一种β-酪蛋白基因分型的HRM检测方法及引物与流程

文档序号：15983958发布日期：2018-11-17 00:39阅读：607来源：国知局

本发明属于生物技术领域，涉及一种β-酪蛋白基因分型的检测方法及引物，可应用于a2a2纯合型奶牛的鉴定。

背景技术

牛奶蛋白主要分为酪蛋白和乳清蛋白，乳清蛋白又分为α乳白蛋白和β乳球蛋白等，约占牛奶蛋白的20%；酪蛋白有α、β和κ等几种类型，约占牛奶蛋白的80%。近几年研究发现，β-酪蛋白根据其结构的不同有a1、a2、a3、b、c、d、e等多种类型。a1和a2型的β-酪蛋白是奶牛群体中最常见的两种，a2型为野生型，a1型为a2型突变后形成的突变型。

β-酪蛋白是由209个氨基酸组成的蛋白质，a1型β-酪蛋白第67位点的氨基酸是组氨酸（密码子为cat），可以被某些酶特异性水解而产生一段氨基酸片段——β-酪啡肽（bcm-7），有研究表明，bcm-7是一种类咖啡因类物质，可能会导致心脏病和糖尿病发病率的提高以及婴幼儿过敏症状，引起部分人群类似乳糖不耐受的消化系统反应，出现腹痛、胀气，肠炎发病率增加等症状；而a2型β-酪蛋白第67位点的氨基酸是脯氨酸（密码子为cct），不能够被特异性水解，因此不能形成bcm-7，相对更加安全。且牛奶中的a2型β-酪蛋白与人乳中的β-酪蛋白结构更为相似，人β-酪蛋白同样不会产生bcm-7，不会发生由bcm-7导致的负面影响。因此，基于与母乳更为接近、同样不产生bcm-7的a2型β-酪蛋白制成的配方奶因其不含a1型β-酪蛋白，更有利于促进婴幼儿的生长发育。筛选专产a2型β-酪蛋白的奶牛进行挤奶并用于生产只含a2型β-酪蛋白的高端优质配方奶对于改善目前的国产奶粉品质具有重要作用。

现有的β-酪蛋白基因分型检测的方法有酶切技术、一代测序、taqman探针技术等。例如国内专利cn105219839a、cn105018582a和cn105925717a均公开的是基于酶切原理对β-酪蛋白进行分型的方法，对相应pcr扩增片段利用限制性内切酶进行酶切处理，再利用凝胶电泳进行跑胶，对得到的条带进行人工判读以区分不同类型的β-酪蛋白。该方法需要购买特殊的酶，成本高；检测反应步骤复杂，耗时长；人工判读结果，容易出现误差，结果可靠性较低。专利cn105018581a公开了一种基于测序方法进行β-酪蛋白基因分型的方法，对相应的pcr片段进行扩增后利用测序仪进行测序比对，但测序仪造价昂贵，而且没有做到真正的闭管操作。专利cn105861671a公开的方法基于质谱仪进行检测，同样质谱仪也是价格昂贵。专利cn107287292a公开一种基于多重连接酶检测反应的方法，首先使用一组引物进行多重pcr扩增，再进行多重连接酶反应，最后通过测序仪扫描和琼脂糖凝胶电泳分析连接反应所产生的片段长度，根据片段差异判定β-酪蛋白基因型。该方法操作复杂，成本高、耗时长。专利cn107058582a公开了一种基于kasp（竞争性等位基因特异性pcr）检测的β-酪蛋白分型方法，需购买专用的kaspmix。但现有的这些方法成本较高，操作相对复杂。

hrm，即高分辨率熔解曲线分析技术（highresolutionmelting），是近几年兴起的单核苷酸多态性（snp）及突变研究工具。它通过实时监测升温过程中双链dna荧光染料与pcr扩增产物的结合情况，来判断是否存在snp。不同snp位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，如同dna指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线可正确区分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子，因此hrm分析能够有效区分不同snp位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在pcr结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。

