抗MG7-Ag的单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明属于免疫学领域，涉及抗mg7-ag的单克隆抗体及其用途，更具体地涉及包含所述抗体的试剂盒在检测样品中mg7-ag水平的用途，以及包含所述抗体的试剂盒在辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和肿瘤患者预后判断中的用途。

背景技术：

肿瘤蛋白标识物是肿瘤细胞产生和释放的某种物质，常以抗原、酶、蛋白或肽类激素等代谢产物的形式存在于病人肿瘤细胞组织内或宿主体液、排出物中，根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。肿瘤蛋白标识物在临床上主要用于对原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断、肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等。近年来，新的肿瘤标记物不断发现、检查手段不断完善和改进，使得其灵敏性和准确性不断提高，为肿瘤患者的早期诊断和早期治疗提供更确切充足的依据。

恶性肿瘤的发病率近年来在全球范围内继续呈上升之势。胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，目前中国每年胃癌新发病例居全球首位，患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多，约每2～3分钟就有1名中国人死于胃癌。现在胃癌在中国的死亡率已经仅次于肺癌，是第二大癌症杀手。由于胃癌的发病大多较为隐匿，早期没有明显症状，病人就诊时往往已经到了晚期，并且许多在临床传统病理及tnm分期表现相近的病人，其预后也有较大的差异，反映出胃癌发生、发展的复杂性。目前尚缺乏能用于诊断或预后判断的理想胃癌肿瘤标志物。如几十年来作为消化道肿瘤的标志物癌胚抗原(cea)在一些非肿瘤性疾病如胃炎、肝硬化、溃疡性结肠炎中也可有升高，其特异性并不理想。因此，寻找与胃癌发生、发展相关的肿瘤标志物和/或肿瘤抗原，对胃癌的临床诊断、监视病情发展及判断预后均有重要意义，同时对肿瘤发生的分子机制研究也有重要意义。

mg7-ag是通过将低分化胃癌细胞株作为免疫原成功制备的胃癌单克隆抗体所识别的抗原，研究表明：从正常胃粘膜到慢性胃炎再到上皮内瘤变的演变过程中，mg7-ag的表达阳性率明显增加(p<0.001)。同时发现mg7-ag的阳性表达与胃癌的侵润深度呈正相关(p<0.001)，进而对mg7-ag进行生存分层分析发现它与临床晚期患者(iii和iv期)的预后相关(p＝0.033)，与cea、ca199、ca125和ca72-4等传统肿瘤抗原相比，mg7-ag的阳性率明显较高(p<0.05)。以上研究表明mg7-ag在癌前病变中已有显著的表达升高，说明它可能是胃癌发生过程的一个关键调控分子；mg7-ag在胃癌诊断方面拥有更好的敏感性；另外mg7-ag可能是判断临床晚期患者预后好坏的独立指标。

上述研究表明mg7-ag与细胞的增殖、转化、恶变密切相关，并且在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要的功能。然而，现有技术中用于检测mg7-ag的定量方法主要有采用多克隆抗体的竞争性放射免疫分析方法(ria)和双抗体夹心分析模式的酶联免疫吸附方法(elisa)。elisa方法灵敏度高，特异性强，标记试剂稳定，无ria方法的放射污染和危害，因此用途广泛。但现有试剂盒大都受限于关键试剂如检测抗体不能自己生产，不仅价格昂贵，且质量和稳定性难以长期保障；有的试剂盒还受限于使用多克隆抗体，多抗供量有限且批间差异大，这样的试剂盒难以适应大批量长时期开展前瞻性临床研究的需要。

基于此，当前迫切需要特异性强、敏感性高的抗mg7-ag单克隆抗体，以便有助于胃癌的临床诊断、预后判断，并指导临床治疗。

技术实现要素：

因此，为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗mg7-ag单克隆抗体，该抗mg7-ag单克隆抗体质地均一、稳定性好、可长期大批量生产；本发明还提供了一种操作简便、灵敏度高、成本低、可适用于大批量生产的抗mg7-ag检测的试剂盒。此外，本发明的抗mg7-ag单克隆抗体还可以用于免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组化法、酶联免疫吸附法或免疫化学发光法，以及用于制备治疗mg7-ag阳性的肿瘤的药物。

