本发明涉及绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
近年来，我国新疆、辽宁、河北、四川、重庆、广西、贵州、湖南、福建等多个省份流行羊支原体性肺炎，其病原主要是绵羊肺炎支原体(mycoplasmaovipneumonia，mo)和丝状支原体山羊亚种(mycoplasmamycoidessubsp.capri,mmc)。近几年有多位学者报道同一羊群中出现两种以上支原体的混合感染现象,然而这两种病原引起的临床症状相似，病理变化相近,临床上难以区别，给疾病的确诊带来了极大困难。这两种病原是我国当前养羊业的主要疫病，给我国养羊业造成了巨大的经济损失。
绵羊肺炎支原体是羊支原体性肺炎的病原之一，主要临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症,临床上呈急性或慢性经过，病死率一般为30%～50%,有的高达80%～100%。绵羊肺炎支原体结构复杂、培养困难，目前仍缺乏有效的生前诊断和防治措施，给养羊业造成巨大经济损失。目前,该病广泛分布于世界各养羊地区,尤其是亚洲和非洲国家。
丝状支原体山羊亚种是丝状支原体簇的成员之一，是羊支原体性肺炎的病原之一。可引起山羊以高热、咳嗽渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，肺部有明显的肝变为主要特征的呼吸道疾病，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等。
目前关于绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种这两种病原的分子生物学诊断方法主要有单一pcr、双重pcr和单一荧光定量pcr方法,尚未见有双重荧光定量pcr同时检测这两种病原的报道。本发明提供快速、特异、灵敏的鉴别或同时检测绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr方法,适用于临床快速检测和大规模流行病学调查，有广阔的应用前景，具有重大的经济和社会效益。
技术实现要素：
由于绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种可同时感染羊，临床诊断难以区分，病原分离鉴定耗费耗力且很难分离mmc。本发明要解决的技术问题就是针对目前现有的两种病原单一pcr、双重pcr和单一荧光定量pcr检测技术的局限性，提供一种基于应用特异性引物能够快速、准确、同时检测这两种支原体的双重荧光定量pcr方法。
本发明将按以下技术方案解决上述存在问题：
设计检测绵羊肺炎支原体的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物mo-f:5’-cttcgggacttattggag-3’（如seqidno.1所示）；
下游引物mo-r:5’-gatgcaaactgatttacttg-3’（如seqidno.2所示）；
荧光探针mo-p:5’-fam-aagaccgattgtcaggccga–eclipse-3’（如seqidno.3所示）；
设计检测丝状支原体山羊亚种的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物mmc-f:5’-ctagctagcatagttgttg-3’；
下游引物mmc-r:5’-gcttgaacaactatattgta-3’；
荧光探针mmc-p:5’-tet-taacacagttaaagcagacccacca–bhq-3’。
进一步的，所述方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行双重荧光定量pcr反应条件的优化，建立双重荧光定量pcr检测体系；
（4）采用双重荧光定量pcr检测体系对支原体进行检测。
进一步的，制备阳性质粒标准品的具体过程包括：
a．合成用于制备阳性质粒标准品的引物；
mo引物：
上游引物p1：5’-cttcgggacttattggag-3’；
下游引物p2：5’-gatgcaaactgatttacttg-3’；
扩增目的片段为118bp；
mmc引物：
上游引物p3：5’-tgttgttggtgggtctgctt-3’；
下游引物p4：5’-actttatcagccgccatttga-3’；
扩增目的片段为163bp；
b．用商品化试剂盒分别提取绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种dna，分装保存于-70℃备用；
c．分别以绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种的dna模板进行pcr扩增反应，然后回收纯化扩增产物；
其中绵羊肺炎支原体的pcr扩增体系为含有模板、上游引物p1、下游引物p2、premixtaq酶、depc水；
扩增反应条件为：95℃预变性3min,95℃30s，55℃30s，72℃30s，37个循环，72℃延伸10min；
丝状支原体山羊肺炎亚种的pcr扩增体系为含有模板、上游引物p3、下游引物p4、premixtaq酶、depc水；
扩增反应条件为：95℃预变性3min,95℃30s，55℃30s，72℃30s，37个循环，72℃延伸10min；
