本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法、发酵工艺与应用。
背景技术
衣康酸又称甲叉丁二酸、亚甲基琥珀酸，由于分子结构中含有两个羧基团、一个亚甲基、一个双键，决定了其具有十分活泼的化学性质，可以自身聚合，也可以和其他分子发生加成、聚合等化学反应，是一种应用前景十分广阔的化学合成中间体，广泛应用于化工、医药、造纸、印刷等领域(willkeetal.,2001；okabeetal.,2009)，2004年被美国能源局评为12种生物基平台化合物之一(werpyetal.,2004)。由于环保压力导致生物基材料需求的不断增加，到2020年衣康酸市场有望突破2.16亿美元(julianacunhadacruzetal,2018)。
当前，衣康酸主要采用土曲霉菌株发酵法生产(kuenzetal.,2012；antjehevekerletal.,2014)。研究推测土曲霉中的衣康酸合成途径为：衣康酸合成的前体为tca循化中间产物顺乌头酸，顺乌头酸是由顺乌头酸酶aco(acoa)催化柠檬酸合成的。在线粒体中的合成的顺乌头酸由线粒体转运蛋白mtt(mtta)转运至细胞胞质中，之后在顺乌头酸脱羧酶cad(cada)作用下脱羧生成衣康酸，然后可能由定位于细胞膜上的非特异性转运蛋白mfs(mfsa)转运出胞外(图1)(anlietal.,2011；okabeetal.,2009；klementandbüchs,2013,shinkanamasaetal.,2008)。相比酵母，土曲霉生长相对缓慢，且对剪切力的耐受性较差，同时缺乏基因工程工具，限制了土曲霉通过基因工程手段进一步改造成优良工程菌(peichingchangetal.,2017)。为此，研究人员开始尝试采用黑曲霉、大肠杆菌(
技术实现要素：
针对现有技术，本发明提供一株高产衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌株及其构建方法。同时，提供该工程菌株用于衣康酸发酵工艺。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一株高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株，其特点是：该工程菌株是表达了来自衣康酸高产土曲霉菌株hat418的cada和mtta基因的解脂耶氏酵母。
本发明的第二个方面，提供所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，该方法包括：
将cada和mtta与表达载体连接，制备得到含有目的基因的表达载体，再将表达载体转化进入解脂耶氏酵母细胞内，筛选获得携带cada和mtta基因并能够进行表达的解脂耶氏酵母工程菌株。
本发明的第三个方面，提供所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株在制备衣康酸中的应用。
本发明的第四个方面，提供所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株发酵生产衣康酸方法。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下技术效果：
(1)本发明通过crispr/cas9基因编辑技术和非同源重组技术实现了衣康酸高产土曲霉的顺乌头酸脱羧酶基因(cada)和线粒体顺乌头酸转运蛋白基因(mtta)在解脂耶氏酵母中的高效表达，筛选到的解脂耶氏酵工程菌株的衣康酸产量高。
(2)本发明构建的解脂耶氏酵母工程菌株所产衣康酸纯度高，副产物产量低。
(3)本发明构建的解脂耶氏酵母衣康酸生产工程菌株进行衣康酸发酵无需对发酵液ph进行调节，不仅减少原材料的消耗，同时也简化衣康酸后提取工艺。
(4)本发明构建的解脂耶氏酵母衣康酸生产工程菌株，通过补料发酵衣康酸的产量可达21.35g/l。属于同类技术的先进水平。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：土曲霉衣康酸生物合成途径。
图2：在pc-7菌株中过表达acoa、mfsa和mtta基因，筛选的转化子衣康酸发酵结果。
图3：在pc-mtt菌株中过表达acoa和mfsa基因，筛选的转化子衣康酸发酵结果。