一方面，本发明提供了一种抗mg7-ag单克隆抗体mgd1-ab，其中，所述单克隆抗体mgd1-ab由保藏号为cctccno:c2016130的杂交瘤细胞株mgd1分泌。

另一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株mgd1，所述杂交瘤细胞株的保藏号为cctccno:c2016130。

其中，杂交瘤细胞株mgd1的保藏号为cctccno:c2016130(保藏日期：2016年6月23日，保藏号为cctccno:c201613，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心邮编：430072)；

根据本发明所述的抗mg7-ag单克隆抗体mgd1-ab，其中所述单克隆抗体的亚型鉴定为igg1。

再一方面，本发明提供了一种用于检测样品中mg7-ag的存在和/或其水平的装置，所述装置包括本发明所述的抗mg7-ag单克隆抗体mgd1-ab。

优选地，所述样品为受试个体的组织、血液或体液；优选地，所述体液为腹水；

优选地，所述受试个体为恶性肿瘤病人或罹患恶性肿瘤的高危人群；更优选地，所述恶性肿瘤为胃癌、结肠癌或食道癌。

优选地，所述装置为试剂盒；更优选地，所述装置为用于辅助诊断肿瘤、监测肿瘤和/或肿瘤患者预后判断的试剂盒。

本发明提供了上述单克隆抗体mgd1-ab在制备用于检测样品中mg7-ag的存在和/或其水平的试剂或试剂盒中的用途。所述检测方法使用免疫方法；更优选地，所述免疫方法选自免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组化法、酶联免疫吸附法或免疫化学发光法等。

再另一方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂含有本发明所述的单克隆抗体。所述检测试剂的制备方法可以是本领域技术人员熟知的任何方法，例如将本发明的单克隆抗体与适当的载体，如水、盐水、缓冲剂等混和。本发明的检测试剂可用于临床样本中mg7-ag蛋白表达水平的检测，预测早期肿瘤的转移趋势及患者的预后；亦可用于早期肿瘤患者血清mg7-ag蛋白表达的检测，同时可动态检测肿瘤进展过程中mg7-ag蛋白水平的变化，给临床医生制定个体化的治疗方案提供参考依据。

在本发明的一个实施方式中，申请人使用真核表达纯化的ceacam5蛋白免疫balb/c小鼠，获得分泌抗胃癌单克隆抗体的杂交瘤株mgd1-ab。分别用胃癌组织/癌旁组织的免疫组化对比法或/和elisa方法筛选阳性细胞克隆。本发明人经过多次试验，获得了多株阳性细胞克隆。对这些阳性克隆所分泌的单克隆抗体进行分析鉴定，发现cctccno:c2016130其分泌的mg7-ag单克隆抗体mgd1-ab具有较高的灵敏度和特异性，可识别胃癌抗原mg7-ag蛋白并可用于并不限于免疫组织化学、免疫印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附实验和免疫化学发光等免疫学检测，可用于临床样本中mg7-ag蛋白表达水平的检测。

与现有技术相比，本发明的杂交瘤细胞系具有较强的分泌单克隆抗体的能力，能稳定、大量分泌本发明的单克隆抗体。本发明人发现，虽然现有技术已已证实mg7-ag(实施例4证实mg7-ag是糖基化的ceacam5，mg7-ag是本申请中对糖基化ceacam5的统称，以区别于市面上针对ceacam5抗原的抗体)参与胃癌等多种上皮性肿瘤的发生及发展，尤其mg7-ag的功能与其高度的糖基化相关，目前尚无针对此蛋白的糖基化修饰的抗体，严重影响了该分子在胃癌等肿瘤中的诊断及治疗方面的应用。而本发明单抗能特异性地与糖基化的人ceacam5抗原结合，并且与糖基化的ceacam5具有较高的亲和力和抗原特异性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1a为本发明的mgd1-ab的特异性鉴定(包被mg7-ag蛋白的elisa板，正常鼠igg为抗体阴性对照)；

图1b为本发明的mgd1-ab抗体与商品化抗体cd66e与抗原反应的灵敏度比较

图2为纯化后的mgd1-ab的sds-page分析，从图中可以得知，纯化后的mgd1-ab的纯度很高；

图3为使用mgd1-ab免疫组化检测组织芯片中mg7-ag，表明使用mgd1-ab可检测胃癌组织中的mg7-ag表达，并且结果显示胃癌组织中有mg7-ag的高表达，而胃癌癌旁正常组织中不表达mg7-ag；

