本发明涉及分子生物学及玉米育种技术领域，特别涉及玉米籽粒淀粉含量分子标记技术领域，具体是指一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记及应用。
背景技术
玉米(zeamaysl.)是世界上最重要的作物之一，已经成为我国第一大粮食作物。随着人口的急剧增加和耕地面积的不断减少，玉米等粮食作物需要大幅提高产量来满足人类的需求。玉米单产的提高是解决耕地减少带来的粮食总量降低问题的主要技术手段。在玉米育种中，单产的提高除了依赖种植密度的增加外，籽粒重量也是影响产量的重要因素。
淀粉占玉米籽粒重的70％左右，是人类与动物食物和营养的主要能量来源，而且可用于生产生物乙醇，在工业应用中也占有重要地位。改良玉米籽粒淀粉含量不仅有助于提高玉米籽粒的产量和品质，并且有益于推动其工业应用。随着世界人口数目的不断增加以及对生物燃料需求的持续增大，对玉米籽粒淀粉的改良越来越突显出其重要性。
随着分子生物学技术的发展，尤其是分子标记的广泛应用，可以对数量性状相关基因位点进行分析。有关玉米籽粒相关性状的qtl定位研究也引起了关注。由于受定位群体类型、所用遗传连锁图谱精度以及籽粒淀粉含量鉴定方法等方面的限制，获得的与籽粒淀粉含量相关qtl的数量、加性效应和染色体区段存在很大差异，在不同环境和群体中难以重复，难以确定真正影响籽粒淀粉含量的基因并获得可用于育种的分子标记。
因此，需要提供一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记，其可以检测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以预测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以对玉米籽粒淀粉含量的高低进行有效选择，还可以用于高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种，加速玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记，其可以检测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以预测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以对玉米籽粒淀粉含量的高低进行有效选择，还可以用于高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种，加速玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记的应用，其可以用于检测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以用于预测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以用于对玉米籽粒淀粉含量的高低进行有效选择，还可以用于高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种，加速玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供了一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记，其特征在于，所述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记包括第一分子标记和第二分子标记，所述第一分子标记包括seqidno:1和seqidno:2所示的第一引物对，所述第二分子标记包括seqidno:3和seqidno:4所示的第二引物对。
在本发明的第二方面，提供了一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点，其特点是，所述玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点位于玉米的第9染色体的第一分子标记和第二分子标记之间，所述第一分子标记包括seqidno:1和seqidno:2所示的第一引物对，所述第二分子标记包括seqidno:3和seqidno:4所示的第二引物对，所述玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点与所述第一分子标记之间的遗传距离为4.1cm，所述玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点与所述第二分子标记之间的遗传距离为4.5cm。
较佳地，所述玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点对玉米籽粒淀粉含量的贡献率为12.8％。
在本发明的第三方面，提供了一种利用分子标记检测玉米籽粒淀粉含量高低的方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)提取待测玉米的基因组dna；
(2)分别采用上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记对所述基因组dna进行pcr扩增；
(3)如果采用所述第一分子标记扩增出201bp扩增产物，且采用所述第二分子标记扩增出110bp扩增产物，则所述待测玉米为高籽粒淀粉含量玉米，否则，所述待测玉米为低籽粒淀粉含量玉米。
在本发明的第四方面，提供了一种利用分子标记辅助高籽粒淀粉含量玉米育种的方法，其特点是，包括以下步骤：
(a)提取待测玉米的基因组dna；
(b)分别采用上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记对所述基因组dna进行pcr扩增；
(c)如果采用所述第一分子标记扩增出201bp扩增产物，且采用所述第二分子标记扩增出110bp扩增产物，则所述待测玉米为高籽粒淀粉含量玉米，将所述高籽粒淀粉含量玉米应用于玉米品质育种。
在本发明的第五方面，提供了上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记在检测玉米籽粒淀粉含量的高低中的应用。
在本发明的第六方面，提供了上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记在预测玉米籽粒淀粉含量的高低中的应用。
