一种利用β-紫罗兰酮促进杜氏藻积累类胡萝卜素和β-胡萝卜素的方法与流程

本发明属于食品科学技术领域，具体涉及一种利用β-紫罗兰酮促进杜氏藻积累类胡萝卜素和β-胡萝卜素的方法。

背景技术

类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，分布广泛在高等植物、藻类以及某些光合和非光合细菌、真菌中。类胡萝卜素对动物和人具有重要的生理功能，具有改善视力、抗氧化、提高免疫功能和预防心血管疾病等功效。类胡萝卜素在工业上可作为营养补充剂、化妆品、食用色素和着色剂。类胡萝卜素中β-胡萝卜素是橘黄色的天然色素，在胡萝卜、木瓜和芒果以及绿色蔬菜等都含有丰富的β-胡萝卜素，天然β-胡萝卜素是维生素a的前体，是人体维生素a的主要来源，还有抗氧化(清除自由基)、增强人体免疫力、保护视力、延缓衰老、防癌抗癌等功效。

目前β-胡萝卜素的生产方法主要有化学合成、天然提取和微生物发酵等。过去，化学合成的β-胡萝卜素产品基本上是独占市场，目前使用的β-胡萝卜素也大都是化学合成产品，因为化学法生产的β-胡萝卜素成本低，但几乎都是全反式异构体，生物活性低，有致染色体畸变作用，不具备天然β-胡萝卜素的许多生理功能，降低了产品的功效。近年来开始利用三孢布拉霉(blakesleatrispora)发酵生产天然β-胡萝卜素，这种方法生产的β-胡萝卜素全反式结构占85％以上，顺式结构占5～10％，有一定的生物活性。而从杜氏藻提取的含有40％顺式结构的天然β-胡萝卜素的生物活性好，但成本较高。杜氏藻是一种极其耐盐的真核单细胞绿藻，主要是在盐田、盐湖以及海洋中发现，抗逆性强，培养条件简单，能在高盐环境下培养，可以避免其它微生物的污染，有利于进行大规模的室外培养；而且在高光、高盐和营养胁迫等条件下，巴氏杜氏藻(dunaliellabardawil)能够大量累积β-胡萝卜素，最高可达干重的14％，是极佳的天然β-胡萝卜素的生物来源。但养殖杜氏藻的周期较长，相对限制了β-胡萝卜素的产量，寻找促进杜氏藻大量积累β-胡萝卜素的物质，成为该领域的关键技术问题。

技术实现要素：

为了能够快速累积类胡萝卜素和类胡萝卜素中β‐胡萝卜素，提高杜氏藻中类胡萝卜素和类胡萝卜素中β‐胡萝卜素的含量，本发明提供了一种利用β-紫罗兰酮促进杜氏藻积累类胡萝卜素和类胡萝卜素中β-胡萝卜素的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种利用β-紫罗兰酮促进杜氏藻积累类胡萝卜素和β-胡萝卜素的方法，包括如下步骤：将待诱导的杜氏藻细胞在含有β-紫罗兰酮的培养基中进行诱导培养，类胡萝卜素及类胡萝卜素中β-胡萝卜素在藻细胞中积累，然后提取色素。

所述待诱导的杜氏藻细胞为对数生长期(包括前期、中期和后期)和/或稳定期的杜氏藻细胞。当杜氏藻细胞处于对数生长期(包括前期、中期和后期)和/或稳定期时，藻液的od630≥0.7。

所述杜氏藻优选为巴氏杜氏藻。

所述β-紫罗兰酮的加入量为1～20mg/l(即1l的培养基中加入1～20mg的β-紫罗兰酮)，优选为1～18mg/l，更优选为1～15mg/l；所述培养基为液体培养基，优选为杜氏藻液体培养基。

所述诱导培养的时间为2h～7天。

所述诱导培养的条件为在光照度为1000-8000lx，光暗周期为6-24h:6-24h，温度为20-35℃，以10-200r/min的转速震荡培养，优选为在光照度为8000lx，光暗周期为14h:10h，温度为26℃，以50r/min的转速震荡培养。