图4为使用mgd1-ab免疫印迹检测胃癌细胞中mg7-ag的表达，结果表明mgd1-ab可用于胃癌katoiii细胞中mg7-ag表达的westernblot检测；

图5为使用mgd1-ab，利用免疫共沉淀(co-ip)和lc-ms/ms质谱分析结合鉴定mg7-ag的流程图；

图6a-c为免疫共沉淀(co-ip)和lc-ms/ms质谱分析结合鉴定mg7-ag的ceacam5肽段图；

图7为使用mgd1-ab与其他肿瘤标志物检测mg7-ag在胃癌中的阳性率。

图8为mgdl-ab杀伤胃癌细胞sgc7901(细胞状态，mtt)。

生物保藏信息

其中，杂交瘤细胞株mgd1的保藏号为cctccno:c2016130，保藏日期：2016年6月23日，保藏号为cctccno:c2016130，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心邮编：430072)；

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明的实质，下面通过具体实施例并配合附图进一步详细说明本发明，但本发明并不因此而受到任何限制。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

实施例1抗mg7-ag单克隆抗体mgd1ab的制备及鉴定

1、免疫与细胞融合：

用真核表达纯化的ceacam5蛋白，免疫balb/c小鼠制得单克隆抗体mgd1-ab。

具体方法如下：

各免疫六周龄balb/c小鼠(购自北京维通利华)3只，间隔4周进行第二次免疫，融合前3天经腹腔加强免疫，测定小鼠抗体效价，选取抗体效价最高的小鼠的脾细胞进行细胞融合：融合剂为50％peg4000，sp2/0与脾细胞的比为1:10进行融合，加入含有hat的rpmi-1640培养液，于96孔板中置5％co2、37℃恒温培养箱中进行培养。

阳性杂交瘤细胞的筛选：分别用胃癌组织/癌旁组织的免疫组化对比法或/和elisa方法筛选阳性细胞克隆，最终筛选出一株阳性杂交瘤mgd1-a。

2、克隆与亚克隆：采用有限稀释法，选择阳性值高的杂交瘤细胞进行克隆与亚克隆，直至阳性率达到100％。

3、亚类鉴定：取浓缩细胞培养上清与羊抗鼠igg1、2a、2b、igg3、igm抗血清(上海生物制品研究所)作免疫扩散，测定杂交瘤的igg亚类。mgd1-ab单抗的亚类分别是igg1。

4、特异性分析：在胃癌抗原mg7-ag包被的微孔板中，分别加入稀释不同倍数的mgd1-ab，并加入同样浓度的正常小鼠igg抗体作为阴性对照，室温温育1小时；用pbst(0.05％tween)洗涤反应孔5次；再加入hrp标记的羊抗鼠igg抗b，室温显色15分钟，加入终止液(2mh2s04)。用酶标仪测量a450处的吸光度值。结果参见图1a所示，mg7-ag与mgd1-ab特异性结合，与正常小鼠igg无特异结合。

5、灵敏度比较：在胃癌抗原mg7-ag包被的微孔板中，分别加入稀释100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍10000000倍的mgd1-ab，以及购买的商品化胃癌cea抗体cd66e(ebioscience，anti-humancd66e，e12720-103，100ug)，室温温育1小时；用pbst(0.05％tween)洗涤反应孔5次；再加入hrp标记的羊抗鼠二抗，室温显色15分钟，加入终止液(2mh2s04)。结果参见图1b所示.

