一种番石榴叶黄酮苷元的生产方法与流程

本发明属于番石榴领域，尤其涉及一种番石榴叶提取物的生产方法。

背景技术

番石榴(psidiumguaijaval.)为桃金娘科番石榴属植物，是热带常绿小乔木或灌木，原产于热带美洲，几个世纪前传入我国，现在我国福建、广东、台湾等地均有广泛的种植。中医认为其性平味干涩，具有收敛止泻等功能，其挥发油具有抗菌、抗病毒作用，对消化系统也有解痉、增强胃肠蠕动的作用。现代研究表明，番石榴中含有多种重要的芳香类二级代谢产物如多酚黄酮类化合物，有学者认为正是这些酚类化合物赋予番石榴多种药用功效。因而，针对番石榴叶的黄酮苷元资源进行开发研究有较好的前景与必要。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种成本低、品质高的番石榴叶黄酮苷元的生产方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种番石榴叶黄酮苷元的生产方法，包括以下步骤：

(1)从番石榴叶中提取黄酮类化合物；

(2)将步骤(1)中得到的黄酮类化合物加入到含灰色链霉菌(streptomycesgriseusatcc13273)的液体培养基中培养，于25-40℃条件下，振荡发酵培养6-8天得到发酵溶液；

(3)将步骤(2)中得到的发酵溶液于50-55℃条件下，振荡酶解3-4h得到酶解溶液；

(4)将步骤(3)中得到的酶解溶液静置、离心，沉淀用甲醇溶解，过滤后得到含有黄酮苷元的甲醇溶液。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，灰色链霉菌首先需要先以马铃薯培养基进行扩大培养当作种子，再接种至新的马铃薯培养基。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述含灰色链霉菌的液体培养基为标准马铃薯培养基，其配方为：去皮新鲜马铃薯200g、葡萄糖20g、mgso4·7h2o1.5g、kh2po43g、1l蒸馏水，所述标准马铃薯培养基的初始ph值无需调节。通过灰色链霉菌代谢产生的鼠李糖苷酶和β-d-葡萄糖苷酶等，会使提取物中的黄酮糖苷成分通过微生物发酵作用转化生成黄酮苷元(槲皮素、山奈酚和异鼠李素等)，以微生物进行转化，可以增加产物量，克服化学合成的缺点，又因微生物发酵大多在中性、室温条件下作用，减少了产物异构、消旋和重排反应等不利因素。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述含灰色链霉菌的液体培养基中灰色链霉菌的接种量为每毫升培养基中接种10000-60000个孢子。更优选的，为10000-60000个孢子。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述步骤(2)中，所述黄酮类化合物的加入量与液体培养基的质量比控制为(0.5-1.5)：5。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述步骤(1)中从番石榴叶中提取黄酮类化合物的方法为碱水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法。由于黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液或碱性稀醇如乙醇浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。有机溶剂提取法是目前国内外使用最广泛的方法，有机溶剂提取对设备要求简单，产品得率高，容易实现工业化生产，但成本较高，杂质含量也较高，常用于黄酮提取的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙醋、乙醚等，考虑到甲醇、丙酮等的毒性较大，优选的采取乙醇为提取溶剂。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述步骤(1)中从番石榴叶中提取黄酮类化合物的方法为微波辅助低共熔提取技术，其工艺条件为：用200w微波强度处理番石榴叶2min后，以丁二醇和氯化胆碱按照摩尔体积比为4：1比例混合作为低共熔溶剂，控制料液比为1：22，65℃下提取40min。微波辅助提取时，被提取的极性分子在微波电场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦引起发热，可以保证能量的快速传递和充分利用，易于溶出和释放。同时，采用低共熔溶液可以保护环境，减小废液对于人类的污染产生。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述步骤(1)中从番石榴叶中提取黄酮类化合物的方法为超声波提取技术，其工艺条件为：以75％乙醇为溶液，控制料液比为1：28，42℃下提取30min。超声波提取技术是利用超声波的空化作用加强番石榴有效成分的浸出提取，另外，超声波的次级效应如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速目标成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述步骤(1)中黄酮类化合物还经过高速逆流色谱技术分离纯化过程，其工艺条件为：将石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水作为两相溶剂体系，其各组分按照体积比为2∶2∶3∶1的比例配制，静置6-10h得到分别作为上、下相的溶液组分，用最大流速将上相注入hsccc分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速为720r/min，再以1.5ml/min流速注入下相；待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入经超声波提取技术得到的溶液。在超声波提取技术之后，利用高效逆流色谱(hsccc)技术用以分离纯化黄酮类化合物，能得到更高纯度的黄酮提取液，有利于提高最终产品的品质。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述步骤(1)中的黄酮类化合物经冷冻干燥后再加入含灰色链霉菌的液体培养基中培养。

