一种生物合成根皮素的分离提纯工艺的制作方法

本发明涉及一种生物合成根皮素的分离提纯工艺，特别是涉及一种利用酵母菌合成根皮素并且使用大孔树脂分离提纯根皮素的工艺。-

背景技术：

根皮素是国内外最新研究开发的的一种天然皮肤美白剂，根皮素能抑制皮脂腺的过度分泌，用于治疗分泌旺盛型粉刺；能抑制黑色素细胞活性，对各种皮肤色斑有作用。与同类天然成分熊果苷和曲酸相比，同等体积分数的根皮素对酪氨酸酶的抑制作用要好于它们，并且当其与熊果苷和/或曲酸进行复配时，能大大提高产品对酪氨酸酶的抑制率，使抑制率达到100％。

酵母是基因克隆实验中常用的真核生物宿主细胞，酵母克隆载体的种类也很多。酵母菌表达质粒长2pm，称为2μm质粒，约6300bp，这种质粒至少有一段时间存在于细胞核内染色体以外，利用2pm质粒和大肠杆菌中的质粒可以构建成能穿梭于细菌与酵母菌细胞之间的穿梭质粒，酵母克隆载体大部分是在这个基础上构建的。

目前国内的根皮素分离提纯工艺都是以植物提取或化学合成的根皮素作为主要原料，这两个途径制得的根皮素也可以达到很高的纯度，但是过程复杂，并且需要大量的有机试剂进行催化，对环境造成一定污染，就植物提取而言，操作过于复杂。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号cn101811949a，公开日2010.08.25，记载了一种“根皮素粉剂的提纯方法”，该技术包括如下步骤：将荔枝壳与乙醇溶液混合提纯后得到粗提液，经浓缩处理后进行离子交换树脂分离，最后通过大孔树脂分离，得到根皮素粉剂。本发明相较于该技术而言，对于原料的选择更具新颖性，原料中根皮素纯度更高，对环境更友好，更有利于今后长久的发展。

酵母菌作为一种常见的单细胞真菌，价格低廉，利用其产生根皮素并且进行分离提纯，符合绿色生产的理念，对设备的要求较低，操作简单，无毒无害，并且得到纯度较高的根皮素。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的不足，以及选用原料的单一性，公开一种生物合成根皮素的分离提纯工艺，增加了提取根皮素的原料种类的选择，开发了一种新的根皮素提取工艺，本发明符合绿色生产的理念，对设备的要求较低，操作简单，无毒无害，并且可以使根皮素达到很高的纯度。

本发明的目的是通过以下技术解决方案来实现的：

本发明是以经过发酵产生根皮素的酵母菌菌液为原料，通过利用等体积的纯乙醇对菌液进行萃取，萃取液通过离心机进行离心操作，上清液通过减压浓缩处理，再经大孔树脂进行富集纯化，乙醇洗脱，将洗脱液浓缩沉淀，沉淀物利用乙醇重结晶，干燥得产品。

所述的酵母菌菌液，来自本公司自行研发的一种可以通过发酵产生根皮素的酵母菌菌株的发酵液。

所述的纯乙醇的体积分数为99％及以上。

所述的萃取是指：将与菌液体积相同的体积分数在99％及以上的乙醇与菌液混合，利用超声波清辅助使其充分混合，得混合液。

所述的离心是指：利用离心机对其进行离心操作，分离混合液以及破碎死亡的细胞，取上清液待用。

离心转速为5000-8000rpm，时间3-5min，浓缩液上柱速率为0.5-0.8ml/min，浓缩液的上柱量为2-3倍柱体积。

所述的减压浓缩处理是指：利用旋转蒸发仪将混合液浓缩到原体积的1/3-1/5。

所述的大孔树脂的型号可以是d101、spd-100和hz816中的一种。

所述的乙醇洗脱的乙醇体积分数为30～100％，优选50-80％。

所述的浓缩沉淀是指：利用旋转蒸发仪将混合液浓缩至有大量沉淀析出。

所述利用乙醇进行重结晶，乙醇的体积分数为95～99％。

本发明采用的原料来自本公司通过发酵产生根皮素的酵母菌发酵废液，增加了提取根皮素的原料种类的选择，开发了一种新的根皮素提取工艺，本发明符合绿色生产的理念，对设备的要求较低，操作简单，无毒无害，提取率可以达到90％以上，并且可以使根皮素的纯度达到96％以上。

