本发明属于牛冻精生产技术领域，具体涉及一种牛冻精x、y精子分离方法。
背景技术
在牛的养殖生产中，有选择地繁殖出具有预知性别的牛后代将能大大提高牛生产的速度和效率，用x或y精子给母牛授精，在受精之前便可决定后代的性别，从而显著地改变后代的性别比例，达到性别控制的目的。目前，只有流式细胞仪精子分离法被公认为最科学最可靠，同时也是最高效的精子分离方法。流式细胞仪分离哺乳动物x、y精子是根据哺乳动物x精子的dna含量比y精子多的原理，荧光染色之后通过分辨荧光差别将二者分开，受精之后达到性别控制的目的。
但是目前针对x、y精子采用流式细胞仪所采用的分离手段如cn1667118a中所述“在采集的公畜原精液中加入抗生素混合溶液，24小时内恒温保存，用不含卵黄的精子稀释液将原精液稀释后加入荧光染色剂、并在水浴锅中孵育染色，水浴结束后加入色素，在恒温下利用流式细胞仪分离所需的x或y精子，用预装有含卵黄的精子接受液的试管收集分离后的x精子和y精子，分离得到的精液经离心浓缩后可直接用于人工授精或体外授精，或低温平衡后冷冻保存。”该种方法所采用的原精液为鲜精，且要求鲜精密度在8亿精子/ml以上且活力≥0.6，如果需要引进国外的所需的x或y精子，需要引进活体牛或者引进胚胎或者是引进性控胚胎，此种方法所需费用较高，无法满足国内市场的需求。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的不足之处，本发明的目的就在于提供一种操作简单、费用低且可适用于冻精性控分离x、y精子的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种牛冻精x、y精子分离方法，包括如下步骤：
步骤(1)配置staining液和稀释液
1.1)staining液
staining液中各成分及其终浓度为：hepes：9.520g/l，mgcl2·6h2o：0.08g/l，nacl：5.518g/l，kcl：0.224g/l，na2hpo4：0.04g/l，nahco3：0.84g/l，napy：0.22g/l，葡萄糖：0.90g/l，nalatctate：3.61ml/l，bsa：3.0g/l，庆大霉素：2.5ml/l；
1.2)稀释液
稀释液包括796份工作液、204份蛋黄，以及终浓度为0.007467ml/ml庆大霉素、终浓度为0.005633ml/ml的抗生素泰勒菌素和林肯霉素，所述的工作液中各成分及其终浓度为：tris30.44g/l，柠檬酸17.21g/l，果糖12.65g/l；
步骤(2)将牛冷冻冻精解冻，解冻后离心，弃上清液，计算沉淀精子数量；
步骤(3)用staining液将步骤(2)所得的沉淀精子稀释至浓度为1×108个精子/ml，然后加入荧光染料，混合均匀后置于水浴中静置，水浴后用流式细胞仪使x、y精子分离，将x或y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀x或y精子，向x或y精子中加稀释液后冷冻保存。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤1.1)中staining液的配置方法为：
将700-800ml的超纯水倒入烧杯中，开启搅拌，分别依次加入hepes、mgcl2·6h2o、nacl、kcl、na2hpo4、nahco3、napy、葡萄糖、nalatctate和bsa摇匀后，采用naoh溶液调节ph值至7.4，将烧杯中的溶液转移至容量瓶，添加超纯水定容至1000ml，封膜摇匀；将容量瓶中的液体静置24h后过滤，滤液置于试剂瓶中，待用；在使用前向试剂瓶中加入终浓度为2.5ml/l的庆大霉素。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤1.2)中，配置稀释液包括如下步骤：
(1)配置工作液
