本发明涉及一种atm蛋白抑制剂促进生成诱导多能干细胞的应用，属于细胞生物技术领域。
背景技术
据发明人所知，2006年有研究者首次使用体细胞通过转录因子介导的方法获得诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，ipscells)，自此以后，诱导多能干细胞技术，由于其能够从体细胞直接获得，避免多能干细胞来源于胚胎的伦理问题，以及在再生医学中的广泛应用前景，已成为干细胞研究领域的热点。
虽然诱导多能干细胞技术的改进已经大大提升了ips细胞的诱导速率和效率，但重编程过程涉及的分子调控机制在很大程度上仍然未完全阐明，ips细胞还不能完全实现临床转化。其中，诱导过程引发的dna损伤造成ips细胞基因组稳定性低，增加该细胞的癌化和成瘤风险，这成为严重影响诱导多能干细胞技术在再生医学领域的应用重要原因之一。
重编程过程中的dna双链断裂(dnadouble-strandbreaks，dsbs)是诱发dna损伤应答的关键因素之一。有研究报道证实，上调zscan4的表达，明显降低重编程过程中dna损伤应答的发生，有利于建立基因组更加稳定的ips细胞，并且该细胞表现出更加完整的多能性。另外，当重编程过程中短暂抑制p53，不但有利于高效获得ips细胞，而且能降低ips细胞的基因拷贝数变异。这些结果显示，重编程过程中，降低细胞dna损伤应答的发生对于建立高基因组稳定性的ips细胞具有重要作用。然而，重编程诱发dna损伤的分子机制还不清楚，干扰dna损伤的发生对于ips细胞的诱导和安全性的提高还有待研究。
共济失调-毛细血管扩张突变基因(ataxiatelangiectasiamutated，atm)是磷脂酰肌醇-3-激酶相关激酶家族成员，是dna双链断裂的重要感应元件，可将dsbs信号传递给下游底物，参与dna损伤修复、细胞周期、自噬、存活、凋亡等多个生物学事件。atm在维持干细胞基因组的完整性方面发挥重要作用。利用atm基因突变的体细胞进行重编程时，其诱导效率显著下降，ips细胞不能够在体外长期稳定培养，基因组不稳定性增加，且对x射线辐射敏感。但是也有研究显示，将体细胞重编程为肝细胞过程中，atm基因活性的下降显著促进诱导肝细胞(inducedhepaticcells，ihepcells)的生成。
经检索发现，专利号cn201410382321.2、授权公告号cn104140951b的中国发明专利，公开一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，包括以下步骤：a.制备人成纤维样细胞饲养层：取人成纤维样细胞，接种至培养皿上；用10毫克/毫升丝裂霉素c提前处理3个小时，去除丝裂霉素c；b.培养：重编程体细胞，生成人诱导多能干细胞，并将人诱导多能干细胞移植于步骤a中制备的饲养层中培养。该技术方案中，采用人诱导多能干细胞分化形成的人成纤维样细胞作为饲养层来培育人诱导多能干细胞，免除了非人异种因子污染和动物病原体的传播的风险，同时由于人诱导多能干细胞可在体外无限期培育，因此使用该方案的饲养层细胞也能无限期的大量制备。然而，该技术方案并没有关注到重编程过程中的dna损伤问题，无从教导如何抑制dna损伤。
技术实现要素：
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种atm蛋白抑制剂促进生成诱导多能干细胞的应用，并提供基于该应用的诱导多能干细胞的制备方法。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
atm蛋白抑制剂用于促进体细胞重编程生成诱导多能干细胞的用途。
优选地，以对体细胞实施重编程的当天为第0天；在预设时间段采用atm蛋白抑制剂对体细胞进行处理；所述预设时间段为：第0天至第4天、第0天至第6天、第2天至第4天、或第4天至第6天。更优选地，所述预设时间段为第2天至第4天。
优选地，所述atm蛋白抑制剂为ku-60019或ku-55933；所述ku-60019的结构如式i所示：
所述ku-55933的结构如式ii所示：
优选地，所述atm蛋白抑制剂的处理浓度为至少100ng/ml。具体而言，所述atm蛋白抑制剂的处理浓度为300ng/ml。
本发明还提供：
一种诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：将体细胞重编程后生成诱导多能干细胞；其特征是，以实施重编程的当天为第0天；在预设时间段采用atm蛋白抑制剂对体细胞进行处理；所述预设时间段为：第0天至第4天、第0天至第6天、第2天至第4天、或第4天至第6天。