图4：氮源对本发明构建的高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株pcm-ura衣康酸发酵的影响。
图5：本发明构建的高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株pcm-ura分批补料发酵生产衣康酸。a：转速400rpm，发酵过程ph不控制；b:转速300rpm，发酵过程通过4mnaoh控制ph3.2；c：转速300rpm，发酵过程ph不控制。(□衣康酸；△葡萄糖；○od600；◇ph；---溶解氧(do))。
图6：高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株分批补料发酵液hplc谱图。峰6-17.793为衣康酸。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中合成衣康酸的基因工程菌株均存在一定的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提拱了一株高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株，其特点是：该工程菌株为表达来自衣康酸高产土曲霉菌株hat418的cada和mtta基因的解脂耶氏酵母。
在本发明一个优选的实施方式中，所述cada基因的核酸序列如seqidno.1所示，所述mtta基因的核酸序列如seqidno.2所示。
在本发明一个优选的实施方式中，采用crispr/cas9基因编辑技术将cada基因整合到解脂耶氏酵母基因组中进行表达。
在本发明一个优选的实施方式中，采用非同源重组的方式将mtta基因整合到解脂耶氏酵母基因组进行表达。
在本发明一个优选的实施方式中，解脂耶氏酵母工程菌株积累衣康酸，该工程菌株通过分批补料发酵的衣康酸发酵产量达到21g/l及以上。
在本发明一个优选的实施方式中，所述cada和mtta基因来自衣康酸高产土曲霉菌株hat418，来自刘建军等人的《发酵法生产衣康酸技术的研究(ⅰ)》，为山东省食品发酵工业研究设计院选育、保藏菌株。
解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)是一种非常规酵母，属于半子囊菌纲(hemiascomycetes)、耶氏酵母菌属，解脂耶氏酵母是一种二型性酵母，即细胞形态可以在酵母型、假菌丝型以及菌丝型之间进行相互转换。
在本发明一个优选的实施方式中，所述解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母po1f菌株，为尿嘧啶、亮氨酸营养缺陷型菌株，该菌株来自cuijuangao,xiaofengyang,huaiminwang,cristinaperezrivero,chongli,zhiyongcui,qingshengqiandcarolszekilin,2016,robustsuccinicaidproductionfromcrudeglycerolusingengineeredyarrowialipolytica,biotechnolbiofuels,9:179。
在本发明一个典型的实施方式中，提供所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，该方法包括：
将cada和mtta基因与表达载体连接，制备得到含有目的基因的表达载体，再将该表达载体转化进入解脂耶氏酵母，通过crispr/cas9基因编辑技术将cada整合到基因组制定位点，通过非同源重组将mtta整合到基因组非特定位点，即获得高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株。
在本发明一个优选的实施方式中，所述构建方法具体包括：
(1)cada和mtta目的基因的制备与扩增；
(2)目的基因与表达载体的链接，制备得到含有目的基因的表达载体；
(3)将含有各目的基因的表达载体转化解脂耶氏酵母，筛选目的基因整合到基因组中并能够产生衣康酸的解脂耶氏酵母工程菌株。
步骤(1)中，所述目的基因的制备可以采用本领域技术人员常规的技术手段进行制备，比如直接分离法、构建基因文库分离法、pcr法和化学合成法。
在本发明的一个具体实施方式中，采用pcr法扩增得到cada、mtta基因片段。
步骤(2)中，所述表达载体为质粒载体，初始质粒载体可通过商业途径进行购买。