上述番石榴叶黄酮苷元的生产方法中，优选的，所述步骤(3)中振荡酶解时采用纤维素酶与果胶酶的混合溶剂。纤维素酶与果胶酶的混合溶剂可以将油溶性的类黄酮转化为易溶于水的糖苷类溶于酶解溶液而利于提取，提高黄酮含量，并通过酶反应将植物组织分解，使提取传质阻力减小，加快反应进程。此外，可使提取液中的杂质分解去除，从而简化后续分离纯化工序。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明采用含灰色链霉菌的液体培养基培养黄酮类化合物，灰色链霉菌催化黄酮母核上的羟基成甲氧基，此过程为生物解毒的方式之一，也是天然产物结构修饰产生稳定化合物的重要反应之一，减少了产物异构、消旋和重排反应等不利因素。另外，微生物发酵作用大多在中性、室温条件下作用，能较方便的控制反应环境，减少了在大规模生产时，对厂房温度、湿度等控制条件的大成本投入，经济节约。

2、本发明番石榴叶黄酮苷元的生产方法简便、易于操作，最终得到的黄酮苷元的杂质含量小，后续提纯工艺简单。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例5中黄酮提取设备的结构示意图。

图2为图1中a-a面的剖切视图。

图例说明：

1、多功能罐；2、解吸柱；3、旋转耙；4、浸出循环罐；5、导流筒；6、倒圆锥形气体挡板；7、带电磁阀的通气管；8、固定杆；9、夹套加热装置；101、第一管道；102、第二管道；103、第三管道；104第四管道；105、第二通气加压管；107、第一通气加压管；108、排气管。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种番石榴叶黄酮苷元的生产方法，包括以下步骤：

(1)在45℃条件下，对番石榴叶通过80％甲醇水溶液振荡提取8h，抽滤，重复三次，合并提取液，再将提取液经过冷冻干燥，得到提取物粉末；

(2)将步骤(1)中得到的黄酮类化合物加入到含灰色链霉菌(streptomycesgriseusatcc13273)的液体培养基中培养(黄酮类化合物的加入量与液体培养基的质量比控制为1：5)，每毫升培养基接种量为3×10⁵个孢子，于25-40℃条件下，振荡发酵培养6-8天得到发酵溶液；其中，含灰色链霉菌的液体培养基为标准马铃薯培养基，其配方为：去皮新鲜马铃薯200g、葡萄糖20g、mgso4·7h2o1.5g、kh2po43g、1l蒸馏水，所述标准马铃薯培养基的初始ph值无需调节；

(3)将步骤(2)中得到的发酵溶液于50-55℃条件下，振荡酶解3-4h得到酶解(10u/ml的纤维素酶与果胶酶)溶液；

(4)将步骤(3)中得到的酶解溶液静置、离心，沉淀用甲醇溶解，过滤后得到含有黄酮苷元的甲醇溶液。

对比例1：

本对比例与实施例1相比，不同之处仅在于未经过步骤(2)处理。但步骤(3)中所用的酶包括多种酶α-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶等联合使用，使用量通常需要20u/ml左右的酶量。

