本发明涉及一种含有胆固醇胶束的培养基溶液的制备方法。
背景技术
胆固醇是人类生存所必需的营养成分，具有重要的生理功能，它既是构成细胞的重要成分，又可在体内转化形成类固醇激素，并且是合成维生素d3的原料及胆汁酸的前体，但是如果体内胆固醇含量过高也会造成危害。现在，与体内胆固醇过量有关的动脉硬化、冠心病、脑中风等心脑血管疾病，已严重威胁着人类健康，因此，开发降胆固醇的药物迫在眉睫。很多研究表明，益生菌具有降胆固醇作用，开展相关胆固醇降解能力测定的实验首先在体外进行，因此，在进行降胆固醇体外实验时制备稳定的胆固醇体系尤为重要。
胆固醇为环戊烷多氢菲的衍生物，是一种蜡样、鳞状的化学物质，因最初发现于胆石而得名。胆固醇不溶于水，易溶于甲苯和环己烷等有机溶剂。在进行降胆固醇体外实验时，由于胆固醇在溶液中不能稳定存在，易沉淀，在测定发酵上清中的胆固醇时，测得的结果往往偏大，给实验造成较大误差。
为了使胆固醇溶于发酵培养基，使胆固醇在发酵培养基中稳定存在，有研究者直接将胆固醇加入热培养基中搅拌混匀，制备胆固醇终浓度为70-100μg/ml，但是胆固醇12-24小时内会发生沉淀，效果不理想。有研究者将胆固醇和tween-80加热乳化后趁热加入培养基中，胆固醇会暂时均匀分散在培养基体系内，但是最终还会沉淀，不利于长时发酵实验。也有研究者（宋小娟.适用于肉制品发酵的降胆固醇乳酸菌的筛选及性能评价[d].贵州大学,2016.）用冰醋酸作为胆固醇的溶剂加入到溶液中，导致溶液初始ph偏低，对产生不必要的实验影响和误差，例如在测定益生菌降低胆固醇能力的实验中，培养基溶液低ph会抑制菌株增殖和代谢，导致评估偏差。还有研究者（razins,kutners,efratih,etal.phospholipidandcholesteroluptakebymycoplasmacellsandmembranes[j].biochimbiophysacta,1980,598(3):628-640.）制备得到一种卵磷脂-胆固醇溶液，但是该操作复杂且需即配即用。还有一种市售的水溶性胆固醇溶液，由于其价格昂贵，很难为日常大批量实验所接受。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术中胆固醇不溶于水以及不能长期均匀分散在发酵培养基中和胆固醇的检测误差大等问题，本发明的目的在于提供一种含有胆固醇胶束的培养基溶液的制备方法，该方法不仅加快了胆固醇在水相体系中的溶解，而且使得制成的胆固醇胶束溶液在加入至发酵培养基能够均匀稳定存在，不沉淀，且不改变发酵培养基的ph，能够降低胆固醇的检测误差。
本发明是通过以下技术方案实现；
一种含有胆固醇胶束的培养基溶液的制备方法，包括如下步骤：
（1）称量胆固醇放入试管中，加入牛胆盐、蔗糖脂肪酸酯、tween-80，移取无水乙醇于试管中，进行水浴加热，然后采用涡旋混合器涡旋混合均匀，得到粗混合液；
（2）将粗混合液用超声波处理，间隔4~8min进行涡旋混匀，待溶液澄清透明后用微孔滤膜过滤除菌，得到胆固醇胶束溶液；
（3）趁热将得到的胆固醇胶束溶液加入到发酵培养基中，用磁力搅拌器搅拌均匀，使胆固醇胶束在发酵培养基体系中均匀分散，放置72h以上均无胆固醇析出现象，即得含有胆固醇胶束的培养基溶液。
其中，步骤（1）中，所述胆固醇为95%胆固醇，无水乙醇为分析纯；且所述胆固醇：牛胆盐：蔗糖脂肪酸酯的质量比为（0.8～1.5）：2：1，所述tween-80：无水乙醇的体积比为1：（5～10）。
其中，步骤（1）中，所述水浴加热的加热温度范围为60～90℃，加热时间为8～10min，采用涡旋混合器涡旋的时间为1～1.5min。
其中，步骤（2）中，所述超声波处理超声溶解的水温保持在60～90℃，超声功率为80w，超声时间为15～25min。
其中，步骤（2）中，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