从结果中可以得知：mgd1抗体比商品化的cd-66e的灵敏度高，能在稀释10000000倍后与mg7-ag发生显色反应，即该抗体的抗体效价，而cd-66e的效价为1000000

实施例2抗mg7-ag单克隆抗体的腹水制备与纯化

1、腹水的制备：10周龄的雄性balb/c小鼠(购自北京维通利华)腹腔注射0.5ml液体石蜡，10天后每只小鼠腹腔注射经生理盐水洗涤的1x106杂交瘤细胞悬液，待小鼠腹水积聚后收集，分装后-20℃保存。

2、纯化：选用proteing柱(购自金斯瑞，l00209)进行纯化，收集腹水各l0ml经3000rpm离心10min后，吸取上清液，以平衡buffer稀释5倍，0.45μm滤器过滤，应用蛋白纯化仪(购自aktapurifier)进行纯化，经平衡buffer(pbs)洗去杂蛋白后，以ph2.6的酸性洗脱液(100mmol/lglycin-hcl)进行洗脱，收取od280>0.5的组分，最后每毫升中加入100μl2mtris.cl中和液进行中和，将纯化的抗体分装冻存于-20℃保存，另取4μ1进行12％sds-page胶电泳并鉴定其纯度。结果参见图2，纯化的mgd1-ab纯度较高(90％以上)。

实施例3使用mgd1-ab免疫组化法检测组织芯片中mg7-ag的表达

1、选取人胃癌组织芯片(第四军医大学西京医院经病理学确诊的外科手术标本)。用二甲苯脱蜡至梯度酒精脱水，pbs洗2次，5min/次；

2、新鲜配制的3％h2o2室温10min；然后用pbs洗3次，5min/次；

3、10％的正常羊血清室温封闭30min；

4、小心吸弃封闭液，勿洗，分别在切片上滴加适宜浓度的mgd1-ab，4℃孵育过夜。然后用pbs洗涤切片3次；

5、在切片上滴加hrp标记的羊抗鼠igg工作液，在37℃下温育1小时；

6、用pbs洗涤切片2次，将切片浸泡于在底物dab的溶液中显色20分钟；

7、用pbs终止显色，用苏木精对切片进行复染。用1％盐酸酒精分化切片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，然后将盖玻片盖在组织切片上，显微镜下观察。

结果参见图3，使用mgd1-ab可检测胃癌组织中的mg7-ag表达。结果显示，胃癌组织中有mg7-ag的高表达，而胃癌癌旁正常组织中不表达mg7-ag。商品化cd66e抗体(ebioscience,anti-humancd66e,e12720-103,100ug)，可识别同类抗原，但在胃癌组织中的染色不理想，且癌旁有非特异性染色。

实施例4使用mgd1-ab免疫印迹(westernblot)法检测胃癌katoiii细胞中mg7-ag的表达

利用mgd1-ab为一抗，进行免疫印迹检测katoiii细胞(购自atcc，htb-103^tm)中胃癌抗原mg7-ag表达：

1、细胞裂解液ripa裂解人胃癌细胞系katoiii细胞，提取细胞总蛋白进行sds-page电泳，每孔蛋白上样量为50μg；

2、将电泳产物转至硝酸纤维膜，稳压100v，时间1h；

3、5％脱脂奶粉封闭1h.tbst洗3次；

4、抗体1μg/ml(mgd1-ab)4℃孵育过夜；

5、tbst室温洗3次，10min/次；

6、加入hrp标记的羊抗鼠igg(1：3000，5％脱脂奶粉-tbst稀释)，室温孵育2h，tbst摇洗3次，10min/次；

7、显影、定影后晾干保存。

结果参见图4，mgd1-ab可用于胃癌katoiii细胞中mg7-ag表达的westernblot检测。

实施例5使用mgd1-ab鉴定抗原mg7-ag

利用免疫共沉淀(co-ip)和lc-ms/ms质谱分析结合进行mg7-ag的鉴定。mg7-ag的鉴定过程与结果参见图5。

1、免疫共沉淀(co-ip)

katoiii细胞裂解液1ml+3mliplysisbuffer，混匀后(此处分出50ul留做input)加proteina/g80μl，4℃翻转反应1h，1000g4℃离心5min，取上清(预清除)；每1ml样品10μg抗体(mgd1-ab，对照igg抗体)，