优选地，所述atm蛋白抑制剂为ku-60019或ku-55933。
优选地，所述atm蛋白抑制剂的处理浓度为至少100ng/ml。
优选地，所述重编程包括以逆转录病毒为载体将转录因子导入体细胞；所述转录因子有4个且分别为oct4、sox2、klf4、c-myc。
本发明不但能够有效提高ips细胞诱导效率，而且显著降低ips细胞的成瘤风险，增加了细胞的安全性。
附图说明
图1为本发明实施例1中的atmmrna的相对表达量，以及atm蛋白、磷酸化atm蛋白(patm)的表达量结果图。
图2为本发明实施例1中不同浓度ku-60019处理后，磷酸化atm蛋白(patm)的表达量结果图。
图3为本发明实施例1中ku-60019在重编程过程中的添加策略示意图。
图4为本发明实施例1中不同ku-60019添加组中oct4-gfp阳性克隆比率结果图。
图5为本发明实施例1中300ng/mlku-60019在pd2-pd4和pd0-pd4添加后oct4-gfp阳性克隆数结果图。
图6为本发明实施例1中ai-ips细胞和c-ips细胞的形态结果图。
图7为本发明实施例2中ai-ips-1、ai-ips-7、c-ips-2、c-ips-8和og-es细胞中多能性基因的表达结果图。ai-ips-1、ai-ips-7分别为300ng/mlku-60019处理后重编程所建立的两个细胞系；c-ips-2、c-ips-8分别为未处理对照组细胞重编程后所建立的两个细胞系。
图8为本发明实施例2中ai-ips和og-es细胞多能性蛋白的免疫染色结果图，标尺＝100μm。免疫染色结果图的原图为彩图，图中红色表示多能性标记蛋白sox2、oct4、nanog、klf4、e-cad、ssea1，蓝色表示dapi。
图9为本发明实施例2中ai-ips和og-es细胞类胚体及其三胚层标记蛋白染色结果图，标尺＝100μm。免疫染色结果图的原图为彩图，图中绿色表示类胚体，红色表示三胚层标记蛋白nestin、gata4、t，蓝色表示dapi。
图10为本发明实施例2中ai-ips和og-es细胞畸胎瘤形成的内胚层单层柱状上皮、中胚层肌肉和软骨以及外胚层的神经和表皮结果图，标尺＝50μm。
图11为本发明实施例2中ai-ips和og-es细胞的嵌合体后代结果图。
图12为本发明实施例2中ai-ips细胞的核型结果图。
图13为本发明实施例3中k-pd4、c-pd4、k-pd8和c-pd8细胞γh2ax免疫染色结果图，标尺＝5μm，以及随机100个细胞中，γh2ax焦点数>10细胞的比例图。免疫染色结果图的原图为彩图，图中红色表示γh2ax，蓝色表示dapi。
图14为本发明实施例3中γh2ax在k-pd4、c-pd4、k-pd8和c-pd8细胞的蛋白表达结果图。
图15为本发明实施例3中重编程pd0、pd2、pd4、pd8、pd12细胞中brca1、brca2、nbs1基因的表达结果图。
图16为本发明实施例3中k-pd4、c-pd4、k-pd8和c-pd8细胞中53bp1、chk2和pchk2蛋白的表达结果图。
图17为本发明实施例3中k-pd4、c-pd4、k-pd8和c-pd8细胞中p19、p16、p53、pp53、p21蛋白的表达结果图。
图18为本发明实施例3中重编程pd0、pd2、pd4、pd8、pd12细胞中p53信号通路相关基因表达结果图。
图19为本发明实施例4中k-pd4、c-pd4、k-pd8和c-pd8细胞的凋亡分析结果图。
图20为本发明实施例4中k-pd4、c-pd4、k-pd8和c-pd8细胞的老化分析结果图。
图21为本发明实施例4中连续注射检测ai-ips和c-ips细胞成瘤性策略示意图。
图22为本发明实施例4中ai-ips细胞和c-ips细胞经3次连续移植后形成的畸胎瘤结果图。
图23为本发明实施例4中ai-ips细胞和c-ips细胞经3次连续移植后畸胎瘤重量分析结果图。
图24为本发明实施例4中ai-ips细胞与c-ips细胞成瘤能力对比结果图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1、atm蛋白抑制剂添加策略及对ips细胞诱导的影响
本实施例采用的atm蛋白抑制剂为ku-60019。注：atm蛋白即共济失调-毛细血管扩张突变蛋白。
