本发明涉及一种鉴定烟草sua-cms胞质雄性不育系的分子标记，及鉴定方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility，cms)是雄蕊退化、花粉败育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一种母性遗传性状。雄性不育系是作物杂种优势利用的前提，也是提高单产、改进品质、增强抗逆的重要途径。烟草是叶用作物，在杂交育种中使用不育系不但可以克服人工去雄授的缺点，在生产上使用不育系还能够控制种子的私自繁殖，保证烟草种子质量，维持正常的烟草生产秩序，因此烟草细胞质雄性不育在烟草育种和生产上具有很重要的地位。近年来，烟草不育系及杂交种的种植面积占我国烤烟面积的50％以上，均为sua-cms类型，sua-cms也是唯一一个对烟草综合性状无不利影响的不育类型(佟道儒、马文广等)。
一般不育类型通过形态学、细胞学以及分子特征等方面进行鉴定，特异分子的鉴定具有稳定性、准确性和快速性等优点，可以广泛应用于不育类型鉴定。目前尚未见到有关鉴定烟草sua-cms胞质雄性不育系的分子标记的报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明提供了一种鉴定烟草sua-cms胞质雄性不育系的分子标记，及鉴定方法，能够快速鉴定烟草sua-cms，大幅减少了鉴定工作量，节省了时间和资金，提高了工作效益。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种鉴定烟草sua-cms胞质雄性不育系的分子标记，所述分子标记选自orf82、orf103、orf115a、orf100、orf115b、orf191，其核苷酸序列分别如seqidno.1、2、3、4、5、6所示。
本发明通过对线粒体基因大量扩增和筛选，利用orf-finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，blastn，blastx(altschul等，1990)和trnascan-se(lowe和eddy1997)在不育系和可育对照的线粒体基因组中筛选orf>70的orfs，在不育系和可育系中分别发现了393和417个orf。通过blast比对，其中的362个orf为不育系和可育对照共有，将sua-cms不育系特有的31个orf设计特异引物，在7种烟草胞质不育类型中进行扩增，发现位于122845-123313、372705-343743、414430-415454三个区段内的orf82、orf103、orf115a、orf100、orf115b、orf191共6个orf(核苷酸序列依次如seqidno.1～6所示)是sua-cms不育系特有的(如图2所示)(这6个orfs位于三个区段内，orf82位于区段一内，orf103、orf115a位于区段二内，orf91、orf115b、orf100位于区段三内)。
三对特异性引物，可特异性扩增上述鉴定烟草sua-cms胞质雄性不育系的分子标记(引物sp1、sp2、sp3分别对应上述的三个区段122845-123313、372705-343743、414430-415454)，其核苷酸序列分别如下所示(序列方向为5′-3′)：
sp1：f：gcagaggtgacaaagcat；
r：gaaaccaaacaaagagcg(核苷酸序列如seqidno.7、8所示)。
sp2：f：ggagttccccccttgaag；
r：cggtgccgaagtttggtt(核苷酸序列如seqidno.9、10所示)。
sp3：f：atcaggacggtagcactt；
r：ggtctttcccaaaacaaa(核苷酸序列如seqidno.11、12所示)。
上述鉴定烟草sua-cms胞质雄性不育系的分子标记、特异性引物在鉴定烟草sua-cms胞质雄性不育系中的应用。
具体应用时，鉴定方法包括如下步骤：
(1)提取待检测烟草的叶片基因组dna；
(2)以叶片基因组dna为模板，利用上述的三对特异性引物之一进行扩增，检测扩增产物，若扩增出特异性条带(引物sp1扩增出468bp的特异性条带，引物sp2扩增出1038bp的特异性条带，引物sp3扩增出1024bp的特异性条带)，则该待检测烟草为sua-cms胞质雄性不育系。
进一步地，提取叶片基因组dna后，利用1％的琼脂糖检测dna的完整性(鉴定dna有无降解)，并利用nanodrop测定所提dna浓度和质量(通过仪器测定od260/280的比值，鉴定dna有无蛋白或者rna的污染以及所提dna的浓度)。