d．将纯化后的绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种的pcr产物分别连接到载体pmd19-t上；再将连接后载体转入大肠杆菌感受态细胞；经pcr和双酶切鉴定，最后提取阳性质粒作为标准品。
进一步的，所述双重荧光定量pcr检测体系具体包括：常规方法提取待测样品dna，并以dna为模板进行双重荧光定量pcr反应。
所述双重荧光定量pcr反应的体系为含有模板、引物mo-f、引物mo-r、探针mo-p、引物mmc-f、引物mmc-r、探针mmc-p、premixextaq™(probeqpcr)和depc水。
所述双重荧光定量pcr反应的反应条件为：95℃30s；95℃5s，55℃30s，40个循环。
进一步的，所述双重荧光定量pcr反应条件的优化包括：
a．退火温度优化：以质粒为模板，在51℃-61℃进行梯度定量pcr，根据扩增反应ct、扩增曲线的荧光信号强度和溶解曲线筛选最佳退火温度；
b．引物、探针浓度的优化：以质粒为模板，引物和探针的浓度为5-20μm，进行荧光定量pcr，确定引物和探针的最佳浓度。
本发明的优点在于：
本发明建立的绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr方法可以同时检测和鉴别绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种两种支原体，具有操作简单、特异性强、重复性好等优点，不仅可以节约成本，还可为这两种支原体所引起的羊支原体性肺炎的早期快速检测和流行病学调查等研究提供有效手段。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr方法的标准曲线。
图2为本发明具体实施方式的绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr方法的特异性的扩增曲线。
图3为本发明具体实施方式的绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr方法的敏感性分析的扩增曲线。
具体实施方式
本发明具体实施方式中所采用的仪器和试剂主要包括：
微量移液器（1000μl、200μl、20μl、2.5μl）（德国eddendorf公司）
takarapcrthermalcyclerdice(tp600)梯度pcr仪（日本takara公司）；
geldoc™xr+凝胶成像系统（美国bio-rad公司）；
bio-radcfx96实时荧光定量pcr仪（美国bio-rad公司）；
dl2000marker、premixextaq™(probeqpcr)（宝生物工程有限公司）；
细菌基因组dna抽提试剂盒/组织dna提取试剂盒（生工生物工程有限公司）。
若未特别指明，下列具体实施方式均按照常规实验条件。
实施例1
一种用于绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr方法，包括：
（1）引物和探针的设计与合成：
根据genbank上公布的mop113基因和mmcmlc_1770基因序列，利用beacondesigner7.9软件，结合ncbiblast在线分析，分别设计出针对mo和mmc的两对特异性引物和探针，设计检测绵羊肺炎支原体的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物mo-f:5’-cttcgggacttattggag-3’；
下游引物mo-r:5’-gatgcaaactgatttacttg-3’；
荧光探针mo-p:5’-fam-aagaccgattgtcaggccga–eclipse-3’；
设计检测丝状支原体山羊亚种的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物mmc-f:5’-ctagctagcatagttgttg-3’；
下游引物mmc-r:5’-gcttgaacaactatattgta-3’；
荧光探针mmc-p:5’-tet-taacacagttaaagcagacccacca–bhq-3’。
（2）制备阳性质粒标准品：
a.合成用于制备阳性质粒标准品的引物；
mo引物：
上游引物p1：5’-cttcgggacttattggag-3’；
下游引物p2：5’-gatgcaaactgatttacttg-3’
扩增目的片段为118bp；
mmc引物：
上游引物p3：5’-tgttgttggtgggtctgctt-3’；
下游引物p4：5’-actttatcagccgccatttga-3’
扩增目的片段为163bp；
b.商品化试剂盒分别提取绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种dna，分装保存于-70℃备用；
c.分别以绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种的dna模板进行pcr扩增反应，然后回收纯化扩增产物；
其中绵羊肺炎支原体的pcr扩增体系为含有模板2μl、上游引物p1(10μmol/μl)、下游引物p2(10μmol/μl)、premixtaq酶10μl、depc水补足至20μl；
扩增反应条件为：95℃预变性3min,95℃30s，55℃30s，72℃30s，37个循环，72℃延伸10min；