在本发明的第七方面，提供了上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记在对玉米籽粒淀粉含量的高低进行选择中的应用。
在本发明的第八方面，提供了上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记在高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种中的应用。
本发明的有益效果主要在于：
1、本发明的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记包括第一分子标记和第二分子标记，所述第一分子标记包括seqidno:1和seqidno:2所示的第一引物对，所述第二分子标记包括seqidno:3和seqidno:4所示的第二引物对，如果这两个分子标记均存在，则所述待测玉米为高籽粒淀粉含量玉米，否则，所述待测玉米为低籽粒淀粉含量玉米，因此，其可以检测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以预测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以对玉米籽粒淀粉含量的高低进行有效选择，还可以用于高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种，加速玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
2、本发明的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记包括第一分子标记和第二分子标记，所述第一分子标记包括seqidno:1和seqidno:2所示的第一引物对，所述第二分子标记包括seqidno:3和seqidno:4所示的第二引物对，如果这两个分子标记均存在，则所述待测玉米为高籽粒淀粉含量玉米，否则，所述待测玉米为低籽粒淀粉含量玉米，因此，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
3、本发明的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记的应用可以用于检测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以用于预测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以用于对玉米籽粒淀粉含量的高低进行有效选择，还可以用于高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种，加速玉米优良品质育种的进程，适于大规模推广应用。
4、本发明的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记的应用可以用于检测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以用于预测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以用于对玉米籽粒淀粉含量的高低进行有效选择，还可以用于高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种，加速玉米优良品质育种的进程，设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明、附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
图1是玉米籽粒淀粉含量在ril群体各株系中的分布情况。
图2是本发明中利用ril群体定位玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点q9.1的遗传图谱，其中*表示连锁图的起止位置。
图3为第一分子标记jaas5504在重组自交系中pcr扩增后的一部分2％琼脂糖凝胶电泳图。
图4是第二分子标记umc1867在重组自交系中pcr扩增后的一部分2％琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记，利用其可以有效地对玉米籽粒品质进行高效改良。
本发明的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记包括第一分子标记和第二分子标记，所述第一分子标记包括seqidno:1和seqidno:2所示的第一引物对，所述第二分子标记包括seqidno:3和seqidno:4所示的第二引物对。
本发明还提供了一种玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点，位于玉米的第9染色体的第一分子标记和第二分子标记之间，所述第一分子标记包括seqidno:1和seqidno:2所示的第一引物对，所述第二分子标记包括seqidno:3和seqidno:4所示的第二引物对，所述玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点与所述第一分子标记之间的遗传距离为4.1cm，所述玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点与所述第二分子标记之间的遗传距离为4.5cm。
较佳地，所述玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点对玉米籽粒淀粉含量的贡献率为12.8％。
本发明还提供了一种利用分子标记检测玉米籽粒淀粉含量高低的方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)提取待测玉米的基因组dna；
(2)分别采用上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记对所述基因组dna进行pcr扩增；
(3)如果采用所述第一分子标记扩增出201bp扩增产物，且采用所述第二分子标记扩增出110bp扩增产物，则所述待测玉米为高籽粒淀粉含量玉米，否则，所述待测玉米为低籽粒淀粉含量玉米。
既然可以确定所述待测玉米是否为高籽粒淀粉含量玉米，则上述方法显然还可以用于预测玉米籽粒淀粉含量的高低，还可以用于对玉米籽粒淀粉含量的高低进行选择。