荧光染料分为非饱和荧光染料（如sybrgreen等）和饱和荧光染料（如evagreen、lcgreen、lygreen等）。相对非饱和荧光染料来说，饱和荧光染料具有以下优点：1.饱和荧光染料对pcr反应没有任何抑制作用，因此可以在pcr反应之前加入，而其它非饱和荧光染料若较多加入反应液中会抑制pcr反应，因此只能限量加入，从而对荧光pcr反应的指示受到限制；2.dna高温变性时，非饱和荧光染料的加入则会造成dna双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合到双链dna的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，不能分辨单碱基的差异，而饱和染料则不会出现此类情况；3.高温稳定，对于高gc含量的pcr产物，tm值较高，在dna双链高温熔解时，饱和荧光染料结合核酸更稳定。饱和荧光染料中lcgreen价格比较高，而evagreen因其极好的性价比深受大家欢迎。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简单、成本低、能准确、高效进行β-酪蛋白基因型检测的方法及引物，为a2a2纯合型奶牛的筛选提供可靠的鉴定方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种用于β-酪蛋白基因分型的hrm检测的引物，所述引物序列如下：

上游引物：5’-atccacccctttgcccagac-3’(seqidno.1)，

下游引物：5’-ggggtttgagtaagaggaggg-3’(seqidno.2)。

为了达到上述目的，本发明还提供一种β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法，包括以下步骤：

（a）提取样本dna；

（b）对所述样本dna采用如下引物进行pcr扩增；

（c）对pcr扩增产物进行hrm分析，收集数据，确定扩增产物基因型；

所述引物序列为：

上游引物：5’-atccacccctttgcccagac-3’，

下游引物：5’-ggggtttgagtaagaggaggg-3’。

优选地，所述步骤（b）中pcr扩增反应按以下步骤进行：

（1）95℃2分钟；

（2）95℃10秒，60℃30秒，共进行40个循环。

优选地，所述步骤（b）中pcr扩增是在反应液中进行的，其中20μl的反应液由以下组分组成：

2xhrmanalysispremix：10μl；

10μm的上游引物：0.6μl；

10μm的下游引物：0.6μl；

50ng/μl的dna模板：1μl；

rnase-freeddh2o：补齐至20μl，

其中，所述2xhrmanalysispremix包括500μmdntp、0.1udna聚合酶、饱和荧光染料、20mmtris-hcl、100mmkcl及3mmmgcl2。

优选地，所述饱和荧光染料为evagreen染料。

优选地，所述步骤（c）中对pcr扩增产物进行hrm分析的产物熔解过程为：95℃保持10秒，将至40℃保持10秒，之后从40℃升温熔解至85℃，熔解速率为0.05℃/秒，升温至85℃后保持1秒，之后将至40℃保持30秒；在从40℃升温熔解至85℃的过程中实时检测信号，信号检测频率为12次/℃。

本发明具有以下优点：

（1）本发明设计的引物对a1a1型（突变型纯合子）、a2a2型（野生型纯合子）、a1a2型（杂合子）的β-酪蛋白基因均有很好的扩增性，pcr效率高，且在hrm检测中能够有效提高熔解曲线的分辨率；

（2）本发明首次建立了一种β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法，利用本发明设计的引物能够有效区分a1a1型、a2a2型及a1a2型的β-酪蛋白基因，该检测方法操作简单，检测速度快，能实现高通量检测，准确性高，特异性好，重复性好且费用低。

附图说明

图1为三种基因型的β-酪蛋白的hrmgenescanning分析温度漂移图（normalizedandshiftedmeltingcurves）；

图2为三种基因型的β-酪蛋白的hrmgenescanning分析差减曲线图（normalizedandtemp-shifteddifferenceplot）；

图3为不同引物的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳照片，其中图3a为编号1-8引物的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳照片，图3b为编号9-12引物的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳照片；