其中，步骤（3）中，所述磁力搅拌器的搅拌转速为700~800rpm，搅拌时间为10~15min。
其中，步骤（3）中，所述发酵培养基为经过高温灭菌的益生菌、乳酸菌通用培养基和选择性培养基，例如，mrs液体培养基，mc液体培养基，tpy液体培养基。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明采用无水乙醇作为溶剂，并采用特定超声温度的超声波工艺条件，以及对各项工艺参数进行优化，制备得到含有胆固醇胶束的培养基溶液，该制备方法不仅加快了胆固醇在水相体系中的溶解，而且使得制成的胆固醇胶束溶液在加入至发酵培养基能够均匀稳定存在，不沉淀，且对发酵培养基溶液ph无影响，能够降低胆固醇的检测误差；同时该方法操作简便，成本低，适于规模量产。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：
一种含有胆固醇胶束的培养基溶液的制备方法，包括如下步骤：
（1）称量0.8g95%胆固醇放入试管中，加入2.0g牛胆盐、1.0g蔗糖脂肪酸酯、1.0mltween-80，移取5ml无水乙醇于试管中，加试管塞，将试管放于80℃恒温水浴锅中进行水浴加热10min，然后采用涡旋混合器涡旋1min，混合均匀，得到粗混合液；
（2）将得到的粗混合液置于水温为90℃的热水中用超声功率为80w的超声波处理15min，间隔6min进行涡旋1min混匀，待溶液澄清透明后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除去细菌等微生物，得到胆固醇胶束溶液；
（3）趁热将得到的胆固醇胶束溶液加入到经过高温灭菌的mrs液体培养基中，用转速为700rpm的磁力搅拌器搅拌15min，使胆固醇胶束在发酵培养基体系中均匀分散，放置72h以上均无胆固醇析出现象，即得含有胆固醇胶束的培养基溶液。
实施例2：
一种含有胆固醇胶束的培养基溶液的制备方法，包括如下步骤：
（1）称量1.0g95%胆固醇放入试管中，加入2.0g牛胆盐、1.0g蔗糖脂肪酸酯、1.0mltween-80，移取10ml无水乙醇于试管中，加试管塞，将试管放于90℃恒温水浴锅中进行水浴加热8min，然后采用涡旋混合器涡旋1min，混合均匀，得到粗混合液；
（2）将得到的粗混合液置于水温为85℃的热水中用超声功率为80w的超声波处理20min，间隔6min进行涡旋1min混匀，待溶液澄清透明后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除去细菌等微生物，得到胆固醇胶束溶液；
（3）趁热将得到的胆固醇胶束溶液加入到经过高温灭菌的mrs液体培养基中，用转速为750rpm的磁力搅拌器搅拌12min，使胆固醇胶束在发酵培养基体系中均匀分散，放置72h以上均无胆固醇析出现象，即得含有胆固醇胶束的培养基溶液。
实施例3：
一种含有胆固醇胶束的培养基溶液的制备方法，包括如下步骤：
（1）称量1.5g95%胆固醇放入试管中，加入2.0g牛胆盐、1.0g蔗糖脂肪酸酯、1.0mltween-80，移取10ml无水乙醇于试管中，加试管塞，将试管放于60℃恒温水浴锅中进行水浴加热8min，然后采用涡旋混合器涡旋1.5min，混合均匀，得到粗混合液；
（2）将得到的粗混合液置于水温为60℃的热水中用超声功率为80w的超声波处理25min，间隔6min进行涡旋1min混匀，待溶液澄清透明后用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除去细菌等微生物，得到胆固醇胶束溶液；
（3）趁热将得到的胆固醇胶束溶液加入到经过高温灭菌的mrs液体培养基中，用转速为800rpm的磁力搅拌器搅拌10min，使胆固醇胶束在发酵培养基体系中均匀分散，放置72h以上均无胆固醇析出现象，即得含有胆固醇胶束的培养基溶液。
对比例1：
一种含有胆固醇胶束的培养基溶液的制备方法，包括如下步骤：步骤（2）中超声波处理超声溶解的水温为40℃，其他同实施例1。