本发明还提供了一种利用分子标记辅助高籽粒淀粉含量玉米育种的方法，其是在上述获得高籽粒淀粉含量玉米的情况下，将该高籽粒淀粉含量玉米应用于玉米品质育种。
本发明还提供了上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记在检测玉米籽粒淀粉含量的高低中的应用。
本发明还提供了上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记在预测玉米籽粒淀粉含量的高低中的应用。
本发明还提供了上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记在对玉米籽粒淀粉含量的高低进行选择中的应用。
本发明还提供了上述的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记在高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种中的应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点q9.1的定位
(1)玉米重组自交系(recombinantinbredline，ril)群体的构建及籽粒淀粉含量的测量
利用高籽粒淀粉含量美国玉米自交系b73与低籽粒淀粉含量美国玉米自交系mo17杂交，获得的f1经过4次交互授粉后连续自交形成包含302个家系的重组自交系群体(获得自江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所)。将ril群体302个株系、高籽粒淀粉含量亲本b73以及低籽粒淀粉含量亲本mo17按照随机区组设计分别于2013和2014年种植于江苏省农科院六合试验基地及海南乐东试验基地，每个地点设三个重复。各基因型材料按照单行种植，株距30cm，行距60cm，正常田间管理。出苗后，采集ril群体及亲本的叶片组织提取dna。
待籽粒生理成熟后，收获重组自交系的成熟穗。每株系取10个单株混合取样，依据3,5-二硝基水杨酸(dns)法(millergl.useofdinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugar.analyticalchemistry1959,31:426-428)，使用verter22/n近红外分析仪(pertenda7200)测量淀粉含量；对表型极端个体使用淀粉测定试剂盒(爱尔兰megazyme公司，货号k-tsta)进行验证。籽粒淀粉含量在重组自交系群体各株系中的分布如图1所示。
(2)indel(insertion/deletion)标记的开发和遗传连锁图谱的构建
下载b73全基因组序列(第三版)(http://www.maizegdb.org)和mo17原始测序序列(http://www.maizegdb.org)，通过solexaqa软件(http://solexaqa.sourceforge.net/)利用q20标准除去质量低的序列(coxmp,petersonda,biggspj(2010)solexaqa:at-a-glancequalityassessmentofilluminasecond-generationsequencingdata.bmcbioinformatics11:485)，然后使用bowtie2软件(v2.1.0)(langmeadb,trapnellc,popm,salzbergsl(2009)ultrafastandmemory-efficientalignmentofshortdnasequencestothehumangenome.genomebiol10:r25)组装序列。为获得在基因组中只会扩增单一条带的特异性分子标记，在分析过程中删除了可在b73基因组上对应多个位点的mo17序列。利用primerv.3软件按照软件默认参数设计引物(rozens,skaletskyh(1999)primer3onthewwwforgeneralusersandforbiologistprogrammers.in:bioinformaticsmethodsandprotocols.springer,pp365-386)，将这些引物在玉米自交系b73、mo17之间进行pcr扩增，通过2％的琼脂糖凝胶筛选出在b73、mo17基因组间扩增条带清晰、无非特异性扩增的共显性indel标记，共设计了超过450对引物，筛选出265对引物整合进了分子标记连锁图，该265对引物包括jaas5504引物对：
forward:5’-accgaccttcatcctgtttcag-3’
reverse:5’-cgcatgtcacaagccttttcc-3’。
对上述步骤(1)提取的重组自交系群体的dna，利用筛选的多态性indel标记进行pcr扩增，通过2％的琼脂糖凝胶电泳获得重组自交系群体的indel标记基因型。结合重组自交系群体的公共标记基因型(http://www.maizegdb.org/data_center/qtl-data)，利用qtlicimapping(v4.1)软件(mengl,lih,zhangl,wangj(2015)qtlicimapping:integratedsoftwareforgeneticlinkagemapconstructionandquantitativetraitlocusmappinginbiparentalpopulations.thecropjournal3:269-283)对这些分子标记进行分群、排序并计算遗传距离(kosambi)。分子标记间的连锁阈值设为3.0，经过分析，构建的遗传图谱共有1092个分子标记，覆盖了玉米的10个染色体，总遗传距离达到了6070.76cm，分子标记间平均遗传距离为5.56cm。
(3)qtl分析
利用qtlicimapping软件的icim-add模型进行完备区间作图(inclusivecompositeintervalmapping，icim)分析籽粒淀粉含量qtl的遗传位置及遗传效应。以0.5cm的步移扫描全基因组，抽样1000次迭代值模拟确定qtl的显著阈值(lod)。请参见图2所示，完备区间作图分析表明在玉米第9染色体9.01bin上存在一个玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点，介于分子标记jaas5504和umc1867(http://www.maizegdb.org/data_center/ssr？id＝301328)之间，玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点与分子标记jaas5504之间的遗传距离为4.1cm，玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点与分子标记umc1867之间的遗传距离为4.5cm。
