。
本发明的技术解决方案是该利用凹凸棒土高效发酵纤维素酶的方法包括以下步骤：
（1）种子培养基配制：配制种子培养基，于121℃灭菌20min，冷却待用；
（2）发酵纤维类培养基配制：发酵罐中加入发酵培养基，于121℃灭菌20min后降温至50℃搅拌维持2小时，再降温至发酵初始温度30℃，待用；
（3）种子液：按种子培养基体积的2%接种菌种的孢子液，30℃摇床培养2天，转速200rpm，得种子液；
（4）发酵：发酵培养基中在移种前再补入于121℃灭菌20min冷却待用的其余营养物；按发酵培养基体积的5%接种种子液，发酵罐发酵，发酵初始温度30℃，36h后降至26℃发酵，溶氧量不低于20%，通气量0.2~1vvm。
所述步骤（1）中，每升种子培养基：玉米浆10g/l，葡萄糖40g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l，其余水。
所述步骤（2）中，每升发酵纤维类培养基：木质纤维素20~60g/l，市购200目凹凸棒土0.2~0.6g/l，微晶纤维素5g/l，其余水。
所述步骤（2）中，木质纤维素物质包括稻草秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆。
所述步骤（3）中，产纤维素酶菌种为里氏木霉。
所述步骤（4）中，每升发酵培养基中添加的其余营养物为：玉米浆20g/l，豆粕20g/l，葡萄糖20g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l。
所述步骤（4）中，发酵前期转速为250rpm；中期为了控制溶氧不低于20%转速依情况升高，最高不超过400rpm；后期转速随着溶氧逐步上升而降低转速，最低转速不低于200rpm。
本发明的效果是：1、利用凹凸棒土具有很好的吸附作用，在纤维素酶发酵过程中，凹凸棒土吸附培养基中的木质纤维素，形成相应的吸附缓释效应，延长木质纤维素被纤维素酶降解的时间，维持长时间的诱导效果，从而提高纤维素酶发酵效率；2、实际操作简便可行，经济效益显著；3、通过在培养基中添加凹凸棒土，在延长发酵时间1天的情况下纤维素酶整体酶活最高可提高约90~110%。
附图说明
图1为本发明的实施例和对照例具体产酶曲线图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步详细地描述本发明。本领域技术人员应当理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下为纤维素酶整体酶活fpa的定义：在50℃、ph4.8、每分钟水解滤纸产生1µmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位（u）。
实施例1：依以下步骤发酵纤维素酶
（1）种子培养基配制：配制300ml种子培养基，于121℃灭菌20min，冷却待用；其中，每升种子培养基中：玉米浆10g/l，葡萄糖40g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l，其余水；
（2）发酵培养基配制：10l发酵罐中加入6l发酵纤维类培养基，于121℃灭菌20min后降温至50℃搅拌维持2小时，再降温至发酵初始温度30℃，待用；其中，每升发酵纤维类培养基中：木质纤维素60g/l，市购200目凹凸棒土0.6g/l，微晶纤维素5g/l，其余水；其中，木质纤维素物质为小麦秸秆；
（3）种子液：步骤（1）的种子培养基中加入6ml105cfu里氏木霉c-30菌种的孢子液，30℃摇床培养2天，转速200rpm，得种子液；
（4）发酵：步骤（2）的发酵培养基中在移种前再补入于121℃灭菌20min冷却待用的其余营养物；按发酵培养基体积的5%接种种子液，发酵罐发酵，发酵初始温度30℃，36h后降至26℃发酵，溶氧量不低于20%，通气量1vvm；其中，每升发酵培养基中添加的其余营养物为：玉米浆20g/l，豆粕20g/l，葡萄糖20g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l；其中，发酵前期转速为250rpm；中期为了控制溶氧不低于20%转速依情况升高，最高不超过400rpm；后期转速随着溶氧逐步上升而降低转速，最低转速不低于200rpm。
发酵9天产酶结束，发酵第8天达到酶活最高值；测定最高fpa酶活为9.5u/ml，其活力与传统方法产纤维素酶相比较，fpa提高了约110%。
实施例2：依以下步骤发酵纤维素酶
（1）种子培养基配制：配制300ml种子培养基，于121℃灭菌20min，冷却待用；其中，每升种子培养基中：玉米浆10g/l，葡萄糖40g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l，其余水；