在本发明一个具体的实施方式中，目的基因与质粒载体的连接采用gibson组装方法进行连接，再将该表达载体转化至大肠杆菌dh5α中，然后筛选含有目的基因的表达载体的重组子。
在本发明一个具体的实施方式中，本发明首先采用crispr技术将cada基因转入解脂耶氏酵母po1f菌株，得到pc-7菌株；然后将mtta基因转入pc-7菌株，相关表达载体是psfy-leu-mtta质粒，得到pc-mtt菌株；再将acoa基因转入pc-mtt菌株中，相关的表达载体是psfy-ura-acoa质粒，得到pcm-aco菌株菌株，将mfsa转入pc-mtt菌株中，相关的表达载体是psfy-ura-mfsa质粒，得到pcm-mfs菌株。
步骤(3)中，具体包括解脂耶氏酵母细胞活化、感受态细胞制备和转化的步骤。
在本发明的又一典型的实施方式中，提供一种衣康酸的发酵生产方法，该方法包括采用所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株进行发酵的步骤。
具体的，将所述高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养，制备得到衣康酸。
在本发明一个优选的实施方式中，所述发酵培养基为酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖培养基(ypd培养基)，它是一种由葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和水组成的培养基。
在本发明一个优选的实施方式中，高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株的发酵培养过程为好氧条件发酵。
在整个发酵过程中无需添加碱液调节ph。
在本发明一个优选的实施方式中，采用分批补料的发酵方式进行发酵，具体方法包括：
首先将工程菌株接种于种子培养基中，在设定温度和转速下进行培养；培养后再接种至发酵培养基中，在设定温度、通风量和罐压下进行发酵培养。
具体的，包括以下步骤：
首先将工程菌株接种于ypd液体培养基(配方为：20g/l葡萄糖，10g/l酵母浸粉，20g/l蛋白胨)中，在28～30℃，180～300rpm条件下培养16～20h，之后接种到分批补料发酵培养基(100g/l葡萄糖、16g/l酵母浸粉、8g/l胰蛋白胨)中，使其初始od600＝1.0～1.2，通风量为0.5～1.5v/(v·min)，搅拌转速250-350rpm，罐压0.06～0.08mpa，发酵温度为28～30℃，当葡萄糖浓度小于20g/l时，进行葡萄糖批次补料，使培养基中葡萄糖浓度为40～60g/l。
在本发明一个优选的实施方式中，所述分批补料发酵培养基中氮源(酵母粉+蛋白胨)含量为1-3(w/w)％，酵母粉与蛋白胨的质量比例为1:2～2:1。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验菌株
菌株po1f：基因工程中常用耶氏酵母宿主菌株，尿嘧啶、亮氨酸缺陷，该菌株来自cuijuangao,xiaofengyang,huaiminwang,cristinaperezrivero,chongli,zhiyongcui,qingshengqiandcarolszekilin,2016,robustsuccinicaidproductionfromcrudeglycerolusingengineeredyarrowialipolytica,biotechnolbiofuels,9:179。
菌株hat418：衣康酸高产土曲霉突变菌株，为山东省食品发酵工业研究设计院选育并保藏。
1.1.2实验质粒
表1本发明选用质粒
1.1.3分子生物学常用酶、生化试剂及试剂盒
taqdna聚合酶购自天根生化科技公司；primestarhsdna聚合酶及其buffer缓冲液购自takara公司；各种dna限制性内切酶(包括相应缓冲液)均购自thermofisher公司；gibson组装克隆试剂盒购自newenglandbiolabs公司。
酵母粉(yeastextract)与胰蛋白胨(tryptone)购自oxoid公司；琼脂粉(agar)购自solarbio公司；琼脂糖(agarose)购自biowestagarose公司；氨苄青霉素(ampcilin)、硫酸卡那霉素(kanamycin)购自上海生工生物工程公司。