研究细胞质雄性不育的分子机理对创建、鉴定和利用细胞质雄性不育系，培育超高产杂交作物新品种具有重要的指导意义。目前研究表明，线粒体基因组是细胞质雄性不育胞质因子的主要载体，烟草细胞质雄性不育与线粒体有着十分密切的关系，线粒体基因组的变异性很可能涉及到不育系育性本质的改变，本发明通过对线粒体基因大量扩增和筛选，得到了烟草sua-cms的六个特异orfs，进一步实验证明这六个orfs分布在线粒体基因的三个区段上。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的鉴定方法，避免了繁琐的线粒体dna的提取，以烟草叶片基因组dna为模板，利用内参和线粒体基因组内参进行叶片基因组dna质量检测，扩增成功表示质量高，确保下一步扩增可靠实现。
(2)本发明获得了sua型烟草细胞质的特异标记，鉴定方法高效并且程序简化，结果可用于sua型烟草细胞质雄性不育系分子标记辅助育种，也为烟草专一细胞质种性鉴定提供了技术支撑和理论依据。
(3)本发明采用三对引物鉴定sua型烟草细胞质雄性不育系，为进一步研究烟草核质互作雄性不育机理，甚至种性差异奠定了基础。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：实验用材料列表。
图2；六个分子的结构简图。
图3：sua-cms特异引物的pcr扩增，其中，a、b、c分别对应引物sp1、sp2、sp3的扩增结果。
图4：不同胞质来源的不育系的pcr扩增，其中，a、b、c分别对应引物sp1、sp2、sp3的扩增结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1
本发明以七种烟草不同细胞质类型的雄性不育系和保持系为材料，分别是sua-cms、glu-cms、rep-cms、rus-cms、tab1-cms、tab2-cms、tab3-cms和zhongyan100，分别提取其叶片基因组dna，然后对其进行特异性标记筛选，获得sua型烟草胞质雄性不育的独特分子标记。
sua型烟草胞质雄性不育的鉴定，步骤如下：
(一)提取各种细胞质雄性不育系(sua-cms、glu-cms、rep-cms、rus-cms、tab1-cms、tab2-cms、tab3-cms和zhongyan100)叶片基因组dna：采用ctab提取法分别提取上述8个材料(编号为1-8)的叶片基因组dna，具体操作如下：
(1)将ctab提取缓冲液gp1(预先加入巯基乙醇)放入65℃水浴预热30min。取材料(每种材料取约100mg)，加液氮研磨成粉末状，迅速移入2.0mleppend分子管中，加入700ul预热的gp1，涡旋混匀，将eppend分子管置于65℃水浴20min,每5min颠倒离心管一次，以混匀样品；
(2)加入700ul氯仿，充分混匀，12000r/min，离心10min；
(3)小心吸取上清液并转入一个新的离心管中，加入700ul缓冲液gp2，充分混匀；
(4)将混匀的液体转入吸附柱cb3中，12000r/min，离心30s，弃掉废液(分两次加入离心)；
(5)向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd，12000r/min，离心30s倒掉废液；
(6)向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw，12000r/min，离心30s倒掉废液；
(7)重复步骤(6)；
(8)将吸附柱cb3放入收集管中，12000r/min，离心2min，倒掉废液，将cb3置于室温放置半小时以彻底晾干残余的漂洗液(放在干净的1.5ml离心管中)；
(9)向吸附柱膜中间加入100ul的灭菌水，室温放置2min,12000r/min，离心2min，弃掉吸附柱，于-20℃或者-70℃下保存备用；
(二)以提取的叶片基因组dna为模板，分别以三对引物(sp1、sp2、sp3)进行pcr扩增，pcr反应体系(20ul)如下：
模板dna(50ng/μl)1.5μl，正反向引物(10ng/μl)各1μl，taqplusmastermixii10μl，灭菌水6.5μl。
pcr扩增程序为：
95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃复性30s，进行35个循环；72℃延伸7min，16℃保存30min。
(三)采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，保留出现条带的基因组dna，检测结果见图3(图中由左向右依次为：m：dnamarker(dl2000)；ms中烟100(sua-cms)，86-6(glu-cms)，98-43(rep-cms)，200-18(rus-cms)，l1(tab1-cms)，4-1(tab2-cms)，ch03(tab3-cms)，中烟100。由图3可以看出，只有sua-cms能扩增出相应的条带，与目标条带大小一致(引物sp1扩增出468bp的特异性条带，引物sp2扩增出1038bp的特异性条带，引物sp3扩增出1024bp的特异性条带)，而在其它不育细胞质和保持系中并未扩增出该条带，进一步验证了引物sp1、sp2、sp3在鉴定烟草sua型细胞质时具有特异性。
实施例2
