本发明属于微生物领域，具体涉及一种气体信号分子的应用及一种利用气体信号分子促进芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是自然界中微生物(主要是芽孢杆菌属细菌)利用谷氨酸通过α-氨基与γ-羧基之间形成的γ-酰胺键聚合形成的水溶性可生物降解的阴离子型多聚氨基酸，具有无色透明、无毒、无味、吸水速度快等特点。
细菌合成的γ-聚谷氨酸就产量而言，往往随所用菌株、发酵条件以及培养基中碳源、氮源、金属离子的种类和含量不同有很大的差异，而且分子量较大，从10kda～1,000kda不等，没有典型的肽链结构，基本骨架呈直链纤维状。
γ-聚谷氨酸近年来在食品工业、制药业、化妆品生产和污水处理等方面具有广泛的应用前景。γ-聚谷氨酸可以被用作食品增稠剂、润湿剂、苦味缓释载体、防冻剂、保水剂、药物载体、可降解塑料、高分子生物絮凝剂、重金属吸附剂、动物食品添加剂等。
在农业生产中由于γ-聚谷氨酸具有较强的亲水和保湿能力，将这种γ-聚谷氨酸与土壤结合，不仅可以改良土壤的团粒结构，还能改进土坡的保墒、保湿、保肥性能，在改造荒山、秃岭、沙漠方面发挥积极作用。
γ-聚谷氨酸还可作为农业化学品的缓释载体，在肥料、除草剂、杀虫剂及其它农用化学品使用时，加入适量的γ-聚谷氨酸盐可以延长药物在作用对象表面上的停留时间，不易因干燥、下雨而被刷掉，从而延长活性成分的作用时间，同时提高了这些化学品的使用效果，这在一定程度上减少了化肥农药的使用量，对改善农用土壤的结构，降低农药的负面影响都有十分重要的意义。此外γ-聚谷氨酸还可增加植物对营养的吸收、提高作物产量，作为对环境友好的肥料增效剂。在微生物肥料生产中增加γ-聚谷氨酸的产量可以开发为保水微生物肥，对于旱作农业具有重要意义。
因此，急需一种促进细菌合成γ-聚谷氨酸的有效途径。
气体信号分子包括一氧化氮、一氧化碳和硫化氢。一氧化氮是第一个被确定的气体信号分子，其生物学效应的发现是一次革命，使人类第一次认识到气体也可作为重要细胞信号分子。气体信号分子具有传导信号通路的功能，进而调控相关生理事件。随着对一氧化氮作为气体信号分子的研究日益广泛，其在生命体系中的作用需要更深入地被了解，以便更好地对其功能进行调控。
本发明从黄瓜根际土筛选到的一株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)sqr9作为pgpr菌在作物根际发挥作用。解淀粉芽孢杆菌sqr9也可产生的γ-聚谷氨酸，为其发挥植物促生提供有力保障。目前，尚未有气体信号分子应用于提高芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸产量中报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种气体信号分子的应用及一种利用气体信号分子促进芽孢杆菌合成γ-聚谷氨酸的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的是提供气体信号分子在促进解淀粉芽孢杆菌sqr9合成γ-聚谷氨酸中的应用。
进一步的，所述气体信号分子为一氧化氮。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌sqr9，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens，于2012年2月27日保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.5808，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二个目的是提供利用权前述气体信号分子促进解淀粉芽孢杆菌sqr9合成γ-聚谷氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：
s1：将保藏编号为cgmccno.5808的菌株sqr9过夜活化后，以1％接种量转接到灭菌的landy培养基中；
landy培养基，1l培养基的配法为：1、葡萄糖20g，单独灭菌，115℃，30min。2、mgso4·7h2o0.5g；kh2po41g；kcl0.2g；mnso4·h2o10mg；feso4·7h2o5mg；cuso4·5h2o0.2mg；酵母粉1g；l-丙氨酸2mg；l-谷氨酸5g，用5m的naoh调制ph＝6.7后,115℃，30min灭菌。1、2分别灭菌后混合在一起。