图4为编号5的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析温度漂移图；

图5为编号5的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析差减曲线图；

图6为编号7的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析温度漂移图；

图7为编号7的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析差减曲线图；

图8为编号9的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析温度漂移图；

图9为编号9的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析差减曲线图；

图10为编号11的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析温度漂移图；

图11为编号11的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析差减曲线图；

图12为编号12的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析温度漂移图；

图13为编号12的引物对dna进行pcr扩增后的hrmgenescanning分析差减曲线图；

图14为准确性实验中22个检测样品的hrmgenescanning分析温度漂移图；

图15为准确性实验中22个检测样品的hrmgenescanning分析差减曲线图；

图16为准确性实验中1号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图17为准确性实验中2号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图18为准确性实验中3号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图19为准确性实验中4号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图20为准确性实验中5号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图21为准确性实验中6号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图22为准确性实验中7号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图23为准确性实验中8号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图24为准确性实验中9号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图25为准确性实验中10号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图26为准确性实验中11号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图27为准确性实验中12号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图28为准确性实验中13号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图29为准确性实验中14号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图30为准确性实验中15号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图31为准确性实验中16号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图32为准确性实验中17号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图33为准确性实验中18号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图34为准确性实验中19号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图35为准确性实验中20号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图36为准确性实验中21号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图37为准确性实验中22号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图；

图38为重复性实验中三种不同基因型的检测样品的hrmgenescanning分析温度漂移图，其中每个样品重复测三次；

图39为重复性实验中三种不同基因型的检测样品的hrmgenescanning分析差减曲线图，其中每个样品重复测三次。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细阐述本发明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

以下对本发明的一些专用术语及符号进行解释说明：

在本发明中，术语“引物”是两段寡核苷酸序列，可以是天然的也可以是合成的，一个引物与目的基因一端的一条dna模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条dna模板链互补。引物可以作为在一定条件下诱发dna合成的起始点，在一定条件下可以诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种脱氧核糖核酸及一种聚合试剂（即dna聚合酶）存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。

术语“pcr扩增”，即聚合酶链式反应（又称：多聚酶链式反应），是一种体外dna扩增技术，是在模板dna、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于dna聚合酶的酶促合反应，将待扩增的dna片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使dna片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

术语“snp”是单核苷酸多态性，是指在基因组上由单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看，每一个snp位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。一般而言，snp是指变异频率大于1%的单核苷酸变异。

说明书及权利要求书中出现的“2xhrmanalysispremix”、“2xtaqpcrmastermix”等中的2x表示两倍浓度。“premix”、“mastermix”均为预混液，指在进行pcr扩增反应时，除了dna模板、引物以及rnase-freeddh2o之外的反应液，一般包括dntp、酶、缓冲液等。

β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的建立

（一）dna提取

采集样本（血液、毛囊、精液等）提取dna，dna的提取方法可以使用任何已经公开的采集方法或商品化的提取试剂盒，例如苯酚氯仿抽提法、离心柱法、磁珠法、血液dna提取试剂盒等。本实验中，申请人使用血液dna提取试剂盒从血液样本中提取dna，血液dna提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，目录号为dp348。dna提取步骤如下：

（1）取200μl待检奶牛血样，加入200μl缓冲液gb和20μlproteinasek的预混溶液，充分颠倒混匀，56℃放置10分钟，其间颠倒混匀数次，溶液变清亮。

（2）室温放置2～5分钟后加入350μl缓冲液bd，充分颠倒混匀。

（3）将上一步所得溶液加入到一个吸附柱cg2中（吸附柱cg2放入收集管中），12000rpm（～13400×g）离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2放入收集管中。

（4）向吸附柱cg2中加入500μl缓冲液gdb，12000rpm（～13400×g）离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2放入收集管中。

（5）向吸附柱cg2中加入600μl漂洗液pwb（使用前加入适量无水乙醇），12000rpm（～13400×g）离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2放入收集管中。

（6）重复操作步骤（5）。

（7）12000rpm（～13400×g）离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cg2置于室温放置2分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（8）将吸附柱cg2转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱缓冲液tb，室温放置2分钟，12000rpm（～13400×g）离心2分钟，将溶液收集到离心管中。该溶液即为dna溶液。

（二）dna的pcr扩增

将奶牛采用上述dna提取方法进行dna提取，并以获得的dna溶液为dna模板进行pcr扩增。

pcr扩增体系可以使用任何已经公开的适于进行hrm分析的反应体系或商品化的hrm分析试剂盒。本实验中，申请人使用evagreen染料试剂盒进行pcr扩增，evagreen染料试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，目录号为fp210。