对比例2：
一种含有胆固醇胶束的培养基溶液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1）中采用冰醋酸替代无水乙醇作溶剂，其他同实施例1。
对比例3：
一种胆固醇溶液的制备方法，包括如下步骤：称量0.8g95%胆固醇溶于5ml无水乙醇中，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌后直接加入灭菌后的mrs培养基中，制备得到胆固醇溶液。
该制备得到的胆固醇溶液很容易沉淀，不利于长时发酵实验。
对比例4：
一种卵磷脂-胆固醇胶束溶液的制备方法，参考文献（（razins,kutners,efratih,etal.phospholipidandcholesteroluptakebymycoplasmacellsandmembranes[j].biochimbiophysacta,1980,598(3):628-640.）），具体包括如下步骤：称量100mg胆固醇和220mg卵磷脂（摩尔比为0.9:1.0）于100ml锥形瓶，加入chcl3溶剂5ml。通入n2，然后加入100ml0.4mol蔗糖溶液。冰浴条件下一边通n2一边超声溶解15min，然后暂停5min来散热，以此循环三次。溶解后，形成均匀溶液后于4℃下38000×g离心10min，上清液即为卵磷脂-胆固醇胶束溶液，4℃冰箱保存并于当天使用。
该制备方法操作复杂，且得到的卵磷脂-胆固醇胶束溶液需即配即用。
分别将实施例1-3及对比例1-4制备得到的含有胆固醇胶束的培养基溶液或胆固醇溶液或卵磷脂-胆固醇胶束溶液趁热加入到经过高温灭菌的mrs液体培养基中，测定不同存放时间后的ph值和滴定酸度，测试结果如表1所示。
表1实施例1-3及对比例1-4制备得到的胆固醇胶束在mrs空白培养基中的测试结果
注：“++”代表溶液澄清透明，无沉淀析出，很稳定；“+”代表溶液轻微浑浊，无沉淀析出，稳定；“—”代表有沉淀析出，溶液不稳定。
分别称取实施例1-3及对比例1-4制备得到的胆固醇胶束溶液或胆固醇溶液或卵磷脂-胆固醇胶束溶液，并趁热加入到100ml经过高温灭菌的mrs液体培养基中，使得初始理论胆固醇浓度为0.20mg/ml，用磁力搅拌器混匀后分别按照相同接种量接入嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌，分装到发酵试管中，每管中发酵液为10ml，发酵60小时，与此同时，未接菌的空白实施例1-3的mrs-胆固醇培养基依旧澄清透明，无沉淀析出；未接菌的空白对比例1-4的mrs-胆固醇培养基略微浑浊，部分沉淀析出。每组做三个平行，然后取三个平行组的发酵离心上清液，用邻苯二甲醛比色法测上清液中的胆固醇。该方法将发酵液的离心上清液经过皂化、萃取、蒸发有机溶剂等步骤，在得到的胆固醇残留物中加入邻苯二甲醛试剂、浓硫酸等试剂，于紫外可见分光光度计550nm下测定od值。再将三组平行实验测得3个数值计算od平均值和标准差，用于代入胆固醇标准曲线方程计算胆固醇浓度。因此，od值的准确性决定了数据的准确性。测定结果如表2所示。
表2实施例1-3及对比例1-4制备得到的胆固醇胶束在接菌后的mrs培养基中的测试结果
注：标准差是方差的算术平方根。标准差能反映一个数据集的离散程度，标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，越稳定。标准偏差越高，这些值偏离平均值就越大，越不稳定。
由表2可以看出，在测定的菌株发酵降解胆固醇能力的实验中，实施例1-3发酵后溶液上清液中胆固醇od平均值接近且标准差偏低，检测误差小；对比例1-4发酵后溶液中胆固醇由于不稳定易沉淀，造成上清液胆固醇od平均值低于实施例1-3发酵后溶液上清液中胆固醇od平均值，同时标准差值较大，说明检测误差大，无法正确评估菌株发酵降解胆固醇能力。