本发明涉及属于生物制药领域，具体涉及一种发酵生产洛伐他汀用米孢子培养基及米孢子的制备方法。
背景技术
洛伐他汀(lovastatin)属羟甲基戊二酰辅酶a还原酶抑制剂(hmg-coa-ri)，通过竞争性抑制hmg-coa还原酶活性，阻断内源胆固醇合成，从而起到调脂降脂作用。洛伐他汀由日本远藤及albort等人于1979年及1980年首次从土曲霉的发酵液中发现，由美国默克公司(merckco)开发，并于1987年通过fda批准上市，是推向市场的第一个hmg-coa-ri。从上市以来，洛伐他汀便成为临床治疗和预防高血脂症的首选药物，而且近年又发现了它的很多新药理活性，如抗癌、抗氧化、改善血管内皮细胞功能等，其临床应用还可能扩大。
洛伐他汀分子式：c24h36o5
洛伐他汀结构式：
目前工业上采用微生物发酵法生产洛伐他汀；在现有的发酵技术中，一级种子进罐接种采用接入孢子菌悬液的方式。孢子的培养一般采用茄子瓶，按此工艺，如果一级种子罐的容积为4m3，那么将使用超过100支茄子瓶进罐。而孢子菌悬液的制备工艺是向培养成熟的茄子瓶中加入适量无菌水，用接种针将表面的孢子洗下，然后用无菌吸管将孢子液吸入含有玻璃珠的无菌三角瓶中震荡打碎，将这样的多个三角瓶中获得的打散的孢子菌悬液再并入另一较大的无菌三角瓶中，然后接入一级种子罐；这种工艺在实际操作过程中存在诸多缺点，如劳动强度大、操作不便，使用的玻璃器具较多，操作复杂从而使得保证无菌变得困难。总之，这种工艺大大增加了工作量及染菌几率，对于大生产极为不利；因而寻求一种更加简便有效的进罐用菌种的制备工艺非常必要。
中国专利cn104561167a公开了一种发酵生产洛伐他汀用米孢子培养基的制备方法，采用小米和玉米浆作为培养基制备米孢子。但是其方法操作步骤繁琐，且存在较高的染菌风险。因为小米堆密度较高，热传递困难，且玉米浆中常含有大量的芽孢杆菌，作为固体培养基灭菌时存在灭菌不彻底的较高风险，极易引起染菌。而本发明制备米孢子的方法操作简便，同时采用堆密度远小于小米的大米，且使用营养液替代玉米浆，大大降低了因为培养基灭菌不彻底而造成染菌的风险，可以保证发酵生产洛伐他汀所需孢子的顺利供应。
技术实现要素：
本发明的目的首先是提供一种发酵生产洛伐他汀用的米孢子培养基，本发明所述的培养基由大米和营养液混合制备而成。
优选的，每100重量份的所述营养液中包括葡萄糖10份，酵母抽提物10份，余量为水。上述营养液能弥补大米在碳源和氮源种类上的不足，并能够为微生物菌丝生长和分化产生孢子提供必需的微量元素。
优选的，所述大米与所述营养液的质量比为1:0.05～0.2，进一步优选1:0.05～0.15。
优选的，所述大米与营养液混合前，进行如下预处理：
1)用水对大米进行浸泡；
2)将浸泡后的大米和水的混合物进行翻炒，炒至无可见流动水；
3)将炒好的大米进行蒸制后冷却，晾至所述大米中的水分含量为40～60％，得预处理完的大米。
大米经预处理后，变得柔软疏松且不粘连，其营养成分能够迅速被微生物利用，同时也起到对大米预灭菌的效果。本发明中所述大米水分含量是指大米经加水处理后，加营养液前的重量(w2)相对大米本身的重量(w1)增加的相对数值，其计算公式为(w2-w1)/w1×100％。
本发明所述的上述培养基用堆密度小的大米替代堆密度大的小米，用成分明确、质量可控且易于灭菌的营养液替代成分复杂、质量难以控制且常带有大量芽孢杆菌的玉米浆，得到易于灭菌，质量和染菌风险可控，接种培养后能产生量大、质优孢子的培养基。
优选的，所述步骤1)中，纯化水的添加量为大米质量的50％～70％，浸泡时间为2～6小时；
优选的，所述步骤2)在翻炒的过程中控制温度为70～130℃；
优选的，所述步骤3)在蒸制的过程中，控制温度为90～105℃，蒸制时间为5～20分钟。