20μl的pcr扩增反应体系中各组分的含量如下：

2xhrmanalysispremix：10μl；

10μm的上游引物：0.6μl；

10μm的下游引物：0.6μl；

50ng/μl的dna模板：1μl；

rnase-freeddh2o：补齐至20μl。

其中，上游引物的序列为5’-atccacccctttgcccagac-3’，下游引物的序列为5’-ggggtttgagtaagaggaggg-3’。2xhrmanalysispremix包括500μmdntp、0.1udna聚合酶、饱和荧光染料、20mmtris-hcl、100mmkcl及3mmmgcl2。其中饱和荧光染料为evagreen染料。

pcr扩增反应可以按以下步骤进行：

（1）95℃2分钟；

（2）95℃10秒，60℃30秒，共进行40个循环。

（三）hrm检测及结果分析

对上述pcr扩增产物使用hrm检测方法进行基因型分析，产物熔解程序设定为：95℃10秒，40℃10秒，85℃1秒，40℃30秒，溶解速率为0.05℃/秒，信号检测频率为12次/℃。

实验中pcr扩增及hrm检测使用lightcycler®480仪器（罗氏公司）运行，genescanning方法分析。

使用上述“β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的建立”中的体系、方法及步骤对a1a1型、a2a2型、a1a2型β-酪蛋白基因进行检测，其中a1a1型、a2a2型、a1a2型β-酪蛋白基因由下述“β-酪蛋白基因分型的基因测序方法”确定。图1和图2分别为hrm检测的温度漂移曲线及差减曲线。如图1和图2所示，曲线1-1、2-1代表a1a1型β-酪蛋白基因（突变型纯合子），曲线1-2、2-2代表a2a2型β-酪蛋白基因（野生型纯合子），曲线1-3、2-3代表a1a2型β-酪蛋白基因（杂合子），代表三种基因型β-酪蛋白基因的曲线差异明显，能够很好的区分三种基因型。

在上述pcr扩增反应的反应液中使用的dna模板的浓度为50ng/μl，dna模板的浓度根据dna提取方法的不同也可以为其它浓度，只要保证反应液中dna的最终含量为50ng即可。dna模板的浓度也可以根据需要稀释为特定的浓度，dna浓度测量及稀释可以使用本技术领域公知的方法及仪器进行，例如核酸测定仪、分光光度计等。

本发明的hrm检测方法使用普通的pcr仪即可满足检测需求，无需额外购买荧光探针、特殊的酶及预混液，简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。

用于β-酪蛋白基因分型的hrm检测的引物设计与筛选

发明人通过大量筛选，惊奇的发现本发明的下列引物对β-酪蛋白基因具有良好的特异性，并且用于hrm检测时，能够有效提高hrm检测曲线的分辨率。为了说明本发明的引物的优点，发明人设计了以下实验。

本发明的引物序列如下：

上游引物：5’-atccacccctttgcccagac-3’，下游引物：5’-ggggtttgagtaagaggaggg-3’。

（一）引物设计

根据ncbi上已公布的β-酪蛋白基因序列（seqidno.3），利用primer5引物设计工具（加拿大premier公司）设计如表1所示的12组特异性引物：

表1

所有引物的扩增序列涵盖β-酪蛋白的突变位点，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（二）引物的扩增特异性

1.dna提取及扩增

使用血液dna提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）按照上述步骤提取奶牛血液dna制备dna模板。之后分别采用上述表1中的12对引物对dna模板进行pcr扩增制得dna样品。pcr扩增反应使用lightcycler®480（罗氏公司）仪器进行，采用与“β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的建立”中相同的pcr扩增反应体系及步骤。

2.电泳分析

将上述12个pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，具体步骤如下：

（1）称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50mltbe缓冲液，微波加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，得到1%琼脂糖凝胶；

（2）将上述溶液倒入制胶模中，在适当位置插上梳子，室温下使其凝固；

（3）将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加电泳缓冲液至没过胶板1-2㎜为止。分别取2μldna样品与10μl6x上样缓冲液混匀得稀释后的dna样品，每个上样孔分别加入10μlmarker和稀释后的dna样品；