s2：将一氧化氮供体detanonoate溶于水配制成100mm的母液，用0.22μm的滤膜除菌后加入到s1所述的landy培养基中至终浓度为1～40μm，37℃，170rpm震荡培养12h或12h以上，得到发酵液；
s3：用醇沉淀的方法提取s2所述发酵液中的γ-聚谷氨酸。
进一步的，所述s2中detanonoate终浓度为40μm。
进一步的，所述s3中醇沉淀方法为：将发酵液4℃，8000r/min离心15min除去菌体,加入3倍体积的无水乙醇，在4℃下静置过夜，8000r/min离心15min，取沉淀，加入与发酵液等体积的蒸馏水溶解。
进一步的，所述s3提取后，还包括用ctab法对γ-聚谷氨酸的含量进行测定的步骤。
进一步的，s3得到的γ-聚谷氨酸分子量单一且大于300kda。
本发明的第三个目的是提供前述的应用或前述方法在γ‐聚谷氨酸作为发酵产品中的应用，特别是在旱作农业，食品工业，日化用品方面的应用。
本发明敲除了菌株sqr9中一氧化氮合成酶(yflm)，得到突变体δyflm，其一氧化氮合成水平相对与野生型菌株sqr9下降了5倍，此突变株δyflm用来测量低水平下菌株sqr9中γ-聚谷氨酸的合成能力。detanonoate作为一氧化氮供体能在液体环境下缓慢释放一氧化氮，使一氧化氮持续发挥作用。为保证一氧化氮促进γ-聚谷氨酸的效果，同时避免高浓度一氧化氮对菌株的毒性，本发明在1～40μm一氧化氮供体detanonoate范围内设置梯度试验，在δyflm培养液中外源添加1μm、5μm、10μm、20μm、40μm的一氧化氮供体detanonoate来研究一氧化氮对γ-聚谷氨酸合成的影响，并在野生型sqr9中验证了其促进作用。
本发明的技术方案与现有技术相比，有益效果在于：
(1)本发明首次公开了气体分子一氧化氮具有提高解淀粉芽孢杆菌sqr9合成γ-聚谷氨酸的能力，相对于解淀粉芽孢杆菌sqr9常规发酵生产γ-聚谷氨酸的产量提高了81％，为微生物发酵提高γ-聚谷氨酸的产量提供了新途径。
(2)本发明提供的解淀粉芽孢杆菌sqr9遗传稳定性强，可重复传代。
(3)本发明使解淀粉芽孢杆菌sqr9合成γ-聚谷氨酸的能力显著提高，对于旱作农业，食品工业，日化用品方面都具有重要意义。
附图说明
图1实施例1中一氧化氮合成酶对菌株sqr9合成一氧化氮的影响对比柱状图；
图2实施例3中a为一氧化氮合成酶对γ-聚谷氨酸合成的影响对比柱状图，b为紫外吸收样品图；
图3实施例4中sds-page检测菌株sqr9产生的γ-聚谷氨酸图谱；
图4实施例5中a为一氧化氮对菌株sqr9合成γ-聚谷氨酸的影响对比柱状图，b为紫外吸收样品图；
图5实施例5中一氧化氮对突变体δyflm合成γ-聚谷氨酸的影响对比柱状图。
生物材料保藏信息：
sqr9，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年2月27日，保藏号为cgmccno.5808。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1：解淀粉芽孢杆菌sqr9中一氧化氮合成酶对一氧化氮合成的影响
通过信息比对查找到菌株sqr9中有一个编码一氧化氮合成酶的基因yflm(ncbiid：ahz14748.1)，在sqr9基因组中位置为v529_07220，通过同源重组的方法将该基因敲除后得到突变体δyflm。通过一氧化氮检测试剂盒测得两菌株产生一氧化氮的能力。
本实验结果如图一所示，敲除菌株sqr9中一氧化氮合成酶(yflm)后其一氧化氮合成水平下降了5倍，证明一氧化氮合成酶参与合成的一氧化氮为菌株sqr9中一氧化氮的主要来源，此突变株δyflm用来测量低水平下菌株sqr9中γ-聚谷氨酸的合成能力。
实施例2：γ-聚谷氨酸的发酵及提取
本实施例分为sqr9组，和δyflm组。
将菌株过夜活化的菌株sqr9与δyflm分别接到landy培养基(landy培养基，1l培养基的配法为：1、葡萄糖20g，单独灭菌，115℃，30min。2、mgso4·7h2o0.5g；kh2po41g；kcl0.2g；mnso4·h2o10mg；feso4·7h2o5mg；cuso4·5h2o0.2mg；酵母粉1g；l-丙氨酸2mg；l-谷氨酸5g，用5m的naoh调制ph＝6.7后,115℃，30min灭菌。1、2分别灭菌后混合在一起)中，37℃，170rpm培养48h。