本实验所使用的其他试剂大多为国产分析纯。
琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒与pcr产物回收试剂盒购自omgea公司；质粒小(中)快速提取试剂盒及细菌基因组提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。
1.1.4培养基
(1)lb培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸粉，10g/l氯化钠。
(2)lb固体培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸粉，10g/l氯化钠，20g/l琼脂粉。
(3)ypd液体培养基：20g/l葡萄糖，10g/l酵母浸粉，20g/l胰蛋白胨。
(4)ypd固体培养基：20g/l葡萄糖，10g/l酵母浸粉，20g/l胰蛋白胨，20g/l琼脂粉。
(5)10％-ypd培养基：100g/l葡萄糖，10g/l酵母浸粉，20g/l胰蛋白胨。
(6)ynbd液体培养基：20g/l葡萄糖，6.7g/l无氨基酵母氮源(ynb)。
(7)ynbd固体培养基：20g/l葡萄糖，6.7g/l无氨基酵母氮源(ynb)，20g/l琼脂粉。
(8)ynbd-ura固体培养基：20g/l葡萄糖，6.7g/l无氨基酵母氮源(ynb)，0.05g/l尿嘧啶，20g/l琼脂粉。
(9)ynbd-leu固体培养基：20g/l葡萄糖，6.7g/l无氨基酵母氮源(ynb)，2g/l酪蛋白氨基酸，20g/l琼脂粉。
(10)分批补料发酵培养基：100g/l葡萄糖、16g/l酵母浸粉、8g/l胰蛋白胨。
1.2实验方法
1.2.1实验室中常用的分子生物学操作技术
在实验室中常用分子生物学技术主要包括：目的基因的pcr扩增及pcr产物的纯化、琼脂糖凝胶电泳、pcr片段的胶回收与纯化、基因组dna和质粒dna的提取、质粒dna的酶切与检测等，大多数的实验操作都可以直接参照试剂盒生产厂家的说明书。
1.2.1.1基因组提取
菌株po1f基因组的制备：采用天根酵母基因组提取试剂盒(tiangen,beijing,china)提取解脂耶氏酵母po1f基因组。
菌株hat418基因组cdna的制备：液体培养土曲霉hat418至对数期，采用unlq-10柱式总rna提取试剂盒(sangonbiotech)提取菌株hat418的总rna，然后以此为模板合成cdna。
1.2.1.2耶氏酵母感受态的制备与转化
(1)细胞活化：
从甘油管中取50μl耶氏酵母细胞菌液，涂布于ypd培养基平板上，23℃-25℃过夜培养。
(2)感受态制备：
采用接种环刮取一环细胞，悬于含有1mltebuffer的ep管中。10000rpm离心1min，弃掉上清。将细胞悬于600μl乙酸锂(0.1mph6.0)溶液中，28℃水浴静置培养1h。3000rpm离心2min，弃掉上清。用80-120μl的乙酸锂(0.1mph6.0)溶液悬浮细胞。
(3)转化：
取40μl感受态细胞，加入2μl鲑鱼精dna和3μl待转化目的片段，28℃水浴培养15min。加入350μlpeg4000-乙酸锂(0.1mph6.0)溶液以及16μl1mdtt，28℃水浴静置培养1h。加入40μldmso(二甲基亚砜)，39℃热击10min。加入600μl乙酸锂(0.1mph6.0)溶液悬浮细胞。取上述悬浮液涂布相应筛选平板，28℃倒置培养；或置于相应液体培养基中筛选富集。
1.2.2cad过表达工程菌株构建
采用crispr/cas9基因编辑技术构建cad过表达工程菌株。
采用hindiii对puc19质粒进行单酶切，并与含有cen1和ura3标记的基因合成片段cen1-ura3通过gibson酶联体系连接，得到质粒puc-yl。
采用引物cad-f/cad-r以土曲霉hat418基因组cdna为模板扩增得到cada基因，同时，分别采用引物ptef-f/ptef-r，引物cyc-f/cyc-r以合成的ptef-tcyc基因片段为模板扩增ptef启动子和cyc终止子。采用融合pcr技术，将ptef启动子、cada基因和cyc终止子融合，形成ptef-cada-cyc片段。需要注意的是，上述方法中，也可直接根据本发明提供的cada基因序列(seqidno.1)，采用化学合成方法得到cada基因片段，然后再对cada基因片段进行扩增。