4℃翻转反应1h；加40μlproteina/g，4℃翻转反应过夜；4℃1000rpm离心5min，吸掉上清，加pbs1ml混匀离心，吸掉上清，重复洗4次，加40ulloadingbuffer煮沸10min，离心，10％sds-page电泳，分别用考马斯亮蓝和硝酸银进行凝胶染色；

lc-ms/ms质谱分析：

根据凝胶染色结果，比较抗体组和对照组的蛋白条带，从胶中切取的差异蛋白带，置eppendorf管中，对蛋白进行脱色、还原、烷基化、酶解、萃取和脱盐等处理。

质谱分析在thermoscientificqelc-ms质谱仪上进行，色谱洗脱的肽片段进入质谱离子源后进行lc质谱和串级质谱(ms/ms)分析，用推断的序列和肽段质量相结合，查询数据库对蛋白质进行鉴定。mgd1-ab免疫共沉淀后lc-ms/ms质谱结果见图6a-c，质谱鉴定肽段为ceacam5。

糖基化验证

用westernblot进行糖基化修饰的验证，如图5所示，抗cea的抗体(abcam，ab4539)和mgd1-ab均能识别真核表达cea的293t细胞，去糖基化处理真核表达cea的293t细胞后，抗cea的抗体仍能识别非糖基化的cea，而mgd1-ab则不能识别非糖基化的cea；

抗cea的抗体可以与原核表达的cea反应，而mgd1-ab与原核表达的cea不反应，同样证实mgd1-ab识别的抗原是糖基化的ceacam5。

实施例6mg7-ag在胃癌组织特异性表达

应用mgd1-ab进行免疫组化检测，发现正常组织包括正常胃黏膜、结肠、食管、肺、肝、胰、皮肤、卵巢、平滑肌、红细胞、淋巴细胞等11种正常组织和细胞均呈阴性；胃黏膜中极少数肠上皮化生细胞呈阳性1.7％(2/118例，空军军医大学第一附属医院消化病医院临床样本)；胚胎结肠黏膜中肠腔面游离缘的单层表皮细胞不同程度着色，阳性率28.6～57.1％；在肝癌、胰腺癌，眼部癌、皮肤癌、卵巢癌均呈阴性，胃癌、结肠癌、食管癌组织中反应阳性率高于其他肿瘤，且在胃癌组织中反应阳性率77.9％(127/163，空军军医大学第一附属医院消化病医院临床样本)高于其他肿瘤，提示mg7-ag在胃癌组织特异性表达。

实施例7mg7-ag与其他胃癌抗原的阳性检出率比较

对59例胃癌(空军军医大学第一附属医院消化病医院临床样本)的同一组织芯片系列切片进行mg7-ag、ca19-9、ca72-4、cea、ca125几种肿瘤标志物的免疫组化检测，结果如图7，mg7-ag在胃癌中的阳性率为72.9％明显高于其他肿瘤标志物(ca19-952.5％、ca72-430.5％、cea50.8％、ca12513.6％)。

对325例组织芯片检测胃癌组织中mg7-ag和cea的表达，结果如表1，mg7-ag表达阳性率(69.8％)明显高于cea(58.2％)，且mg7-ag在组织中表达强度大于cea，>“++”的阳性率(56.9％)也明显高于cea(35.1％)，提示mg7-ag在胃癌诊断方面较cea拥有更好的敏感性，可能是胃癌诊断的潜在标志物。

表1mg7-ag和cea在胃癌组织中的表达强度

实施例8mgd1-ab杀伤胃癌细胞

细胞杀伤试验：分别取对数生长期的胃癌细胞sgc7901、ags和ges(永生化胃粘膜上皮细胞)(来源atcc细胞库)接种至96孔板(每孔5×10³个)，正常培养48h；每一种细胞分别设置mgd1-ab组、小鼠抗结核单抗对照组和空白对照组，mgd1-ab和抗结核单抗用含1.5％胎牛血清的rpmi-1640培养液稀释成400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml。洗细胞一次，加入含不同浓度抗体的培养液，置co2培养箱中继续培养，倒置显微镜下观察细胞状态，不同浓度的mgd1-ab加入胃癌细胞48-72h，显微镜下可发现细胞从48h开始，出现折光性变差、贴壁不牢等明显的凋亡特征，甚至出现死亡。图8显示当mgd1-ab浓度达到100μg/ml时，sgc7901在mgd1-ab处理后的典型表现；72hmtt法检测证实存活的胃癌细胞sgc7901和ags明显减少(p<0.05)，抗结核抗体对照并无此杀伤作用，任何浓度的mgd1-ab对永生化胃粘膜上皮细胞ges无明显杀伤作用。