经检测，通过灰色链霉菌处理最终生产得到的黄酮苷元，与未通过灰色链霉菌处理，而是直接采用有机溶剂提取后进行生物酶转化生产得到的黄酮苷元相比，结果如下表1所示。

表1：实施例1与对比例1中的黄酮苷元得率及黄酮总转化率

实施例1与对比例1相比，虽然对比例1中的各黄酮苷元的利率及黄酮的总转化率相比于实施例1的高，但对比例1中所用的酶的种类及用量明显多于实施例1，这在成本上是不可取的。

实施例2：

一种番石榴叶黄酮苷元的生产方法，包括以下步骤：

(1)以75％乙醇为溶液，控制番石榴叶与乙醇的料液比为1:28，42℃下超声波提取时间30min，再将提取液经过冷冻干燥，得到提取物粉末；

(2)-(4)与实施例1的步骤(2)-(4)相同。

实施例3：

一种番石榴叶黄酮苷元的生产方法，包括以下步骤：

(1)用200w微波强度处理番石榴叶2min后，以丁二醇和氯化胆碱按照摩尔体积比为4：1比例混合作为低共熔溶剂，控制料液比为1：22，65℃下提取40min，再将提取液经过冷冻干燥，得到提取物粉末；

(2)-(4)与实施例1的步骤(2)-(4)相同。

实施例4：

一种番石榴叶黄酮苷元的生产方法，包括以下步骤：

(1)与实施例3中的步骤(1)相同；

(2)将步骤(1)中得到的提取物粉末经高速逆流色谱技术分离纯化过程，高速逆流色谱技术分离纯化过程的工艺条件为：将石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水作为两相溶剂体系，其各组分按照体积比为2∶2∶3∶1的比例配制，静置6-10h得到分别作为上、下相的溶液组分，用最大流速将上相注入hsccc分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速为720r/min，再以1.5ml/min流速注入下相；待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入经超声波提取技术得到的溶液；

(3)-(5)与实施例1的步骤(2)-(4)相同。

实施例2-4中得到的黄酮苷元及总转化率结果如下表2所示。

表2：实施例2-4中得到的黄酮苷元及总转化率

由表2可知，通过高效逆流色谱分离纯化处理最终生产得到的黄酮苷元，与未通过高效逆流色谱分离纯化处理最终生产得到的黄酮苷元相比，由于通过进一步纯化，黄酮类化合物纯度较高，槲皮素、山奈酚、异鼠李素的得率均有所提高。

实施例5：

一种番石榴叶黄酮苷元的生产方法，包括以下步骤：

(1)采用本实施例中的黄酮提取设备从番石榴叶中提取黄酮类化合物；

(2)-(4)与实施例1的步骤(2)-(4)相同。

如图1和图2所示，本实施例中的黄酮提取设备，包括多功能罐1与解吸柱2，多功能罐1的中上部设有依据多功能罐1的功能开启或关闭的排渣口，多功能罐1内设有用于与排渣口配合将浮选渣从排渣口排出的旋转耙3，多功能罐1的底部设有与解吸柱2连接的、用于将经浮选后的浸出溶液与吸附剂颗粒送至解吸柱2的第二管道102，多功能罐1内设有搅拌装置；依据多功能罐1的功能开启或关闭是指：当多功能罐1用于浸出时，排渣口关闭，旋转耙3不工作；当多功能罐1用于浮选时，排渣口开启，旋转耙3工作。