本实施例制备诱导多能干细胞的基本过程为：将体细胞重编程后生成诱导多能干细胞(即ips细胞)；其中，重编程包括以逆转录病毒为载体将转录因子导入体细胞，转录因子有4个且分别为oct4、sox2、klf4、c-myc。以实施重编程的当天为第0天。
本实施例利用oct4-gfp报告小鼠胚胎成纤维细胞(mef)进行重编程研究，该细胞重编程过程中当内源干细胞核心基因oct4被激活即表达绿色荧光，用以指示细胞达到ips细胞状态。
首先，对atm在体细胞重编程过程中的表达和激活情况进行了分析。一方面，以成纤维细胞(mef)中atmmrna的表达量为比较基准，检测重编程第3、6、9、12天的atmmrna的相对表达量；另一方面，以gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参蛋白，检测成纤维细胞(mef)和重编程第3、6、9天时atm蛋白、磷酸化atm蛋白(patm)的表达量。如图1所示，结果表明，atmmrna和atm蛋白均在重编程后期显著激活，但是磷酸化atm蛋白在重编程早期即明显上调。
为进一步检测不同浓度ku-60019对重编程中atm蛋白表达的抑制，在重编程第3天(day3)使用ku-60019处理24小时，检测磷酸化atm蛋白(patm)的表达量。如图2所示，结果表明，当ku-60019浓度为100ng/ml时，明显抑制atm的磷酸化水平，并且随着浓度的增加抑制作用逐渐增强。
确定ku-60019在重编程过程中的添加策略，如图3所示：使用100、300、600ng/ml分别在病毒感染后pd0-pd2(即第0天到第2天，以此类推)、pd0-pd4、pd0-pd6、pd0-pd8、pd0-pd10，以及pd2-pd4、pd4-pd6、pd6-pd8、pd8-pd10对细胞进行处理，之后继续诱导至第14天，然后根据oct4-gfp阳性克隆结果来分析对ips细胞诱导的影响。
如图4所示，结果表明，在pd0-pd4、pd0-pd6、pd2-pd4、pd4-pd6以300、600ng/ml的ku-60019进行处理，能显著促进oct-gfp阳性克隆的产生(p<0.05)。此外，随着ku-60019处理实验的延长显著抑制oct-gfp阳性克隆的产生，且在重编程后期处理也显著抑制oct-gfp阳性克隆的产生。比较100、300、600ng/ml对重编程的影响显示，300ng/ml能更高效的促进oct-gfp阳性克隆的产生。
进一步比较pd0-pd4和pd2-pd4两个时间段，分别添加300ng/ml的ku-60019，如图5所示，结果表明在pd2-pd4短期抑制atm的重编程效率更高。此外，如图6所示，300ng/ml的ku-60019在pd2-pd4添加获得的ips细胞(ai-ips)与对照组(c-ips)细胞在形态上没有明显差异，并且均显著表达gfp，显示绿色荧光。
需要说明的是，采用atm蛋白抑制剂ku-55933按本实施例进行研究有着类似的结果，即：当ku-55933浓度大于或等于100ng/ml时，明显抑制atm的磷酸化水平，并且随着浓度的增加抑制作用逐渐增强；在pd0-pd4、pd0-pd6、pd2-pd4、pd4-pd6以ku-55933进行处理，能显著促进oct-gfp阳性克隆的产生。限于篇幅，不在此列出详细试验数据和结果图。
实施例2、ai-ips细胞多能性分析
在实施例1基础上，以300ng/ml的ku-60019在pd2-pd4添加获得ips细胞。比较分析ai-ips、c-ips和oct4-gfp胚胎干细胞(oct4-gfpembryonicstemcells，og-escells)中oct4、sox2、nanog、zfp42、zfp296、esrrb、nr5a2、dppa3、dppa5和utf1维持多能性的基因表达情况，如图7所示，结果表明，ai-ips细胞与对照组和og-es细胞具有类似的表达模式。
经免疫细胞化学检测，如图8所示，结果显示，oct4、sox2、nanog定位于ai-ips细胞核，e-cadherin和ssea1定位于细胞膜，与og-es细胞的定位模式相同。
如图9所示，ai-ips细胞与og-es细胞类似，能够在体外分化为类胚体，并向三胚层分化，表达三胚层细胞标记蛋白，nestin(外胚层)、t(中胚层)和gata4(内胚层)。
如图10所示，ai-ips细胞也能够在体内形成畸胎瘤，并分化为三胚层组织。如图11所示，当将ai-ips细胞注射入囊胚腔内，移植后能够获得嵌合体后代。此外，如图12所示，经核型分析显示，ai-ips细胞具有正常的细胞核型。
需要说明的是，采用atm蛋白抑制剂ku-55933按本实施例进行研究，由其结果所得结论与ku-60019一致。限于篇幅，不在此列出详细试验数据和结果图。