（4）加样完成后，合上电泳槽盖，立即接通电源。电压保持在110v，电流50ma；

（5）当条带移动到距凝胶前沿约2cm时（约40分钟），停止电泳。紫外下拍照并观察。

电泳分析结果如图3a、图3b所示。图3a、图3b中m为marker（购自天根生化科技（北京）有限公司，货号为md101），图3a中泳道1-8分别为使用编号1-8的引物进行pcr扩增后得到的产物，图3b中泳道9-12分别为使用编号9-12的引物进行pcr扩增后得到的产物。由图3a、图3b可以看出，使用编号为5、6、7、9、11、12的这6对引物进行pcr扩增后得到的产物的电泳条带单一，说明编号为5、6、7、9、11、12的这6对引物可以得到较单一的dna片段，特异性好、扩增效果好。

3.引物的hrm检测灵敏性

使用“β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的建立”中的体系、方法及步骤分别采用编号为5、6、7、9、11、12的6对引物对上述血液dna进行pcr扩增及hrm检测。

采用编号为5的引物对dna进行pcr扩增后的hrm检测结果如图4、图5所示。图4为hrm检测的温度漂移曲线，由图4可以看出代表三种基因型β-酪蛋白基因的三条曲线无法分开，无法有效区分三种基因型。图5为hrm检测的差减曲线，由图5可以看出代表三种基因型β-酪蛋白基因的三条曲线虽然能够分开，但是三者之间仅有不到1的差异，曲线差异不明显，无法有效区分三种基因型。

采用编号为6的引物（即本发明“β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的建立”中所使用的引物）对dna进行pcr扩增后的hrm检测结果如图1、图2所示，图1和图2分别为hrm检测的温度漂移曲线及差减曲线。图1和图2中，曲线1-1、2-1代表a1a1型β-酪蛋白基因（突变型纯合子），曲线1-2、2-2代表a2a2型β-酪蛋白基因（野生型纯合子），曲线1-3、2-3代表a1a2型β-酪蛋白基因（杂合子），可以看出代表三种基因型β-酪蛋白基因的曲线差异明显，能够很好的区分三种基因型。

采用编号为7的引物对dna进行pcr扩增后的hrm检测结果如图6、图7所示，图6和图7分别为hrm检测的温度漂移曲线及差减曲线，可以看出代表三种基因型β-酪蛋白基因的曲线中，有两条曲线几乎不能分开，差异不明显，无法有效区分三种基因型。

采用编号为9的引物对dna进行pcr扩增后的hrm检测结果如图8、图9所示。图8为hrm检测的温度漂移曲线，由图8可以看出，代表三种基因型β-酪蛋白基因的曲线无法分开，无法有效区分三种基因型。图9为hrm检测的差减曲线，可以看出代表三种基因型β-酪蛋白基因的曲线差异不明显，其中两条几乎重叠，无法有效区分三种基因型。

采用编号为11的引物对dna进行pcr扩增后的hrm检测结果如图10、图11所示。图10和图11分别为hrm检测的温度漂移曲线及差减曲线，可以看出代表三种基因型β-酪蛋白基因的曲线中，有两条几乎无法分开，差异不明显，无法有效区分三种基因型。

采用编号为12的引物对dna进行pcr扩增后的hrm检测结果如图12、图13所示，图12和图13分别为hrm检测的温度漂移曲线及差减曲线，可以看出代表三种基因型β-酪蛋白基因的曲线中，有两条几乎无法分开，差异不明显，无法有效区分三种基因型。

上述实验结果显示，扩增效果好的编号为5、6、7、9、11、12的引物中，只有编号为6的引物能有效区分三种基因型。

其中，编号为7、9、11、12的引物与编号为6的引物扩增片段长度均在100bp左右，尤其是编号为11的引物（扩增片段长度为101bp）与编号为6的引物（扩增片段长度为98bp）扩增片段长度仅相差3bp，但是另人意想不到的是，只有编号为6的引物在表现出对β-酪蛋白基因优异的特异性的同时，能灵敏有效地区分三种基因型。