将两组发酵液在4℃，8000r/min离心15min除去菌体,加入3倍体积的无水乙醇，在4℃下静置过夜，8000r/min离心15min取沉淀，加入与发酵液等体积的蒸馏水溶解，即得到sqr9组和δyflm组的发酵产物样品。
实施例3：γ-聚谷氨酸含量的测定
γ-聚谷氨酸标准溶液的配置：精确称量γ-聚谷氨酸0.1g，以蒸馏水溶解并定容至100ml，得到1mg/ml的γ-聚谷氨酸标准液，梯度稀释标准液得到10μg-1mg/ml的γ-聚谷氨酸标准液。ctab溶液的配制：配制2％的naoh溶液，并以此为溶剂，加入ctab，使其终浓度为25g/l,溶解时可适当加热加速溶解。
分别取实施例2制得的sqr9组和δyflm组的发酵产物样品各2ml及标准液2ml于试管中，准确加入2mlctab试液，充分震荡静置至3min,测其波长在250nm下的吸光值。
本实验结果如图二所示，解淀粉芽孢杆菌sqr9缺失一氧化氮合成能力后，其合成γ-聚谷氨酸的能力几乎丧失。表明內源产生的一氧化氮在解淀粉芽孢杆菌sqr9合成γ-聚谷氨酸的过程中发挥重要作用。
实施例4：γ-聚谷氨酸分子量的初步估计
本实施例分为sqr9组、δyflm组、δyflm+1μmdetanonoate组、δyflm+10μmdetanonoate组、δyflm+20μmdetanonoate组、δyflm+40μmdetanonoate组。
将菌株过夜活化的菌株sqr9与δyflm分别接到landy培养基(landy培养基，1l培养基的配法为：1、葡萄糖20g，单独灭菌，115℃，30min。2、mgso4·7h2o0.5g；kh2po41g；kcl0.2g；mnso4·h2o10mg；feso4·7h2o5mg；cuso4·5h2o0.2mg；酵母粉1g；l-丙氨酸2mg；l-谷氨酸5g，用5m的naoh调制ph＝6.7后,115℃，30min灭菌。1、2分别灭菌后混合在一起)中。
采用detanonoate为一氧化氮供体，在水溶液中能够缓慢释放一氧化氮，使一氧化氮持续发挥作用，由于一氧化氮供体detanonoate的半衰期较短，本实验的4个δyflm+detanonoate组采用在δyflm中每间隔12h加入一次各实验组相应浓度的detanonoate的策略，37℃，170rpm培养48小时，将两组发酵液在4℃，8000r/min离心15min除去菌体,加入3倍体积的无水乙醇，在4℃下静置过夜，8000r/min离心15min取沉淀，加入与发酵液等体积的蒸馏水溶解，收集各实验组γ-聚谷氨酸样品。
配制5％sds-page浓缩胶及6％分离胶，γ-聚谷氨酸样品中加入蛋白上样缓冲液,100℃加热3min后上样，电泳结束后固定液(454ml50％甲醇和46ml冰醋酸混匀)固定1h,0.5％阿利新蓝染液(0.5g阿利新蓝溶解于100ml3％的冰醋酸中)染色2h,脱色液(75ml冰醋酸,50ml甲醇,875ml蒸馏水)过夜脱色。
本实验结果如图三所示，解淀粉芽孢杆菌sqr9产生的的γ-聚谷氨酸分子量单一且大于300kda。
实施例5：外源一氧化氮对γ-聚谷氨酸合成的影响
本实验分为sqr9组、sqr9+40μmdetanonoate组。
从平板上挑取保藏编号为cgmccno.5808的菌株sqr9的单菌落到灭菌的lb(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％nacl)试管中，过夜培养。
将过夜活化的菌株sqr9以1％接种量分别转接到landy培养基中，sqr9+40μmdetanonoate组采用detanonoate为一氧化氮供体。
将一氧化氮供体detanonoate溶于水配制成100mm的母液，用0.22μm的滤膜除菌后加入80μl到sqr9+40μmdetanonoate组的landy培养基中至终浓度40μm，37℃，170rpm震荡培养12h，得到200ml发酵液。
将发酵液8000r/min离心15min除去菌体,加入3倍体积的无水乙醇，在4℃下静置过夜，8000r/min离心15min取沉淀，加入200ml蒸馏水溶解，即可获得sqr9+40μmdetanonoate组γ-聚谷氨酸样品。