以po1f基因组为模板，分别采用引物axp-up-f/axp-up-r、引物axp-dn-f/axp-dn-r扩增得到axp位点的上下游基因片段axp-up和axp-dn。然后将axp-up、ptef-cada-cyc、axp-dn三个片段与经sali单酶切回收后的puc-yl质粒通过gibson酶联体系连接，获得质粒puc-yl-axp-cad。
以质粒pcas1yl-trp为模板，分别采用引物pcas1yl-up-f/pcas-axp-up-r、引物pcas-axp-dn-f/pcas1yl-dn-r扩增得到pcas-axp-up片段和pcas-axp-dn片段，将两片段与经sali和pmei双酶切的pcas1yl-trp通过gibson酶联体系连接，获得含有axp引导rna基因序列的质粒pcas1yl-axp。将质粒puc-yl-axp-cad与crispr-cas9表达质粒pcas1yl-axp一同转入耶氏酵母po1f中，然后转入ynbd液体培养基中180rpm、30℃培养2天，涂布ynbd培养基平板30℃培养2天，挑取转化子并进行菌落pcr验证，获得cad过表达工程菌株pc-7。
1.2.3mtt、aco和mfs过表达工程菌株的构建
采用酶bsu15i和sali双酶切质粒pina-1269，并与含有启动子puas1b8-tef和终止子tcyc的合成基因片段puas1b8-tef-tcyc通过gibson酶联体系连接，得到质粒psfy-leu。采用mlui和ecori双酶切质粒pina-1312，并与含有启动子ptef和终止子tcyc的基因片段ptef-tcyc通过gibson酶联体系连接，得到质粒psfy-ura。以土曲霉hat418基因组cdna为模板，采用引物mtt-f/mtt-r、aco-f/aco-r经pcr扩增分别得到mtta，acoa基因片段(分别为seqidno.2和3所示的序列)。以菌株nih2624mfsa基因序列(ateg-0972)为模板根据耶氏酵母密码子偏好人工合成了mfsa基因(seqidno.4)，引物为mfs-f/mfs-r。分别将mtta、acoa、mfsa基因片段与经swaⅰ酶切的psfy-leu和psfy-ura质粒通过gibson酶联体系连接得到psfy-leu-mtt、psfy-ura-aco、psfy-ura-mfs。
需要注意的是，上述方法中，也可直接根据本发明提供的acoa和mtta基因序列，采用化学合成方法得到acoa和mtta基因片段，然后再对acoa和mtta基因片段进行扩增。
将所得的psfy-leu-mtt、psfy-ura-aco和psfy-ura-mfs质粒经noti酶切后，分别转入pc-7感受态菌株中，涂布筛选转化子，并进行发酵验证，分别获得菌株pc-aco、pc-mtt和pc-mfs。对照试验将psfy-ura和psfy-leu质粒经noti酶切后，转入pc-7感受态菌株中，挑取转化子，并进行发酵验证，分别获得菌株pc-leu和pc-ura。
1.2.4mtt与aco或mfs共表达工程菌株的构建
分别将经noti酶切的psfy-ura-aco和psfy-leu-mfs转入pc-mtt感受态菌株中，挑取转化子，获得菌株pcm-aco和pcm-mfs。对照试验采用经noti酶切的psfy-ura质粒转入pc-mtt感受态菌株中，挑取转化子，获得菌株pcm-ura。
表2本发明中使用的引物
表3本发明构建的质粒
表4本发明所构建菌株
1.2.5培养基中氮源优化
在初始10％ypd培养基的基础上，首先固定酵母浸粉和胰蛋白胨比例为1:2时，考察氮源总量为80％、60％、40％、20％对菌体发酵衣康酸的影响，并在以上氮源总量的基础上，调整酵母浸粉和胰蛋白胨的比例分别为1:2,1:1和2:1时，考察其对菌株发酵衣康酸的影响。
1.2.6分批补料发酵
发酵罐采用5l磁力搅拌罐(shanghaibaoxingbioengineeringequipmentco.,shanghai,china)。发酵初始培养基为氮源优化后培养基：100g/l葡萄糖、16g/l酵母浸粉、8g/l胰蛋白胨。菌株首先接种于ypd液体培养基中，在30℃，180rpm条件下培养16h，之后接种到3.5l培养基中，使其初始od600＝1.0。发酵过程中，通风量为1.0v/(v*min)，罐压维持在0.06mpa，发酵温度为30℃，当葡萄糖浓度小于20g/l时，进行葡萄糖补料，使培养基中葡萄糖浓度为40～60g/l。