综上，编号为6的本发明的下述引物不仅能够特异性扩增β-酪蛋白，且在hrm检测中能够有效区分三种基因型，灵敏度高。

上游引物：5’-atccacccctttgcccagac-3’，

下游引物：5’-ggggtttgagtaagaggaggg-3’。

β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的准确性分析

随机选择22头奶牛，对其进行编号。采用上述dna提取步骤，提取上述奶牛的血液dna两份。将上述22头奶牛的血液dna样本分别使用下述“β-酪蛋白基因分型的基因测序方法”及本发明hrm检测方法，即“β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的建立”中的体系、方法及步骤进行分型检测。

（一）β-酪蛋白基因分型的基因测序方法

使用上述dna提取方法提取待检奶牛的血液dna，并使用lightcycler®480（罗氏公司）仪器进行pcr扩增，其中pcr扩增的引物为：

上游引物：acccttgattccattcagtctctga(seqidno.26)；

下游引物：tggagaaggaggcttgggag(seqidno.27)。

扩增体系为10μl2xtaqpcrmastermix（成分为0.1utaq聚合酶、500μmdntp、20mmtris-hcl、100mmkcl、3mmmgcl2）（天根生化科技（北京）有限公司，目录号：kt201）、10μm的上游引物0.5μl、10μm的下游引物0.5μl、dna1μl、ddh2o8μl。

扩增反应步骤为：

（1）94℃5分钟；

（2）94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，共进行40个循环；

（3）72℃10分钟。

之后将上述扩增后的产物由测序公司（北京诺赛基因组研究中心有限公司）进行测序。

（二）本发明的hrm检测方法及基因测序方法的比较

22头奶牛hrm检测的温度漂移曲线及差减曲线见图14、图15，如图所示，在上述22头奶牛中共检测出野生型纯合子奶牛9头（a、a’），杂合子奶牛10头（b、b’），突变型纯合子奶牛3头（c、c’）。各奶牛编号以及对应的基因型结果如表2所示。

基因测序方法检测出的1-22号奶牛β-酪蛋白dna序列见序列表中的序列seqidno.28～seqidno.49，1-22号奶牛β-酪蛋白的67位测序结果图如图16-37所示。基因测序分型结果见表2。

通过序列seqidno.28～seqidno.49及图16-37可以看出编号为1-9共9头奶牛β-酪蛋白的67位氨基酸为脯氨酸（密码子为cct），为野生型纯合子奶牛；编号为20-21共有3头奶牛β-酪蛋白的67位氨基酸为组氨酸（密码子为cat），为突变型纯合子奶牛；编号10-19共有10头奶牛β-酪蛋白的67位氨基酸为一个杂合子（序列为cc/at，该序列在后附的核苷酸序列表中显示为cmt），为杂合子奶牛。

表2

由表2可知，本发明的hrm检测结果与基因测序分型检测结果一致，准确率100%，说明本发明的hrm检测方法及用于本发明方法的引物可靠高效、准确性强。

β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的重复性分析

从上述22头奶牛样本中选取编号为1、10、20的奶牛样本，采用本发明的hrm检测方法进行检测。每个样本重复检测3次，hrm检测的温度漂移曲线及差减曲线见图38、图39，如图所示，编号为1的野生型纯合子奶牛（d、d’）、编号为10杂合子奶牛（e、e’）、编号为20的突变型纯合子奶牛（f、f’）的不同重复之间结果一致。并且每个样本的本次检测结果与准确性分析中的检测结果也一致，说明该反应体系、条件和引物重复性好。

β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法的可行性分析

上述检测所用样本为奶牛全血样本，使用含有edta抗凝剂的采血管采血，室温下保存并运送到检测实验，耗时5天，血样置于-20℃条件下保存一周后提取dna，dna样本于-20℃条件下保存30天，之后按照本发明中的方法进行基因分型，通过测序分析证明该方法得到的结果是可靠的。