作为优选的方案，本发明所述的培养基由如下方法制备得到：
a、大米的预处理
1)在大米中添加为大米质量的50％～70％的纯化水，浸泡2～6小时；
2)将浸泡后的大米和水的混合物在温度70～130℃的条件下进行翻炒，炒至无可见流动水；
3)将炒好的大米在温度90～105℃的条件下蒸制5～20分钟，冷却后晾至所述大米中的水分含量为40～60％，得预处理完的大米。
b、培养基的配制
将所述预处理完成的大米与营养液以质量比1:0.05～0.2混合，得培养基；
每100重量份的所述营养液中包括葡萄糖10份，酵母抽提物10份，余量为纯化水。
优选的，上述培养基中所使用的大米为粳米。粳米米粒丰满肥厚，质地硬而有韧性，其中含有大量碳水化合物，蛋白质和氨基酸种类也比较全面，还含有脂肪、钙、磷、铁及b族维生素等多种营养成分。粳米经预处理后，变得柔软疏松且不粘连，为培养微生物的理想培养基。
本发明的另一目的是提供利用本发明所述的培养基制备米孢子的方法，包括如下步骤：
1)将所述培养基灭菌后在其中接种孢子悬液，搅拌均匀；
2)将接种孢子悬液后的培养基在温度25～29℃的条件下静置培养7～12天，收获成熟的米孢子。
优选的，在温度26～28℃条件下培养9～11天。
优选的，所述灭菌的条件为在温度118～123℃的条件下灭菌20～40分钟。
更优选的，所述灭菌的条件为在温度121℃的条件下灭菌30分钟。
优选的，所述步骤1)中将培养基以30～80g/瓶分装到500ml的培养瓶中；
更优选的，以50g/瓶分装到500ml的培养瓶中；
优选的，所述孢子的接种量为1×107～5×109个/瓶；
更优选的，所述孢子的接种量为2.8～3.2×108个/瓶。
作为优选的方法，包括如下步骤：
1)将培养基以45～55g/瓶分装到500ml的培养瓶中，在温度121℃的条件下灭菌30分钟，在其中接种孢子悬液，至孢子的接种量为2.8～3.2×108个/瓶；
2)将接种孢子悬液后的培养基在温度26～28℃的条件下静置培养9～11天，收获成熟的米孢子。
优选的，所述孢子由发酵生产洛伐他汀的微生物菌种产生，优选由红曲霉、土曲霉或土曲霉的变种产生。
本发明所述的方法具有如下有益效果：
1)本发明的培养基采用堆密度远小于小米的大米，且使用营养液替代玉米浆，采用常规的方法即可进行彻底的灭菌，大大降低了因为培养基灭菌不彻底而造成染菌的风险，可以保证大规模工业化连续发酵生产洛伐他汀所需孢子的顺利供应。
2)采用本发明所述制备米孢子的方法，1个三角瓶的产孢量就相当于10～20个茄子瓶的产孢量，可以大大降低工人的劳动强度，同时可以大大降低操作引起染菌几率。
3)米孢子有贮存时间长的特点，可以一批同时做出大量的米孢子贮存备用，可在菌种性能方面保证发酵生产水平的稳定性。
4)采用本方法制备的米孢子与茄瓶斜面培养的孢子进行摇瓶及大罐试验比较，两种孢子发酵生产水平相近甚至前者略高，说明本方法所述米孢子培养基和米孢子制备工艺是可行的、有效的。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1
本实施例涉及一种制备米孢子的培养基，这种培养基由如下方法制备得到：
a、大米的预处理
1)称取粳米200g(w1)，加入纯化水100ml浸泡2小时；
2)将大米和水倒入汤锅中，放在电磁炉上翻炒，控制电磁炉加热温度70℃，炒至无可见流动水；
3)将大米转移至纱布上铺平，在90℃蒸20分钟，稍冷却后搓散，将大米晾至280g(w2)，得预处理完成的含水量40％((w2-w1)/w1×100％)的大米；
b、培养基的配制
在所述预处完成的大米中加入营养液30g，混合均匀，即得所述培养基。