分子标记jaas5504包括上述jaas5504引物对：
forward:5’-accgaccttcatcctgtttcag-3’
reverse:5’-cgcatgtcacaagccttttcc-3’
分子标记umc1867包括一对引物对：
forward:5’-tggtcttcttcgccgcattat-3’
reverse:5’-ataagctcgttgatctcctcctcc-3’
该qtl对玉米籽粒淀粉含量表型的贡献率为12.8％，命名为q9.1，该qtl增加籽粒淀粉含量的等位基因来自亲本b73，可用于对玉米籽粒淀粉含量的预测。
实施例2、利用分子标记进行玉米籽粒淀粉含量选择应用
根据检测到的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点q9.1紧密连锁的分子标记jaas5504和umc1867，对高籽粒淀粉含量玉米自交系b73×低籽粒淀粉含量玉米自交系mo17杂交后衍生的包含302个家系的ril群体(即实施例1的重组自交系(ril)群体)进行pcr扩增反应。
pcr扩增反应体系为25μl反应体系：10×buffer2.5μl；dntp(10mm/ml)2μl；正反向引物(20μl)各0.5μl；taq酶(5u/μl)0.2μl；dna(200ng/μl)2.5μl；ddh2o16.8μl。
pcr反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃40s，72℃40s；35个循环，72℃10min，4℃保存。
图3和图4分别为jaas5504和umc1867在重组自交系中pcr扩增后的2％琼脂糖凝胶电泳图的部分截图。
在基因型数据齐全的122份ril家系中，能被jaas5504和umc1867的引物对pcr，分别产生201bp和110bp片段的家系有67个；能被jaas5504和umc1867的引物对pcr，能产生201bp但不能产生110bp片段的家系有10个；能被jaas5504和umc1867的引物对pcr，不能产生201bp但能产生110bp片段的家系有7个；能被jaas5504和umc1867的引物对pcr，均不能产生201bp和110bp片段的家系有38个(表1)。
表1两个分子标记基因型对应的家系数及其籽粒淀粉含量
注：+表示扩增出相应片段，-表示没有扩增出相应片段。
结合各家系籽粒淀粉含量性状测定数据表明(表1)，能同时扩增出201bp片段和110bp片段(具有与玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点q9.1紧密连锁的分子标记jaas5504和umc1867)的家系，其籽粒淀粉含量值较其他家系高，比不能同时扩增出201bp片段和110bp片段的家系高出5.3％，比仅能扩增出201bp片段的家系高2.2％，比仅能扩增出110bp片段的家系高2.9％。因此在育种中同时选择具有两个分子标记，即利用jaas5504标记引物进行pcr能得到201bp片段的扩增产物，并且利用umc1867标记引物进行pcr能得到110bp片段的扩增产物，则可显著提高籽粒淀粉含量，待测玉米种质为候选高籽粒淀粉含量的优质玉米。
该候选高籽粒淀粉含量的优质玉米可以进一步用于玉米品质育种。
因此，本发明通过qtl分析，在玉米第9号染色体9.01bin上检测到一个籽粒淀粉含量主效qtl位点q9.1，对玉米籽粒淀粉含量的贡献率为12.8％。该主效qtl位于indel标记jaas5504和ssr标记umc1867之间；根据上述两个与主效qtl位点紧密连锁的分子标记，可以用于检测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以用于预测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以对玉米籽粒淀粉含量的高低进行有效选择，同时可用于高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种，加速玉米优良品质育种的进程。
通过本发明公布的分子标记进行分子标记辅助选择，鉴定方法简单，选择效率高。只需检测分子标记的特征扩增条带，即可预测籽粒的淀粉含量。选择目标明确，不受环境的影响。可在玉米生育早期鉴定出高籽粒淀粉含量的玉米单株，淘汰其它单株。
综上，本发明的玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记可以检测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以预测玉米籽粒淀粉含量的高低，可以对玉米籽粒淀粉含量的高低进行有效选择，还可以用于高籽粒淀粉含量玉米的分子标记辅助育种，加速玉米优良品质育种的进程，设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>玉米籽粒淀粉含量主效qtl位点的分子标记及应用
<160>4
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(22)
<223>分子标记jaas5504的上游引物
<400>1
accgaccttcatcctgtttcag22
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>分子标记jaas5504的下游引物
<400>2
cgcatgtcacaagccttttcc21
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>分子标记umc1867的上游引物
<400>3
tggtcttcttcgccgcattat21
<210>4
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(24)
<223>分子标记umc1867的下游引物
<400>4
ataagctcgttgatctcctcctcc24