实践中，牧场通常不具备自己检测的能力，需要将样本交给有能力的实验室，上述样本保存和运输的过程完全可以满足实践中的实际操作要求，该条件下保存和提取得到的dna完全满足检测需求，并得到可靠的结果。说明该方法在实践中的可行性高。

序列表

<110>北京向中生物技术有限公司

<120>一种β-酪蛋白基因分型的hrm检测方法及引物

<160>49

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atccacccctttgcccagac20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggggtttgagtaagaggaggg21

<210>3

<211>1560

<212>dna

<213>奶牛(bostaurus)

<400>3

ctcaagattaccaccttctaccaagagaagtagtgctagaagttggccattgttaaggaa60

ctccttgaattaaaaaaacacatattaagacttagttttcattaaaacaaacaaaaataa120

acctcagagtaacttttaaagtctttttaaaatggatctttctttgttatatgaaaccag180

tttggactattatccaaagtatgtagctaccactctgcaggcaactcaggaagaggtgga240

ataagtgttgaaatctccaaaccctgatttcacttgactctctgatttcacctgtgaaga300

aagtgggttaatgagaaatccttcagtgagcattttactcattagtcttcatatgacccc360

aatttcttaaccaaaccaaatggaagattttctttctctctcttcactgaattatgtttt420

aaaaagaggaggataattcatcatgaataacaattataactggattatggactcaaagat480

ttgttttccttctttccaggatgaactccaggataaaatccacccctttgcccagacaca540

gtctctagtctatcccttccctgggcccatccctaacagcctcccacaaaacatccctcc600

tcttactcaaacccctgtggtggtgccgcctttccttcagcctgaagtaatgggagtctc660

caaagtgaaggaggctatggctcctaagcacaaagaaatgcccttccctaaatatccagt720

tgagccctttactgaaagccagagcctgactctcactgatgttgaaaatctgcaccttcc780

tctgcctctgctccagtcttggatgcaccagcctcaccagcctcttcctccaactgtcat840

gtttcctcctcagtccgtgctgtccctttctcagtccaaagtcctgcctgttccccagaa900

agcagtgccctatccccagagagatatgcccattcaggcctttctgctgtaccaggagcc960

tgtactcggtcctgtccggggacccttccctattattgtaagtctaaatttactaactgt1020

gctgtttaacttctgatgtttgtatgatattcgagtaattaagagtcctataaaaaaatg1080

aataatgaatggttccaaaataagcatagctgagattaatgattgtcagcattagttata1140

aatagaataagctggagaactttcacctcccctccaccaccagatctcaatgtctaggct1200

tacccgtggagattctgatgtaattgttctttctatgtagaagaaacttattgggaagaa1260

ataatataatggactatgatttaattggtctgttgagaccaattaaattagatgaaggcg1320

attaaggtacaataaagccagaattgaatttgataatctcatttggctaagaataacaaa1380

cctaagaaggtttgctattttctacaattttgaagttctccttatgcacaattatttcac1440

cacatgactcatttcacatcttgtttttgatatatgagcatatgagggaaaaatactgag1500

atgcttatttcaatactcagggaaaattttcttgccaaaaggcaagaattgtataaatca1560

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gggttaatgagaaatccttcagtg24

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

actggatatttagggaagggca22

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tccaaaccctgatttcacttgact24

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cagttggaggaagaggctggt21

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

taaaatccacccctttgccc20

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gccatagcctccttcactttg21

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

taaaatccacccctttgccc20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gacagttggaggaagaggct20

<210>12

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

acccttgattccattcagtctctga25

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tggagaaggaggcttgggag20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

taaaatccacccctttgccc20

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

ggggtttgagtaagaggaggg21

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

ctagtctatcccttccctgg20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

aaggtgcagattttcaacat20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

aaaatccacccctttgccca20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

gggatgttttgtgggaggct20

<210>20

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

cacccctttgcccagacac19

<210>21

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

ggggtttgagtaagaggaggg21

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

aaaatccacccctttgccca20

<210>23

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

ggggtttgagtaagaggaggg21

<210>24

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

tctctagtctatcccttccctgg23

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

ggagactcccattacttcaggc22

<210>26

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

acccttgattccattcagtctctga25

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

tggagaaggaggcttgggag20

<210>28

<211>539

<212>dna

<213>奶牛(bostaurus)