实施例3、抑制atm下调重编程过程中的dna损伤应答
atm作为dna损伤应答的关键调控因子，通过多种信号通路参与dna的修复。
研究显示dna发生损伤时，γh2ax首先结合于dna断裂位点。分别选取重编程ku-60019处理的pd4(k-pd4)和pd8(k-pd8)，以及对照组pd4(c-pd4)和pd8(c-pd8)的细胞进行γh2ax染色，结果显示atm的抑制显著降低重编程过程中双链断裂的发生，细胞核内γh2ax染色焦点大于10个的细胞明显减少(如图13所示)，且γh2ax激活被抑制(如图14所示)。
进一步分析与重编程dna损伤修复相关基因的表达显示，atm的抑制显著降低brca1和brca2的表达(如图15所示)，但是没有影响损伤修复复合物中53bp1、chk2的表达和激活(如图16所示)。
进一步检测p53信号通路相关蛋白的表达显示，培养液添加ku-60019，显著抑制p53的磷酸化，进而影响下游p21的表达，但是并没有影响p16和p19的表达(如图17所示)。
此外，与p53调控细胞凋亡相关的puma表达显著下调，与细胞存活相关的bcl2的表达显著上调，但是没有影响mdm2、bax和caspase3的表达(如图18所示)。
需要说明的是，采用atm蛋白抑制剂ku-55933按本实施例进行研究，由其结果所得结论与ku-60019一致。限于篇幅，不在此列出详细试验数据和结果图。
实施例4、抑制atm降低重编程过程中细胞的凋亡、老化及ips细胞成瘤性
分别选取重编程ku-60019处理的pd4(k-pd4)和pd8(k-pd8)，以及对照组pd4(c-pd4)和pd8(c-pd8)的细胞进行分析。
分析细胞的凋亡和老化显示，重编程过程中，短期抑制atm可显著降低k-pd4细胞的早期(earlyapoptosis)和晚期(laterapoptosis)凋亡水平，以及k-pd8细胞的晚期凋亡(p<0.05)。因此，细胞总体凋亡水平显著下降(如图19所示)。
另外，利用sa-β-gal检测细胞老化显示，k-pd4和k-pd8细胞中sa-β-gal阳性细胞的比例显著低于c-pd4和c-pd8细胞。因此，细胞的老化程度显著下降(如图20所示)。
干细胞的成瘤性是判断细胞是否具有更高生物安全性的关键评判指标，即连续成瘤能力越低，表明细胞的癌化程度越低，生物安全性越高。为了进一步比较atm抑制后对细胞成瘤能力的影响，本实施例采用检测多能干细胞、癌干细胞成瘤性的金标准，连续移植实验，对ai-ips和c-ips细胞的成瘤性进行了分析。共建立了12株ai-ips细胞系和18株c-ips细胞系。随机各选取其中的5株，细胞编号：ai-ips#1、#4、#6、#10、#12和c-ips#1、#3、#7、#11、#18，在第10代时，将2×107细胞移植入免疫缺陷小鼠的皮下，30天后收集形成的畸胎瘤，通过胶原酶和胰蛋白酶联合消化制备单细胞悬液，取2×107活细胞再进行移植，此后连续重复上述过程，直至移植后30天无法见到瘤形成为止，每株细胞进行三次重复实验(如图21所示)。
在4个月期间共统计了4次连续移植后畸胎瘤的重量，比较显示，ai-ips细胞的连续成瘤能力显著低于c-ips细胞(如图22、图24所示)。
第一次移植后(1st)，所有细胞系都能够形成畸胎瘤，ai-ips细胞畸胎瘤重量与c-ips细胞没有显著差异(p＝0.08)；第二次移植后(2nd)，在ai-ips细胞的15只注射小鼠中，有10只再次成瘤，而对照组有13只再次成瘤，但ai-ips细胞畸胎瘤重量显著低于对照组(p<0.05)；第三次移植后(3rd)，在ai-ips细胞的15只注射小鼠中，有3只再次成瘤，而对照组有6只再次成瘤，但畸胎瘤重量上没有差异(p>0.05)；没有细胞系能在第四次移植后产生畸胎瘤(如图23、图24所示)。
需要说明的是，采用atm蛋白抑制剂ku-55933按本实施例进行研究，由其结果所得结论与ku-60019一致。限于篇幅，不在此列出详细试验数据和结果图。
由以上实施例结果可知，在体细胞重编程过程中，于适当时机添加适当浓度的atm蛋白抑制剂(如ku-60019、ku-55933)，对体细胞进行处理，能够有效提高ips细胞诱导效率，并且该细胞维持完整的多能性及正常核型；能有效抑制ips细胞诱导过程中产生的dna损伤应答，抑制p53信号通路的激活，激活细胞存活相关基因的表达，减少重编程过程中细胞的凋亡和老化；所得ips细胞在成瘤性方面显著降低，增加了细胞的安全性。