1.2.7分析方法
生物量od600采用分光光度计进行测定；葡萄糖浓度采用葡萄糖分析仪sba-40d(山东省科学院生物研究所)进行测定；衣康酸含量采用hplc(ultimate3000hplc,dionex,usa)进行测定，柱子为dionexacclaim120c18column，检测器是ultimate3000紫外检测器，流动相为水和甲醇比例(v/v)为95:5的0.02mm磷酸二氢钾缓冲液(ph2.65)，流速1ml/min，柱温箱为30℃，检测波长为210nm。
2结果
2.1产衣康酸耶氏酵母工程菌的构建
采用crispr/cas9基因编辑技术(coryschwartz,murtazashabbir-hussain,keithfrogue,markblenner,andianwheeldon.(2016)standardizedmarkerlessgeneintegrationforpathwayengineeringinyarrowialipolytica.acssyntheticbiology.6,402-409)将来源于衣康酸高产菌株hat418的cada基因转入耶氏酵母po1f中，获得目的菌株pc-7。如图2所示，通过与原始菌株对比发现，在10％ypd培养基中，30℃180rpm摇床培养96h，pc-7菌株的衣康酸产量可达336mg/l，而原始菌株po1f没有检测到衣康酸的产生。
为了进一步提高菌株衣康酸产量，本研究采用非同源重组转化(nhej)方式，分别将mtta,acoa,mfsa基因在菌株pc-7中过表达。各挑取10株转化株，摇瓶发酵结果如图3所示。结果显示过表达acoa和mfsa基因的菌株衣康酸产量与菌株pc-7基本没有差距，而过表达mtta基因菌株pc-mtt衣康酸产量较pc-7提高了10.5倍，达到3.85g/l，提高显著，说明mtta基因是耶氏酵母工程菌株中衣康酸积累的关键。
本发明进一步在菌株pc-mtt中过表达acoa和mfsa基因。经筛选分别挑取10株转化子进行摇瓶发酵，结果如图3所示，发现acoa和mfsa基因转化子(菌株pcm-aco、pcm-mfs)较菌株pc-mtt的衣康酸产量都有明显提高，大约提高30％。但值得注意的acoa和mfsa基因的载体质粒的转化子pcm-ura衣康酸产量也相应提高，且与pcm-aco、pcm-mfs菌株相当，所以pcm-aco、pcm-mfs转化子较菌株pc-mtt的衣康酸产量的提高可能仅仅是因为其载体质粒的增效作用，与acoa和mfsa基因过表达无关，所以acoa和mfsa基因对菌株pc-mtt衣康酸的积累没有贡献。
2.2菌株pcm-ura产衣康酸培养基的初步优化
在初始培养基10％ypd的基础上，通过调整总氮源的含量和组成，对菌株pcm-ura产衣康酸培养基进行了进一步优化。首先固定酵母浸粉和蛋白胨质量比例为1:2，考察总氮源含量降低对菌株衣康酸积累的影响，然后在固定氮源总量的基础上，又考察了酵母浸粉和蛋白胨的比例对菌株发酵衣康酸的影响。结果如图4所示：在固定氮源比例(酵母浸粉：胰蛋白胨＝1:2)的前提下，氮源总量的减少，导致菌体生物量和衣康酸产量的双下降，但衣康酸产量减低比例大于菌体生物量。比如当氮源总量降低至原始培养基的40％时，菌体浓度下降不到20％，而衣康酸产率则降低60％以上。而在氮源总量一定的前提下，提高酵母浸粉比例，菌体浓度没有明显变化，但衣康酸产量却有较大提高。通过对上述结果的分析，表明酵母浸粉对耶氏酵母积累衣康酸有促进作用。如图5所示，当氮源总量是原始培养基的80％，酵母浸粉与蛋白胨比例为2:1时，即酵母浸粉16g/l，胰蛋白胨8g/l时，衣康酸产量可达到6.42g/l，较初始培养基(初始10％ypd)提高了23.22％。
2.3分批补料发酵生产衣康酸
为了进一步研究耶氏酵母pcm-ura发酵生产衣康酸的能力，实验采用5l机械搅拌发酵罐进行分批补料发酵。
首先采用转速400rpm，发酵过程中不对料液ph进行控制，工程菌株衣康酸发酵进程如图5a所示，菌株在发酵初期生长迅速，在28h发酵液od600即达到了125，但是，衣康酸产率较低，发酵76h衣康酸产量仅为5.03g/l。
将搅拌转速降至300rpm，发酵过程中用4mnaoh控制ph3.2以上，最终发酵液od600约为90，衣康酸产量17.86g/l，转化率为0.035g/g(图5b)。发酵过程中不对料液ph进行控制，最终od600约为75，衣康酸产量达到21.35g/l，转化率为0.055g/g(如图5c)。说明高产酸条件下也不需要对料液ph进行控制。