<400>28

ctttattagagtgggttatgagaatccttcagtgagcattttactcattagtcttcatat60

gaccccaatttcttaaccaaaccaaatggaagattttctttctctctcttcactgaatta120

tgttttaaaaagaggaggataattcatcatgaataacaattataactggattatggactc180

aaagatttgttttccttctttccaggatgaactccaggataaaatccacccctttgccca240

gacacagtctctagtctatcccttccctgggcccatccctaacagcctcccacaaaacat300

ccctcctcttactcaaacccctgtggtggtgccgcctttccttcagcctgaagtaatggg360

agtctccaaagtgaaggaggctatggctcctaagcacaaagaaatgcccttccctaaata420

tccagttgagccctttactgaaagccagagcctgactctcactgatgttgaaaatctgca480

ccttcctctgcctctgctccagtcttggatgcaccagcctcaccagcctcttcctccaa539

<210>29

<211>538

<212>dna

<213>奶牛(bostaurus)

<400>29

cttcgagagtgggttatgagaatccttcagtgagcattttactcattagtcttcatatga60

ccccaatttcttaaccaaaccaaatggaagattttctttctctctcttcactgaattatg120

ttttaaaaagaggaggataattcatcatgaataacaattataactggattatggactcaa180

agatttgttttccttctttccaggatgaactccaggataaaatccacccctttgcccaga240

cacagtctctagtctatcccttccctgggcccatccctaacagcctcccacaaaacatcc300

ctcctcttactcaaacccctgtggtggtgccgcctttccttcagcctgaagtaatgggag360

tctccaaagtgaaggaggctatggctcctaagcacaaagaaatgcccttccctaaatatc420

cagttgagccctttactgaaagccagagcctgactctcactgatgttgaaaatctgcacc480

ttcctctgcctctgctccagtcttggatgcaccagcctcaccagcctccttcctccaa538

<210>30

<211>538

<212>dna

<213>奶牛(bostaurus)

<400>30

tcttccagagtgggttatgagaatccttcagtgagcattttactcattagtcttcatatg60

accccaatttcttaaccaaaccaaatggaagattttctttctctctcttcactgaattat120

gttttaaaaagaggaggataattcatcatgaataacaattataactggattatggactca180

aagatttgttttccttctttccaggatgaactccaggataaaatccacccctttgcccag240

acacagtctctagtctatcccttccctgggcccatccctaacagcctcccacaaaacatc300

cctcctcttactcaaacccctgtggtggtgccgcctttccttcagcctgaagtaatggga360

gtctccaaagtgaaggaggctatggctcctaagcacaaagaaatgcccttccctaaatat420

ccagttgagccctttactgaaagccagagcctgactctcactgatgttgaaaatctgcac480

cttcctctgcctctgctccagtcttggatgcaccagcctcaccagccccttcctccaa538

<210>31

<211>543

<212>dna

<213>奶牛(bostaurus)

<400>31

ccttatcagagtgggttatgagaatccttcagtgagcattttactcattagtcttcatat60

gaccccaatttcttaaccaaaccaaatggaagattttctttctctctcttcactgaatta120

tgttttaaaaagaggaggataattcatcatgaataacaattataactggattatggactc180

aaagatttgttttccttctttccaggatgaactccaggataaaatccacccctttgccca240

gacacagtctctagtctatcccttccctgggcccatccctaacagcctcccacaaaacat300

ccctcctcttactcaaacccctgtggtggtgccgcctttccttcagcctgaagtaatggg360

agtctccaaagtgaaggaggctatggctcctaagcacaaagaaatgcccttccctaaata420

tccagttgagccctttactgaaagccagagcctgactctcactgatgttgaaaatctgca480

ccttcctctgcctctgctccagtcttggatgcaccagcctcaccagcctccttcctccaa540

ata543

<210>32

<211>539

<212>dna

<213>奶牛(bostaurus)

<400>32

ctgagcagaagtgggttatgagaatccttcagtgagcattttactcattagtcttcatat60