工作液的配置方法为在烧杯中加入700-800ml超纯水，开启搅拌，并依次加入tris、柠檬酸和果糖，溶解后采用naoh溶液调节ph至6.80，将烧杯中的溶液转移至容量瓶，添加超纯水定容至1000ml，混合均匀后过滤，弃滤渣，将滤液在4℃条件保存备用，
(2)配置稀释液
称取796ml工作液置于1000ml容量瓶中，并向容量瓶中加入204ml蛋黄，摇匀后放置24小时，将容量瓶中溶液离心过滤三次，然后按终浓度为0.005633ml/ml分别加入抗生素成品泰勒菌素和林肯霉素，终浓度为0.007467ml/ml加入庆大霉素，混合均匀，即制得稀释液。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤(2)中，所述的牛冷冻冻精为活力大于或等于0.35的液氮保存下的冷冻冻精。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤(2)中，所述的解冻条件为将牛冷冻冻精置于38℃的水浴中解冻10s。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤(2)中，所述的离心操作为将牛冷冻冻精解冻后剪掉盛装牛冷冻冻精的细管的非棉塞端，用推针从棉塞端将解冻后的冻精精液推至离心管中，在18℃、850g条件下离心10分钟，离心后弃上清液。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤(3)中，所述的荧光染料为h33342。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤(3)中，所述的水浴温度为34℃，水浴时间为48分钟。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤(3)中，将x或y精子置于冰箱中平衡，冰箱中的温度控制在4℃，平衡后离心时离心温度控制在4℃，离心力控制在850g，离心时间控制在20min，离心后用稀释液稀释，稀释后置于4℃条件下保存。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤(2)中，所述的计算沉淀所含精子数量所采用的方法为血细胞计数板计数法。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤1.1)中搅拌时采用的搅拌器为磁力搅拌器。
优选地，上述牛冻精x、y精子分离方法，步骤1.1)中所用的naoh为质量分数为15％的naoh溶液。
本申请文件中所述的hepes的中文全称：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-2-乙烷磺酸，napy的中文全称为：丙酮酸钠，nalatctate的中文全称为：乳酸钠。
本申请文件中所述的bsa的中文全称为牛血清白蛋白；
本申请文件中所述的抗生素泰勒是指泰勒菌素，抗生素泰勒的配置方法为将0.76g酒石酸泰勒菌素(tylosintartrate)与40ml2.9％(质量分数，下同)柠檬酸钠混合均匀即制得抗生素泰勒；
本申请文件中所述的抗生素林肯是指林肯霉素，抗生素林肯的配置方法为：以壮观霉素(spectinomycindihydrochloridepentahydrate)∶林肯霉素(lincomycinhydrochloride)∶2.9％柠檬酸钠的比例为4g∶2g∶40ml配置而成的混合液为抗生素林肯。
与现有技术相比较，本发明所述的牛冻精x、y精子分离方法具有如下创新点：
本发明提供的牛冻精x、y精子分离方法，通过合理的配置staining液和稀释液使冻精也可以采用流式细胞仪实现分离，现有的流式细胞仪仅限于鲜精且要求鲜精密度在8亿精子/ml且要求活力大于等于0.6，本发明所提供的牛冻精x、y精子分离方法仅两剂冷冻冻精(冻精密度≥8000万个精子/ml，冻精规格：0.25ml/剂)就可以满足所需要的精子量。且分离后的精子活力达到0.3-0.36，性别控制率≥90％，最高可达99％，完全可以满足体外受精所需要的条件。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种牛冻精x、y精子分离方法，包括如下步骤：