丝状支原体山羊肺炎亚种的pcr扩增体系为含有模板2μl、上游引物p3(10μmol/μl)、下游引物p4(10μmol/μl)、premixtaq酶、depc水补足至20μl；
扩增反应条件为：95℃预变性3min,95℃30s，55℃30s，72℃30s，37个循环，72℃延伸10min；
d.回收纯化扩增产物使用axygen的dna柱式回收试剂盒进行胶回收；
e．制备阳性标准品质粒，具体包括：将纯化后的绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种的pcr产物分别连接到载体pmd19-t上；再将连接后载体转入大肠杆菌感受态细胞；经pcr和双酶切鉴定，最后提取阳性质粒作为标准品；
（3）进行双重荧光定量pcr反应条件的优化，建立双重荧光定量pcr检测体系：
a1．双重荧光定量pcr检测体系标准曲线的制作
将浓度为109copies/μl的绵羊肺炎支原体质粒标准品和浓度为109copies/μl的丝状支原体山羊亚种质粒标准品10倍梯度稀释后等量混合作为模板按优化后的反应体系与反应条件进行扩增，得到绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr方法的标准曲线（图1），由图可知每个反应体系中模板拷贝数在109-103copies/μl的范围内有很好的线性关系，相关系数分别为0.998和0.999，扩增效率分别为94.8%和97.0%；
a2．双重荧光定量pcr反应条件的优化
a．退火温度优化：以标准品质粒为模板，在51℃-61℃进行梯度pcr，根据扩增曲线ct值、扩增曲线的荧光信号强度和熔解曲线优化最佳退火温度；
b．引物和探针浓度的优化：以标准品质粒为模板，引物和探针浓度为5-20μm，进行荧光定量pcr，确定引物和探针的最佳浓度；
最终确定绵羊肺炎支原体引物和探针浓度分别为20μm0.6μl和10μm0.6μl，丝状支原体山羊亚种的引物和探针浓度分别为20μm0.4μl和10μm0.4μl，最佳退火温度为55℃；
a3.对建立的双重荧光定量pcr检测方法进行验证
a．双重荧光定量pcr检测方法特异性分析
所述双重荧光定量pcr反应的体系为含有模板(mo和mmc各1μl)、20μm引物mo-f0.6μl、20μm引物mo-r0.6μl、10μm探针mo-p0.6μl、20μm引物mmc-f0.4μl、20μm引物mmc-r0.4μl、10μm探针mmc-p0.4μl、premixextaq™(probeqpcr)12.5μl和depc水9μl。所述双重荧光定量pcr反应的反应条件为：95℃30s；95℃5s，55℃30s，40个循环。
应用本发明建立的双重荧光定量pcr检测方法，分别对绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶血性曼氏杆菌、精氨酸支原体、阴性对照进行检测，验证建立双重荧光定量pcr方法的特异性，结果表面除绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种有扩增曲线外，余未见扩增信号，表明本发明所建立的双重荧光定量pcr特异性强（图2）。
b．双重荧光定量pcr检测方法敏感性分析
用easydilution将分别将绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种质粒标准品按10倍梯度稀释成终浓度为1.0×1010--1.0×101copies/μl，等量混合后作为模板进行扩增，结果表明本发明建立的双重荧光定量pcr方法对绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种的检测下限均为102copies/μl（图3）。
c．双重荧光定量pcr检测方法的重复性分析
取108copies/μl、107copies/μl、106copies/μl这三个浓度梯度的标准品等量混匀后作为模板进行批内重复性试验和批间重复性试验。进行批内重复性试验时每个浓度梯度设置三个重复；批间重复试验每隔3d进行一次，每次每个浓度设置三个重复，共进行三次检测。根据所得的ct值计算均值(`x)、标准差（sd）及变异系数（cv），分析所建立的双重荧光定量pcr检测方法的重复性（表1）。
由表可知绵羊肺炎支原体的组内变异系数为0.23%～1.98%，组间变异系数为0.96%～1.31%；丝状支原体山羊亚种的组内变异系数为0.47%～1.16%，组间变异系数为0.60%～1.76%，说明该检测方法的重复性较好。
表1
（4）临床样品检测结果
应用所建立的绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量pcr检测方法对福建省内65份肺脏样品和122份鼻拭子样品进行检测，结果表明，检测出mo阳性率为47.6%（89/187），检测出mmc阳性率为11.8%（22/187），检测出两种病原混合感染的阳性率为10.2%（19/187），检测结果与病原分离结果基本一致。
最后应说明的是，以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
sequencelisting
<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量方法
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