本实施例中，黄酮提取设备还包括浸出循环罐4，浸出循环罐4与排渣口之间通过第一管道101相连，浸出循环罐4与解吸柱2之间设有用于再生吸附剂颗粒、吸附尾液进入浸出循环罐4的第三管道103(解吸柱2自带固液分离功能，当经浮选后的浸出溶液与吸附剂颗粒送至解吸柱2时，解吸柱2会截留吸附剂颗粒，而浸出溶液则会流出解吸柱2得到吸附尾液，因此，第三管道103由两个分支管路汇合后再与浸出循环罐4相连，此两分支管路分别为用于吸附尾液与再生吸附剂颗粒进入浸出循环罐4的管路)，浸出循环罐4的底部设有与多功能罐1连接的、用于浸出循环罐4中的浮选渣、再生吸附剂颗粒、吸附尾液进入多功能罐1的第四管道104。另外，本实施例中，再生吸附剂颗粒还可在压力的作用下直接通过第二管道102进入多功能罐1，此时再生吸附剂颗粒无需储存在浸出循环罐4内。

本实施例中，第四管道104通过第二管道102与多功能罐1相连接。第四管道104通过第二管道102连接可减小管道的使用量，还可减小在多功能罐1上开口的数量。

本实施例中，搅拌装置为设于多功能罐1内的气升式搅拌装置，气升式搅拌装置包括导流筒5、倒圆锥形气体挡板6与用于依据多功能罐1的功能控制多功能罐1内液体流动方式的带电磁阀的通气管7，导流筒5通过固定杆8固设于多功能罐1内，倒圆锥形气体挡板6固设于导流筒5下方，带电磁阀的通气管7在倒圆锥形气体挡板6上方与下方均设有排气口；依据多功能罐1的功能控制多功能罐1内液体流动方式是指：当多功能罐1用于浸出时，只有位于倒圆锥形气体挡板6下方的排气口开启，使多功能罐1内的液体在导流筒5内外侧呈内循环流动以达到浸出功能(液体流动方向如图1中多功能罐1内实线箭头方向)；当多功能罐1用于浮选时，位于倒圆锥形气体挡板6上方与下方的排气口均开启，使多功能罐1内的液体在导流筒5内外侧无法形成内循环流动以达到浮选功能(液体流动方向如图1中多功能罐1内虚线箭头方向)。

本实施例中，多功能罐1的顶部设有排气管108，解吸柱2的底部设有第一通气加压管107，第一管道101上连通有第二通气加压管105。本实施例中，第一通气加压管107与第二通气加压管105均可直接与带电磁阀的通气管7的进气口连通(如图1中所示的情况)，只要能达到通气加压的目的即可。

本实施例中，多功能罐1的外壁上设有夹套加热装置9，多功能罐1的顶部设有加料口与加液管(图1中未示出加料口与加液管)，浸出循环罐4底部设有出渣口。出渣口可优选的为第四管道104上开出的一个分支管路，这样可以减小浸出循环罐4上的开口数量。

本实施例的多功能罐1可实现浸出-吸附-浮选等多重功能，在同一设备中即可达到多重效果，无需将罐内的浸出溶液和浸出渣导出再进行固液分离，操作简单，还可减小固液分离过程中的温度损耗，能源利用率高；浸出循环罐4的作用在于暂时贮存浮选渣、再生吸附剂颗粒与吸附尾液，当需要多次浸出操作时，只需将浸出循环罐4内的物质压入多功能罐1即可，整个过程可实现连续或半连续操作。

本实施例的黄酮提取设备用于浸出时，属浸出和吸附同时进行的浸出吸附混合原理模式。用于浸出时，番石榴叶、吸附剂颗粒与浸出剂在气升式搅拌装置的作用下在多功能罐1内呈内循环流动，达到边浸出边吸附的效果。用于浮选时，气升式搅拌装置控制多功能罐1内的液体无法形成内循环流动，导流筒5内外侧均有上升的气流，再利用80-100目左右的番石榴叶和20-40目耐热聚苯乙烯型大孔吸附树脂吸附剂颗粒比重的不同，80-100目左右的番石榴叶会浮于多功能罐1的上层，在旋转耙3的作用下，上层番石榴叶(即浮选渣)基本全部会被浮选进入浸出循环罐4，从而实现番石榴叶与吸附剂颗粒的分离，而浸出溶液与吸附剂颗粒的分离则通过压送至解吸柱中实现。