所述杜氏藻液体培养基，其成分为：nano30.420g/l，nacl87.690g/l，nah2po4·2h2o0.015g/l，nahco30.840g/l，kcl0.074g/l，mgso4·7h2o1.230g/l，cacl2·2h2o0.044g/l，fe-edta溶液0.5ml/l，a5微量元素溶液1ml/l。

fe-edta溶液：na2edta1.804g/l，fecl3·6h2o0.483g/l；a5微量元素溶液：h3bo32.860g/l，mncl2·4h2o1.810g/l，znso4·7h2o0.220g/l，cuso4·5h2o0.079g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o0.039g/l。

所述方法的具体步骤为：

将杜氏藻细胞加入液体培养基中培养，待藻液的od630≥0.7时，加入β-紫罗兰酮继续培养，提取色素，获得类胡萝卜素和β-胡萝卜素。所述培养的条件为在光照度为1000-8000lx，光暗周期为6-24h:6-24h，温度为20-35℃，以10-200r/min的转速震荡培养，优选为在光照度为8000lx，光暗周期为14h:10h，温度为26℃，以50r/min的转速震荡培养。

所述提取色素的方法为：将培养完成的藻液进行离心，弃上清液，将藻泥与有机溶剂混合，浸提，离心，将上层液进行滤膜过滤。

所述有机溶剂为丙酮、乙醇、甲醇或乙腈等；所述浸提的时间为15～30min，所述滤膜为0.45μm滤膜。

本发明的有益效果是加入β-紫罗兰酮后能有效提高杜氏藻的类胡萝卜素的含量和类胡萝卜素中β‐胡萝卜素含量，可能是因为β-紫罗兰酮能促进类异戊二烯的合成，而类异戊二烯是合成类胡萝卜素的前体物质。本发明中β-紫罗兰酮的用量极少，在刺激杜氏藻大量积累β‐胡萝卜素的同时，不会明显增加生产成本。由于β-紫罗兰酮是挥发性的香气成分，在杜氏藻采收提取β‐胡萝卜素前2～6小时加入β-紫罗兰酮处理，效果会更佳(即藻细胞处于对数生长期或稳定期)。

与现有技术相比，本发明的优点是：

(1)本发明利用的杜氏藻属于真核自养微生物，培养条件简单，抗逆性强，能在高盐环境下培养，可以避免其它微生物的污染，有利于进行大规模的室外培养。而且杜氏藻自身无毒无害，可直接用作天然保健品。

(2)本发明利用的β-紫罗兰酮用量极少，在刺激杜氏藻大量积累β‐胡萝卜素的同时，不会明显增加生产成本。β-紫罗兰酮为易挥发的香气物质，能快速扩散，短时间内即可促进杜氏藻积累β‐胡萝卜素。

(3)本发明在高盐、强光、缺氮等极端环境的胁迫下，β‐胡萝卜素会有更高的产率，获得更高的收益。

本发明简单易行、成本低廉、能显著提高总类胡萝卜素和β-胡萝卜素的产量，而且杜氏藻是极其耐盐的单细胞绿藻，培养条件简单，且不易被其他微生物污染，相对于细菌以及三孢布拉霉等异养微生物更利于大规模养殖，符合工业化大规模生产的标准。

附图说明

图1为添加2～20mg/l的β-紫罗兰酮处理巴氏杜氏藻(od630＝0.714)3小时总类胡萝卜素和β-胡萝卜素的含量；

图2为添加2～20mg/l的β-紫罗兰酮处理巴氏杜氏藻(od630＝0.714)6小时总类胡萝卜素和β-胡萝卜素的含量；

图3为添加1～50mg/l的β-紫罗兰酮处理巴氏杜氏藻(od630＝1.421)4天总类胡萝卜素和β-胡萝卜素的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

测定色素含量的方法为：用分光光度计或酶标仪分别测定665.2nm、652.4nm和470nm波长处的吸光度值，再用下列公式进行计算：

叶绿素a(μg/ml)＝16.72·a665.2-9.16·a652.4

叶绿素b(μg/ml)＝34.09·a652.4-15.28·a665.2

总类胡萝卜素(μg/ml)＝(1000·a470-1.63·chla-104.96·chlb)/221

测定β-胡萝卜素含量的方法为：首先是制作β-胡萝卜素标准曲线，用丙酮分别稀释100μg/mlβ-胡萝卜素标液，配制以下不同浓度的β-胡萝卜素溶液：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和1μg/ml，然后用酶标仪测定453nm处的吸光值，从而得到一条标准曲线y＝0.795x+0.0098，r²＝0.999，其中y为453nm处的吸光值；x为β-胡萝卜素含量(μg/ml)。