步骤(1)配置staining液和稀释液
1.1)staining液
staining液中各成分及其终浓度为：hepes：9.520g/l，mgcl2·6h2o：0.08g/l，nacl：5.518g/l，kcl：0.224g/l，na2hpo4：0.04g/l，nahco3：0.84g/l，napy：0.22g/l，葡萄糖：0.90g/l，nalatctate：3.61ml/l，bsa：3.0g/l，庆大霉素：2.5ml/l；
staining液的配置方法为：
将700-800ml的超纯水倒入烧杯中，开启搅拌(采用磁力搅拌器搅拌)，分别依次加入hepes、mgcl2·6h2o、nacl、kcl、na2hpo4、nahco3、napy、葡萄糖、nalatctate和bsa摇匀后，采用naoh溶液调节ph值至7.4，添加超纯水定容至1000ml容量瓶，封膜摇匀；将容量瓶中的液体静置24h后，将容量瓶中液体置于200亩过滤器中过滤，滤液置于试剂瓶中，根据试剂瓶中过滤得到的液体的体积加入庆大霉素得到staining液，staining液中庆大霉素的终浓度为2.5ml/l；
1.2)稀释液
稀释液包括796份工作液、204份蛋黄，以及终浓度为0.007467ml/ml庆大霉素、终浓度为0.005633ml/ml的抗生素泰勒菌素和林肯霉素，所述的工作液中各成分及其终浓度为：tris30.44g/l，柠檬酸17.21g/l，果糖12.65g/l；
具体地，配置稀释液包括如下步骤：
首先，配置工作液
工作液的配置方法为在1000ml烧杯中加入700-800ml超纯水，开启搅拌(采用磁力搅拌器搅拌)，并依次加入tris、柠檬酸和果糖，溶解后采用naoh溶液调节ph至6.80，将烧杯中的溶液转移至容量瓶，添加超纯水定容至1000ml，混合均匀后过滤，弃滤渣，将滤液在4℃条件保存备用，
然后，配置稀释液
称取796ml工作液置于1000ml容量瓶中，并向容量瓶中加入204ml蛋黄，摇匀后放置24小时，将容量瓶中溶液离心过滤三次，然后按终浓度为0.005633ml/ml分别加入抗生素成品泰勒菌素和林肯霉素，终浓度为0.007467ml/ml加入庆大霉素，混合均匀，即制得稀释液。
步骤(2)将牛冷冻冻精解冻，解冻后离心，弃上清液，采用血细胞计数板计数法计算沉淀精子数量；所述的牛冷冻冻精为活力大于或等于0.35的液氮保存下的冷冻冻精，解冻条件为将牛冷冻冻精置于38℃的水浴中解冻10s，离心操作为将牛冷冻冻精解冻后剪掉盛装牛冷冻冻精的细管的非棉塞端，用推针从棉塞端将解冻后的冻精精液推至离心管中，在18℃、850g条件下离心10分钟，离心后弃上清液；
步骤(3)用staining液将步骤(2)所得的沉淀精子稀释至浓度为1×108个精子/ml，然后加入荧光染料，混合均匀后置于水浴中静置，水浴后用流式细胞仪使x、y精子分离，将x或y精子置于冰箱中平衡，平衡后离心，弃上清液，收集沉淀x或y精子，向x或y精子中加稀释液后冷冻保存。
具体地，步骤(3)中，所述的荧光染料为h33342。
具体地，步骤(3)中，所述的水浴温度为34℃，水浴时间为48分钟。
具体地，步骤(3)中，将x或y精子置于冰箱中平衡，冰箱中的温度控制在4℃，平衡后离心时离心温度控制在4℃，离心力控制在850g，离心时间控制在20min，离心后用稀释液稀释，稀释后置于4℃条件下保存。
具体地，步骤1.1)中所用的naoh为质量分数为15％的naoh溶液。
实施例2
实施例2所采用的staining液和稀释液与实施例1的相同。
①牛冻精的解冻
取2014年11月04日本公司生产的牛号为41104818的牛的普通冻精两剂(0.25ml/剂)，38℃温水中解冻10秒，剪开非棉塞端，用推针从棉塞端把精液推到15ml空离心管(a)中，离心管(a)净重m1＝6.6746g。