本发明以三个可育烟草g28、k326、nc82分别与七种胞质不育类型(分别是sua-cms、glu-cms、rep-cms、rus-cms、tab1-cms、tab2-cms和tab3-cms)杂交并回交得到bc1f1代，以及三个sua-cms不育胞质回交十代以上的不育系、和三个sua-cms不育胞质杂交种为材料，分别提取其叶片基因组dna，通过琼脂糖电泳和微量核酸测定仪检测dna质量。然后对其进行特异性标记筛选，获得sua型烟草胞质雄性不育的独特分子标记。
sua型烟草胞质雄性不育的鉴定，步骤如下：
(一)提取三个可育烟草g28、k326、nc82分别与七种胞质不育类型(分别是sua-cms、glu-cms、rep-cms、rus-cms、tab1-cms、tab2-cms和tab3-cms)杂交并回交得到bc1f1代，以及三个sua-cms不育胞质回交十代以上的不育系、和三个sua-cms不育胞质杂交种(图1中的编号位9-37)叶片基因组dna：采用ctab提取法分别提取材料的叶片基因组dna。具体操作如下：
(1)将ctab提取缓冲液gp1(预先加入巯基乙醇)放入65℃水浴预热30min。取材料(每种材料取约100mg)，加液氮研磨成粉末状，迅速移入2.0mleppend分子管中，加入700ul预热的gp1，涡旋混匀，将eppend分子管置于65℃水浴20min,每5min颠倒离心管一次，以混匀样品；
(2)加入700ul氯仿，充分混匀，12000r/min，离心10min；
(3)小心吸取上清液并转入一个新的离心管中，加入700ul缓冲液gp2，充分混匀；
(4)将混匀的液体转入吸附柱cb3中，12000r/min，离心30s，弃掉废液(分两次加入离心)；
(5)向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd，12000r/min，离心30s倒掉废液；
(6)向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw，12000r/min，离心30s倒掉废液；
(7)重复步骤(6)；
(8)将吸附柱cb3放入收集管中，12000r/min，离心2min，倒掉废液，将cb3置于室温放置半小时以彻底晾干残余的漂洗液(放在干净的1.5ml离心管中)；
(9)向吸附柱膜中间加入100ul的灭菌水，室温放置2min,12000r/min，离心2min，弃掉吸附柱，于-20℃或者-70℃下保存备用；
(二)以提取的叶片基因组dna为模板，分别以三对引物(sp1、sp2、sp3)进行pcr扩增，pcr反应体系(20ul)如下：
模板dna(50ng/μl)1.5μl，正反向引物(10ng/μl)各1μl，taqplusmastermixii10μl，灭菌水6.5μl。
pcr扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃复性30s，进行35个循环；72℃延伸7min，16℃保存30min。
(三)采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，保留出现条带的基因组dna，检测结果见图4(图中由左向右依次为m：dnamarker(dl2000)，图1中对应编号9-37)。由图4可以看出，只有sua-cms能扩增出相应的条带，与目标条带大小一致，而在其它不育细胞质和保持系中并未扩增出该条带，进一步验证了引物sp1、sp2、sp3在鉴定烟草sua型细胞质时具有特异性。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110>中国农业科学院烟草研究所
<120>鉴定烟草sua-cms胞质雄性不育系的分子标记
<141>2018-06-28
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>246
<212>dna
<213>nicotianatabacum
<400>1
atgccaatcctttcaaacttctgcctttcctgcactagcgcccttcctcttgatataccg60
ctattgttttttttatgcatctttctgttctcatcctcaaaatcgttttcgtgtagaagc120
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ccttttggggcgttcgccacactggagccccaggaatggaacccaggtcggccacaactc240
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<210>2
<211>309
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<210>3
<211>345
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