实施例1

(1)活化培养

首先配制杜氏藻液体培养基，其成分为：nano30.420g/l，nacl87.690g/l，nah2po4·2h2o0.015g/l，nahco30.840g/l，kcl0.074g/l，mgso4·7h2o1.230g/l，cacl2·2h2o0.044g/l，fe-edta溶液(na2edta1.804g/l，fecl3·6h2o0.483g/l)0.5ml/l，a5微量元素溶液(h3bo32.860g/l，mncl2·4h2o1.810g/l，znso4·7h2o0.220g/l，cuso4·5h2o0.079g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o0.039g/l)1ml/l；

然后将巴氏杜氏藻细胞接种于上述液体培养基中，在光照度为8000lx，光暗周期为14h:10h(光照14h，无光10h)(光暗交替培养)，温度为26℃，以50r/min的转速震荡培养，获得同步生长的藻液。

(2)诱导培养

当藻液中藻细胞处于对数生长期(od630＝0.714)时，分别向藻液添加0、2、5、10和20mg/lβ-紫罗兰酮，继续培养(光照度为8000lx，光暗周期为14h:10h(光照14h，无光10h)，温度为26℃，以50r/min的转速震荡培养)3小时。

(3)色素提取

取2ml藻液在8000r/min转速下离心5min，弃上清液，向藻泥中加入2ml丙酮，涡旋分散，浸提20min后，10000r/min转速下离心15min，取上层丙酮相转移到新的离心管中，用0.45μm滤膜过滤。

(4)含量测定

用酶标仪分别测定上述丙酮相溶液在665.2nm、652.4nm和470nm波长处的吸光度值，再用下列公式进行计算：

叶绿素a(μg/ml)＝16.72·a665.2-9.16·a652.4

叶绿素b(μg/ml)＝34.09·a652.4-15.28·a665.2

总类胡萝卜素(μg/ml)＝(1000·a470-1.63·chla-104.96·chlb)/221

测定β-胡萝卜素含量的方法为：首先是制作β-胡萝卜素标准曲线，用丙酮分别稀释100μg/mlβ-胡萝卜素标液，配制以下不同浓度的β-胡萝卜素溶液：0.2、0.5、1、2、3、4、5和10μg/ml，然后用酶标仪测定453nm处的吸光值，从而得到一条标准曲线y＝0.795x+0.0098，r2＝0.999，其中y为453nm处的吸光值；x为β-胡萝卜素含量(μg/ml)。

按上述公式计算总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量，发现添加2～20mg/l的β-紫罗兰酮处理巴氏杜氏藻3h后，总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量比未加β-紫罗兰酮处理的对照组分别提高14.3～33.3％和29.1～43.8％(见图1)。

实施例2

(1)活化培养(同实施例1)

(2)诱导培养

同实施例1，不同之处在于加入β-紫罗兰酮后继续培养6小时。

(3)色素提取(同实施例1)

(4)含量测定

测定总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量的方法同实施例1，结果发现添加2～20mg/l的β-紫罗兰酮处理巴氏杜氏藻6h后，总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量比未加β-紫罗兰酮处理的对照组分别提高9.3～33.0％和16.2～38.1％(见图2)。

实施例3

(1)活化培养(同实施例1)

(2)诱导培养

当巴氏杜氏藻细胞处于稳定期(od630＝1.421)时,分别向藻液添加0、1、2、5、20和50mg/lβ-紫罗兰酮，继续培养4天。

(3)色素提取(同实施例1)

(4)含量测定

经计算，发现添加1、2和5mg/l的β-紫罗兰酮处理巴氏杜氏藻4天后，总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量比未加β-紫罗兰酮处理的对照组分别提高13.9～28.6％和31.0～39.3％，而高浓度即50mg/l的β-紫罗兰酮处理4天后，由于巴氏杜氏藻细胞生物量有所下降，总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量比对照组显著减少(见图3)。说明低浓度的β-紫罗兰酮能促进杜氏藻积累总类胡萝卜素和β-胡萝卜素。