②离心，将离心管(a)置于离心机中进行离心，离心条件为：18℃、850g、10分钟。离心后把离心管(a)中上清液去掉，称重后质量为m2＝6.7578g。沉淀精子总重m＝m2-m1＝6.7578g-6.6747g＝0.0831g，沉淀精子密度ρ为1.04g/ml，沉淀精子体积＝m/ρ＝0.0831g/1.04(g/ml)×1000μl＝80μl，从沉淀精子中取10μl放入90μl的staining中，混合均匀，再从含有沉淀精子的staining液中上述混合液中取10μl加入到290μl福尔马林中，从上述300μl福尔马林混合液中取10μl滴入血细胞计数板并在显微镜下数精子数，通过稀释倍数计算出沉淀精子数为2251万。
③染色
向离心管(a)中加入225-80＝135μl精子staining液，再加入h33342荧光染料＝0.2251×15/2＝1.68μl。混合后的液体放入5ml的上样管中，在34℃水浴锅中水浴48min。水浴后上机(放入流式细胞仪上样区)在国标性控分离条件分离收集所需的性别精子。此处分离的是x，收集的x精子用放有1ml稀释液的50ml规格离心管收集并盖上离心管盖并置于4℃冰箱平衡两个小时，根据流式细胞仪上的数据显示，收集x精子数为300万。
上述“③染色”中所述的“225-80＝135μl”的计算规则是在后续的操作中一般将精子浓度调成1×108个/ml，2251万沉淀精子对应体积为225微升的溶液，离心得到的沉淀精子体积为80微升，所以需要加入staining液的体积为225-80＝135μl。
对收集得到的x精子测其精子活力，精子活力的检测方法为取得到的精液滴至载玻片上，采用相差显微镜观察，并将显微镜与显示屏相连，目测计算状态好的精子占的比率。计算所得分离后的精子活力达到0.36(即36％)。
④离心并保存
平衡后的精子在4℃、850g离心条件下离心20分钟，弃上清，按60微升稀释液/100万精子加稀释液，所添加的稀释液的量＝300×60/100＝180微升稀释液，然后置于4℃冰箱保存备用。
实施例3
实施例3所采用的staining液和稀释液与实施例1的相同。
①牛普通冻精的解冻
取2015年11月23日本公司生产的牛号为41110294的牛的普通冻精两剂(0.25ml/剂)，38℃温水中解冻10秒，剪开非棉塞端，用推针从棉塞端把精液推到15ml空离心管(b)中，离心管(b)净重m1＝6.6815g；
②离心
离心，将离心管(b)置于离心机中进行离心，离心条件为：18℃、850g、10分钟。弃上清液。称重后重量m2＝6.7501g。计算沉淀体积＝(6.7501-6.6815)/1.04×1000μl＝66μl。从沉淀精子中取10μl放入90μl的staining液中，混匀，再从该混合液中取10μl加入到290μl福尔马林中，从上述300μl福尔马林混合液中取10μl滴入血细胞计数板在显微镜下数精子数，最后通过稀释倍数计算出沉淀里精子数为2443万。
③染色
向离心管(b)中加入244-66＝178μl精子staining液，再加入h33342荧光染料＝0.2443×15/2＝1.8μl。混合后的液体放入5ml的上样管中在34℃水浴锅中水浴48min。水浴后上机(放入流式细胞仪上样区)在国标性控分离条件参数下分离收集所需的性别精子。此处分离的是y精子。收集y精子用放有1ml稀释液的50ml规格离心管收集，并盖上离心管盖并置于4℃冰箱平衡两个小时，根据流式细胞仪上的数据显示，收集y精子数为380万。
对收集得到的y精子测其精子活力，精子活力的检测方法为取得到的精液滴至载玻片上，采用相差显微镜观察，并将显微镜与显示屏相连，目测计算状态好的精子占的比率。计算所得分离后的精子活力达到0.3(即30％)。
④离心并保存
平衡后的y精子在4℃、850g离心条件下离心20分钟，弃上清液，按60微升稀释液/100万精子加稀释液，所添加的稀释液的量＝3.8×60＝228微升稀释液，然后置于4℃冰箱保存备用。
以上对本发明所提供的设计方案进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。