本实施例中的步骤(1)具体如下：

a、将100g80-100目左右的番石榴叶和200g20-40目耐热聚苯乙烯型大孔吸附树脂吸附剂颗粒hd-p通过多功能罐1顶部的加料口加入，盖上盖子封闭，再通过该多功能罐1顶部的加液管加入料液比为1：15的ph值为8.5的弱碱性水溶液浸出剂；

b、通过多功能罐1外的夹套加热装置9加热，控制多功能罐1内温度为85℃，打开底部带电磁阀的通气管7，控制通气速度为1-20vvm，通气搅拌使多功能罐1内的液体进行气升式内循环，进入混合浸出吸附模式(此时与多功能罐1相连接的第一管道101与第二管道102上的阀门全部关闭)，控制浸出和吸附0.5-1.5小时；

c、混合浸出吸附结束后，开启浮选旋转耙3，进入浮选模式(此时与多功能罐1相连接的第一管道101上的阀门开启，第二管道102上的阀门关闭，与浸出循环罐4相连的第四管道104上的阀门关闭)，打开带电磁阀的通气管7，调节通气速率为5-25vvm，利用80-100目左右的番石榴叶和20-40目耐热聚苯乙烯型大孔吸附树脂吸附剂颗粒比重的不同，使80-100目左右的番石榴叶(浮选渣)全部浮选进入浸出循环罐4，而浸出溶液和负载黄酮的吸附剂颗粒则保留在多功能罐中1；

d、浮选结束后，关闭第一管道101上的阀门，打开第二管道102上的阀门，打开第三管道103上的阀门，再将负载黄酮的吸附剂颗粒与浸出溶液沿第二管道102压进入解吸柱2顶部，负载黄酮的吸附剂颗粒截留在解吸柱2中，而溶液(即吸附尾液)则从解吸柱2底部自动返回浸出循环罐4中；再往解吸柱2中通入洗涤液以除去吸附剂颗粒中的杂质后，再用30％-95％的乙醇溶液解吸吸附剂颗粒中负载的黄酮，即得到黄酮溶液；

e、打开浸出循环罐4的排渣口卸渣，板框压滤。

采用本实施例中的黄酮提取设备提取黄酮类化合物时，采用了浮选分级，浮选渣可以多次循环浸出而不需要一般工艺的反复固液分离、降温及升温操作，浸出率高，且能耗更低。另外，黄酮的浸出和吸附在一个反应器中进行，不仅混合传质效果好，而且因产物被吸附而打破了浸出反应时的平衡，可大大提高浸出速率与浸出效果，提高吸附效率。

采用本实施例中的黄酮提取方法，黄酮类化合物的提取量较高。

实施例6：

一种番石榴叶黄酮苷元的生产方法，包括以下步骤：

(1)与实施例5中的步骤(1)相同；

(2)将步骤(1)中得到的提取物粉末经高速逆流色谱技术分离纯化过程，高速逆流色谱技术分离纯化过程的工艺条件为：将石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水作为两相溶剂体系，其各组分按照体积比为2∶2∶3∶1的比例配制，静置6-10h得到分别作为上、下相的溶液组分，用最大流速将上相注入hsccc分离管中，待上相充满整个管路后调整主机转速为720r/min，再以1.5ml/min流速注入下相；待流动相从柱出口流出，两相在分离管中达到动态平衡后，由进样阀注入经超声波提取技术得到的溶液；

(3)-(5)与实施例1的步骤(2)-(4)相同。

实施例5-6中得到的黄酮苷元及总转化率结果如下表3所示。

表3：实施例5-6中的黄酮苷元得率及黄酮总转化率