本发明利用大孔树脂进行根皮素的吸附以及分离提纯，其优点在于：大孔树脂可以对根皮素起到有效的吸附作用，并且可以重复使用，不仅起到了分离提纯的作用，还节约了成本。

本发明从工艺的开始到结束只使用乙醇这一种有机溶剂，并且在实验过程中可以实现乙醇的蒸馏回收，在很大程度上杜绝了资源的浪费，而且乙醇相对于其他有机溶剂，毒性较小，适用于大规模生产。

本发明采用的原料来自发酵产生根皮素的酵母菌菌液，酵母菌作为一种常见的单细胞真菌，价格低廉，相较于其它原料，受市场价格波动的影响较小。

附图说明

图1为发明流程示意图。

图2为根皮素标准品的液相检测示意图。

图3为本发明分离提纯得到的根皮素的液相检测示意图

具体实施方式

实施例1：

cm培养基摇瓶发酵的酵母菌菌液停止发酵，取1l发酵液放入锥形瓶中，利用等体积的纯乙醇对菌液进行萃取，萃取液通过离心机进行离心操作，以5000rpm，5min离心，离心结束以后上清液减压浓缩至400ml，再经d101型号的大孔树脂进行富集纯化，上液量2倍柱体积，上液速率0.5ml/min，然后利用体积分数为35％/45％/55％/65％/75％的乙醇依次进行洗脱，将不同浓度的洗脱液进行液相检测，取根皮素含量较高，杂质较少的洗脱液进行浓缩沉淀，沉淀物利用体积分数为95％的乙醇重结晶2次，干燥得产品，经液相检测并未发现明显杂峰。

实施例2：

发酵培养基发酵罐发酵的酵母菌菌液停止发酵，取20l发酵液放入多功能提取罐中，利用等体积的纯乙醇对菌液进行萃取，萃取液通过离心机进行离心操作，以8000rpm，3min离心，离心结束以后上清液浓缩至8l，再经d101型号的大孔树脂进行富集纯化，上液量3倍柱体积，上液速率0.8ml/min，然后利用体积分数为30％/40％/50％/60％/70％/80％的乙醇依次进行洗脱，将不同浓度的洗脱液进行液相检测，取根皮素含量较高，杂质较少的洗脱液进行浓缩沉淀，沉淀物利用体积分数为99％的乙醇重结晶3次，干燥得产品18.15g，经液相检测并未发现明显杂峰。

实施例3：

cm培养基摇瓶发酵的酵母菌菌液停止发酵，取5l发酵液放入多功能提取罐中，利用等体积的纯乙醇对菌液进行萃取，萃取液通过离心机进行离心操作，离心结束以后上清液减压浓缩至2l，再经spd-100型号的大孔树脂进行富集纯化，上液量2倍柱体积，上液速率0.8ml/min，然后利用体积分数为55％/65％/75％/85％的乙醇依次进行洗脱，将不同浓度的洗脱液进行液相检测，取根皮素含量较高，杂质较少的洗脱液进行浓缩沉淀，沉淀物利用体积分数为96％的乙醇重结晶3次，干燥得产品，经液相检测并未发现明显杂峰。

实施例4：

发酵培养基发酵罐发酵的酵母菌菌液停止发酵，取10l发酵液放入多功能提取罐中，利用等体积的纯乙醇对菌液进行萃取，萃取液通过离心机进行离心操作，离心结束以后上清液浓缩至4l，再经spd-100型号大孔树脂进行富集纯化，上液量2倍柱体积，上液速率0.8ml/min，然后利用体积分数为50％/60％/70％/80％/90％/100％的乙醇依次进行洗脱，将不同浓度的洗脱液进行液相检测，取根皮素含量较高，杂质较少的洗脱液进行浓缩沉淀，沉淀物利用体积分数为98％的乙醇重结晶3次，干燥得产品9.09g，经液相检测并未发现明显杂峰。

实施例5：

将实施例1-4制得的根皮素与市面上购得的纯度为98％的根皮素样品进行液相分析并对比，控制两种根皮素溶液的体积分数相同，对检测得到的液相谱图进行分析，根皮素含量分别为98.2％(实施例1-4的平均值)和97.95％(市售样品)。

所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发明的保护范围之列。