（2）发酵培养基配制：10l发酵罐中加入6l发酵纤维类培养基，于121℃灭菌20min后降温至50℃搅拌维持2小时，再降温至发酵初始温度30℃，待用；其中，每升发酵纤维类培养基中：木质纤维素20g/l，市购200目凹凸棒土0.2g/l，微晶纤维素5g/l，其余水；其中，木质纤维素物质为稻草秸秆；
（3）种子液：步骤（1）的种子培养基中加入6ml105cfu里氏木霉c-30菌种的孢子液，30℃摇床培养2天，转速200rpm，得种子液；
（4）发酵：步骤（2）的发酵培养基中在移种前再补入于121℃灭菌20min冷却待用的其余营养物；按发酵培养基体积的5%接种种子液，发酵罐发酵，发酵初始温度30℃，36h后降至26℃发酵，溶氧量不低于20%，通气量0.2vvm；其中，每升发酵培养基中添加的其余营养物为：玉米浆20g/l，豆粕20g/l，葡萄糖20g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l；其中，发酵前期转速为250rpm；中期为了控制溶氧不低于20%转速依情况升高，最高不超过400rpm；后期转速随着溶氧逐步上升而降低转速，最低转速不低于200rpm。
发酵9天产酶结束，发酵第8天达到酶活最高值；测定最高fpa酶活为8.6u/ml，其活力与传统方法产纤维素酶相比较，fpa提高了约90%。
实施例3：依以下步骤发酵纤维素酶
（1）种子培养基配制：配制300ml种子培养基，于121℃灭菌20min，冷却待用；其中，每升种子培养基中：玉米浆10g/l，葡萄糖40g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l，其余水；
（2）发酵培养基配制：10l发酵罐中加入6l发酵纤维类培养基，于121℃灭菌20min后降温至50℃搅拌维持2小时，再降温至发酵初始温度30℃，待用；其中，每升发酵纤维类培养基中：木质纤维素40g/l，市购200目凹凸棒土0.4g/l，微晶纤维素5g/l，其余水；其中，木质纤维素物质为玉米秸秆；
（3）种子液：步骤（1）的种子培养基中加入6ml105cfu里氏木霉c-30菌种的孢子液，30℃摇床培养2天，转速200rpm，得种子液；
（4）发酵：步骤（2）的发酵培养基中在移种前再补入于121℃灭菌20min冷却待用的其余营养物；按发酵培养基体积的5%接种种子液，发酵罐发酵，发酵初始温度30℃，36h后降至26℃发酵，溶氧量不低于20%，通气量0.6vvm；其中，每升发酵培养基中添加的其余营养物为：玉米浆20g/l，豆粕20g/l，葡萄糖20g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l；其中，发酵前期转速为250rpm；中期为了控制溶氧不低于20%转速依情况升高，最高不超过400rpm；后期转速随着溶氧逐步上升而降低转速，最低转速不低于200rpm。
发酵9天产酶结束，发酵第8天达到酶活最高值；测定最高fpa酶活为9.1u/ml，其活力与传统方法产纤维素酶相比较，fpa提高了约102%。
对照例4：依以下步骤发酵纤维素酶
（1）种子培养基配制：配制300ml种子培养基，于121℃灭菌20min，冷却待用；其中，每升种子培养基中：玉米浆10g/l，葡萄糖40g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l，其余水；
（2）发酵培养基配制：10l发酵罐中加入6l发酵纤维类培养基，于121℃灭菌20min后降温至发酵初始温度30℃，待用；其中，每升发酵培养基中：木质纤维素60g/l，微晶纤维素5g/l，其余水；其中，木质纤维素物质为玉米秸秆；
（3）种子液：步骤（1）的种子培养基中加入6ml105cfu里氏木霉c-30菌种的孢子液，30℃摇床培养2天，转速200rpm，得种子液；
（4）发酵：步骤（2）的发酵培养基中在移种前再补入于121℃灭菌20min冷却待用的其余营养物；按发酵培养基体积的5%接种种子液，发酵罐发酵，发酵初始温度30℃，36h后降至26℃发酵，溶氧量不低于20%，通气量0.4vvm；其中，每升发酵培养基中添加的其余营养物为：玉米浆20g/l，豆粕20g/l，葡萄糖20g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，feso4·7h2o5mg/l，znso4·7h2o1.4mg/l，mnso4·7h2o1.6mg/l；其中，发酵前期转速为250rpm；中期为了控制溶氧不低于20%转速依情况升高，最高不超过400rpm；后期转速随着溶氧逐步上升而降低转速，最低转速不低于200rpm。
发酵8天产酶结束，发酵第7天达到酶活最高值；测定最高fpa酶活为4.5u/ml。
实施例1-3和对照例4的具体产酶曲线如图1所示。由图可知，通过在培养基中添加凹凸棒土，在延长发酵时间1天的情况下纤维素酶整体酶活最高可提高约90~110%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。