每100g的所述营养液中包括葡萄糖10g，酵母抽提物10g，余量为纯化水。
本实施例还涉及利用这种培养基制备米孢子的方法，包括如下步骤：
1)将大米按30g/瓶分装至500ml三角瓶中，振荡铺平后在118℃灭菌40分钟后取出；将三角瓶晾至室温后接入孢子浓度为2.1×107个/ml的土曲霉孢子悬液0.5ml，并搅拌均匀，分散铺平；
2)三角瓶在26℃静置培养12天；培养周期完成后收获成熟的米孢子。
本实施例共制备大米孢子10瓶，在培养周期完成后，均取样做镜检和肉汤培养，未发现染菌现象。计数10个三角瓶的平均孢子量达1.1×1011个/瓶。
实施例2
本实施例涉及一种制备米孢子的培养基，这种培养基由如下方法制备得到：
a、大米的预处理
1)称取粳米200g(w1)，加入纯化水140ml浸泡6小时；
2)将大米和水倒入汤锅中，放在电磁炉上翻炒，控制电磁炉加热温度130℃，炒至无可见流动水；
3)将大米转移至纱布上铺平，在105℃蒸5分钟，稍冷却后搓散，将大米晾至320g(w2)，得预处理完成的含水量60％((w2-w1)/w1×100％)大米；
b、培养基的配制
在所述预处理完成的大米中加入营养液10g，混合均匀，即得所述培养基。
每100g的所述营养液中包括葡萄糖10g，酵母抽提物10g，余量为纯化水。
本实施例还涉及利用这种培养基制备米孢子的方法，包括如下步骤：
1)将大米按60g/瓶分装至500ml三角瓶中，振荡铺平后在123℃灭菌20分钟后取出；将三角瓶晾至室温后接入孢子浓度为7.4×109个/ml的土曲霉孢子悬液0.5ml，并搅拌均匀，分散铺平；
2)三角瓶在28℃静置培养8天；培养周期完成后收获成熟的米孢子。
本实施例共制备大米孢子5瓶，在培养周期完成后，均取样做镜检和肉汤培养，未发现染菌现象。计数5个三角瓶的平均孢子量达2.3×1011个/瓶。
实施例3
本实施例涉及一种制备米孢子的培养基，这种培养基由如下方法制备得到：
a、大米的预处理
1)称取粳米200g(w1)，加入纯化水120ml浸泡4小时；
2)将大米和水倒入汤锅中，放在电磁炉上翻炒，控制电磁炉加热温度100℃，炒至无可见流动水；
3)将大米转移至纱布上铺平，在100℃蒸10分钟，稍冷却后搓散，将大米晾至300g(w2)，得预处理完成的含水量50％((w2-w1)/w1×100％)大米；
b、培养基的配制
在所述预处理完成的大米中加入营养液20g，混合均匀，即得所述培养基。
每100g的所述营养液中包括葡萄糖10g，酵母抽提物10g，余量为纯化水。
本实施例还涉及利用这种培养基制备米孢子的方法，包括如下步骤：
1)将大米按50g/瓶分装至500ml三角瓶中，振荡铺平后在121℃灭菌30分钟后取出；将三角瓶晾至室温后接入孢子浓度为5.8×108个/ml的土曲霉孢子悬液0.5ml，并搅拌均匀，分散铺平；
2)三角瓶在27℃静置培养10天；培养周期完成后收获成熟的米孢子。
本实施例共制备大米孢子6瓶，在培养周期完成后，均取样做镜检和肉汤培养，未发现染菌现象。计数6个三角瓶的平均孢子量达4.7×1011个/瓶。
对比例
采用中国专利cn104561167a公开的发酵生产洛伐他汀用米孢子培养基来制备米孢子，共制备米孢子10瓶，培养周期完成后，均取样做镜检和肉汤培养，发现4瓶有染菌现象，染菌率高达40％。计数其余6个三角瓶的平均孢子量为6.51×1010个/瓶。
由以上数据可以看出，与实施例1～3相比，采用中国专利cn104561167a公开的方法制备米孢子污染菌风险过高，无法保证大规模工业化连续发酵生产的供种需要，而且孢子数量远低于采用本发明的方法产生的平均米孢子数量。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。