图6为高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株分批补料发酵液hplc谱图。峰6-17.793为衣康酸。从图6可见，杂质峰较少，说明衣康酸的纯度较高。
3讨论
随着人们对可持续发展问题的关注，衣康酸作为一种应用广泛的生物基材料，已经在科研和工业应用领域逐渐成为研究热点。目前虽然发现有包括黑粉菌、假丝酵母在内的多种菌株可以生物合成衣康酸，但是目前仍然选用土曲霉作为衣康酸生产的主要工业化生产菌株。然而，由于土曲霉自身存在的很多缺陷，使其进一步提高产量的空间较少。为此，研究人员开始尝试采用其他宿主进行衣康酸生产菌株构建。其中，获得的黑曲霉衣康酸工程菌株产物中含有大量柠檬酸等副产物，另外，黑曲霉与土曲霉一样也存在菌体不耐剪切等问题；大肠杆菌等细菌衣康酸工程菌株，因为细胞不能耐受低ph，所以发酵过程中必须流加碱液以维持中性ph，大大增加了衣康酸提取成本。与上述菌株相比，酵母菌对剪切力和低ph环境的耐受力较强，更适用于作为衣康酸生产工程菌的宿主。但研究表明用酿酒酵母构建的衣康酸工程菌株产量较低。相关文献报道解脂耶氏酵母具有生产多种有机酸的潜力，并且可以耐受较低的ph值环境(cuijuangaoetal.,2016；zhiyongcuietal.,2017)。为此，本研究选用耶氏酵母作为出发菌株，用于衣康酸生产工程菌的构建。关于衣康酸的研究表明，衣康酸的生物合成是在不同的细胞器内进行的。衣康酸合成前体顺乌头酸是线粒体中tca循环的中间代谢产物，而衣康酸合成的最终步骤，即顺乌头酸在顺乌头酸脱羧酶作用下生成衣康酸的反应在细胞胞质中进行。为了解决这个问题，先前有研究报道，通过在耶氏酵母胞质中过表达去除线粒体定位信号的aco可以提高衣康酸产量，但提高幅度远低于本专利中过表达mtt的结果，进一步表明了mtt是耶氏酵母高产衣康的关键因素之一。
在具有mtt基因菌株pcm-mtt的基础上，进一步过表达acoa和mfsa基因的研究发现，aco和mfs对衣康酸产量的提高并没有太大影响。同时，结合氮源优化结果可以推测，酵母浸粉中某些关键营养因子可能对衣康酸合成具有积极作用。
工程菌株分批发酵结果表明，高转速使得发酵液中溶解氧增加，菌体呼吸作用加强，导致较多的菌体量，底物快速消耗产生的代谢流大量进入tca循环，而由于mtt转运顺乌头酸的能力并没有显著增加，致使大量代谢流通过呼吸作用消耗掉，而用于衣康酸生物合成的代谢流并没有显著增加，使得发酵得率较低。降低转速后，衣康酸转化率明显提高。
本发明获得的解脂耶氏酵母产衣康酸工程菌株分批补料发酵衣康酸产量达到21.35g/l，发酵过程中不需要对ph进行调节，减少了发酵过程中染菌的概率，同时可以大幅降低下游衣康酸提取工艺的成本。
需要说明的是，本发明所使用的cada,acoa和mtta来自土曲霉hat418，这些基因的编码序列与目前公布全基因组的衣康酸nih2624相比(mtta序列如seqidno.2所示，acoa基因如seqidno.3所示，mfsa基因如seqidno.4所示)，编码序列一致性分别为96.06％,98.76％,96.25％，氨基酸序列一致性分别为97.55％,99.62％,97.67％。
4结论
本研究通过基因工程手段增强了耶氏酵母发酵衣康酸的能力，将来自土曲霉hat418中的acoa,mtta和mfsa基因转入含有cada基因的耶氏酵母po1f中，结果表明，mtt转运子是耶氏酵母发酵生产衣康酸的关键因素。通过进一步优化，所得的转化子在分批补料发酵中的产量可达到21.35g/l。这是目前在酵母发酵衣康酸的最高产量，而且，该发酵过程无需添加碱液调节ph，减少了发酵过程中的染菌概率，同时显著降低了衣康酸的提取成本。该研究为进一步通过基因工程手段提高耶氏酵母发酵生产衣康酸能力奠定了基础。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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<110>山东省食品发酵工业研究设计院
<120>一种高产衣康酸解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法、发酵工艺与应用
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