sqr9组除不加入detanonoate外，其他处理与sqr9+40μmdetanonoate组均相同。
分别测定sqr9组和sqr9+40μmdetanonoate组γ-聚谷氨酸浓度，sqr9组样品浓度约为0.307mg/ml，sqr9+40μmdetanonoate组样品浓度约为0.557mg/ml(如图四)。
将实验分为sqr9组、δyflm组、δyflm+1μmdetanonoate组、δyflm+5μmdetanonoate组、δyflm+10μmdetanonoate组、δyflm+20μmdetanonoate组、δyflm+40μmdetanonoate组。
过夜活化的菌株sqr9和δyflm分别转接到landy培养基中，由于一氧化氮供体detanonoate的半衰期较短，本实验的5个δyflm+detanonoate组采用在δyflm中每间隔12h加入一次各实验组相应浓度的detanonoate的策略，48h收集γ-聚谷氨酸并测定其浓度(如图五)
本实验结果如图四、五所示，未加入一氧化氮的野生型sqr9合成γ-聚谷氨酸的含量为0.307mg/ml，加入外源一氧化氮使野生型sqr9合成γ-聚谷氨酸的含量达到0.557mg/ml，增加了81％，而且持续补加外源一氧化氮可以使δyflm合成γ-聚谷氨酸的能力恢复到野生型水平。
实施例6：利用一氧化氮促进解淀粉芽孢杆菌sqr9合成γ-聚谷氨酸
本实验分为sqr9组、sqr9+1μmdetanonoate组、sqr9+40μmdetanonoate组。
从平板上挑取保藏编号为cgmccno.5808的菌株sqr9的单菌落到灭菌的lb(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％nacl)试管中，过夜培养。
将活化好的菌株sqr9分别以1％接种量转接到3组经灭菌的200mllandy培养基中(500ml三角瓶)。
sqr9组处理条件为：37℃，170rpm震荡培养48h，得到200ml发酵液。
sqr9+1μmdetanonoate组处理条件为：将一氧化氮供体detanonoate溶于水配制成100mm的母液，用0.22μm的滤膜除菌后加入到上述landy培养基中至终浓度1μm，37℃，170rpm震荡培养48h，得到200ml发酵液。
sqr9+40μmdetanonoate组处理条件为：将一氧化氮供体detanonoate溶于水配制成100mm的母液，用0.22μm的滤膜除菌后加入到上述landy培养基中至终浓度40μm，37℃，170rpm震荡培养48h，得到200ml发酵液。
将以上3组的发酵液分别8000r/min离心15min除去菌体,加入3倍体积的无水乙醇，在4℃下静置过夜，8000r/min离心15min取沉淀，加入200ml蒸馏水溶解，即可获得sqr9组、sqr9+1μmdetanonoate组、sqr9+40μmdetanonoate组的γ-聚谷氨酸样品。
sqr9组样品浓度约为0.75mg/ml，
sqr9+1μmdetanonoate组样品浓度约为0.90mg/ml，
sqr9+40μmdetanonoate组样品浓度约为1.3mg/ml。
加入外源一氧化氮能够显著促进解淀粉芽孢杆菌sqr9合成γ-聚谷氨酸。
本发明敲除了菌株sqr9中一氧化氮合成酶(yflm)，得到突变体δyflm，其一氧化氮合成水平相对与野生型菌株sqr9下降了5倍，此突变株δyflm用来测量低水平下菌株sqr9中γ-聚谷氨酸的合成能力。detanonoate作为一氧化氮供体能在液体环境下缓慢释放一氧化氮，使一氧化氮持续发挥作用，为保证一氧化氮促进γ-聚谷氨酸的效果，同时避免高浓度一氧化氮对菌株的毒性，本发明在1～40μm一氧化氮供体detanonoate范围内设置梯度试验，在δyflm培养液中外源添加1μm、5μm、10μm、20μm、40μm的一氧化氮供体detanonoate来研究一氧化氮对γ-聚谷氨酸合成的影响，并在野生型sqr9中验证了其促进作用。本发明首次公开了气体分子一氧化氮具有提高解淀粉芽孢杆菌sqr9合成γ-聚谷氨酸的能力，相对于解淀粉芽孢杆菌sqr9常规发酵生产γ-聚谷氨酸的产量提高了81％，为微生物发酵提高γ-聚谷氨酸的产量提供了新途径对于旱作农业，食品工业，日化用品方面具有重要意义，同时本发明的解淀粉芽孢杆菌sqr9遗传稳定性强，可重复传代。