一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用的制作方法

本发明属于基因工程和酶制剂
技术领域：
，具体涉及一种新型葡糖淀粉酶及其基因与在同步糖化发酵乳酸单体中的应用。
背景技术：
：淀粉在液化酶的作用下，由高分子状态(淀粉颗粒)转变为较低分子状态(糊精)，变为流动性较好的淀粉液化液。α-淀粉酶是作为淀粉液化的主体酶，能于淀粉分子内部任意切开α-1,4糖苷键，而不能切开α-1,6糖苷键，也不能水解相邻分支点的α-1,4糖苷键。α-淀粉酶水解直链淀粉一般分两步进行，首先任意切开α-1,4糖苷键，使直链淀粉迅速水解成麦芽糖、麦芽三糖和较大分子量的麦芽寡糖，然后再将麦芽三糖和麦芽寡糖缓缓水解成麦芽糖和葡萄糖。上述形成的淀粉液化液经葡糖淀粉酶进一步水解形成葡萄糖用于葡萄糖的制备或其他产品的发酵生产。工业生产用α-淀粉酶均不耐酸，当ph低于4.5时，活力基本消失，通常ph值为5.0-8.0之间较稳定，最适ph值为5.5-6.0。而目前商品化的葡糖淀粉酶的最适作用ph为4.5，因此需要在制糖过程中大量添加盐酸等ph调节剂。另外，上述制糖过程形成的葡萄糖浆直接用于发酵生产时，由于大宗微生物发酵ph主要集中在7.0左右，导致发酵过程需要再次添加碱性ph调节剂使得ph适宜微生物生长。在同步糖化同步发酵产品的工艺过程中这一矛盾更为明显。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明建立了一种最适作用ph接近中性，最适作用温度40℃左右的葡糖淀粉酶的高效制备方法，并形成了以淀粉液化液为原料同步糖化高效制备聚合级乳酸单体的技术。本发明所要提供的技术方案之一，是一种新型葡糖淀粉酶，所述葡糖淀粉酶最适作用ph为6.5，最适作用温度为40-45℃，可用于同步糖化同步发酵工艺；优选地，所述葡糖淀粉酶来自黑曲霉(aspergillusniger)cicimf0215菌株(保存于江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)，其氨基酸序列如序列表seqidno.20所示，其编码基因为glaf，核苷酸序列如序列表seqidno.21所示；优选地，所述葡糖淀粉酶其氨基酸序列如序列表seqidno.17所示，其编码基因为glafs056，核苷酸序列如序列表seqidno.18所示；所述glafs056编码的葡糖淀粉酶发酵液酶活可达90000-120000u/ml，最适作用ph为5.0～9.0，最适作用温度为30～50℃；优选最适作用ph为6.0～7.0，最适作用温度为40～45℃；更优选地最适作用ph为6.5，最适作用温度为40℃；进一步地，上述葡糖淀粉酶基因的获得方式既可以是以来源微生物的染色体dna为模板pcr扩增获得，也可以是以上述来源微生物染色体dna上的核酸序列采用全基因合成的方法获得，更可以是以上述来源微生物染色体dna上的核酸序列为依据结合目标宿主菌的密码子偏好型的重新设计并合成。本发明提供的技术方案二，是表达上述葡糖淀粉酶的重组菌；所述重组菌的表达宿主菌可以是米根霉、酿酒酵母、毕赤酵母、谷氨酸棒杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、大肠杆菌等；所述重组菌的表达宿主优选毕赤酵母gs115，表达载体优选质粒ppic9k；本发明提供的技术方案三，是上述新型葡糖淀粉酶的制备方法，具体如下：(1)接种：按照2-15％(v/v)接种量接种方案二所述的重组菌，发酵培养基中添加微量元素后开始发酵，发酵温度为28-40℃，ph维持4.0-8.0，do维持20％以上；(2)菌体生长阶段：发酵培养基中含1-5％(质量体积比)的甘油可以用于菌体生长约10-28h，甘油耗尽后，do会快速上升，随即进入补料生长阶段；(3))补料生长阶段：流加10-60％甘油(每升甘油中事先添加了5-20ml微量元素母液)，初始流加速度为1.0-8.0ml/min，当do低于20％时停止流加；待甘油再次耗尽，do快速上升后，使菌体保持饥饿状态0.5-3.0h，然后进入诱导产酶阶段；(4)诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了5-20ml微量元素母液)；初始流加速率为1.0-4.5ml/min；当do低于20％时停止流加；待甲醇耗尽，do快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至2.5-8.0ml/min；1-5h后流加甲醇速率提高至5.0-15.5ml/min，诱导70-120h后发酵结束；(5)发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液后制备粉末剂型α-葡萄糖苷酶成品；优选地，发酵培养基组成为：磷酸(85％)26.70ml/l，caso4·2h2o1.18g/l，k2so418.20g/l，mgso47.27g/l，koh4.13g/l，甘油10.00-50.00g/l，其余为水；优选地，发酵培养基中添加0.2-1.2％体积百分比的微量元素母液；所述微量元素母液为ptm1母液，组成为：cuso4·5h2o6.00g/l,nai0.08g/l,mnso4·h2o3.00g/l,namoo4·2h2o0.20g/l,h3bo30.02g/l,cocl20.50g/l,zncl220.00g/l,feso4·7h2o65.00g/l,生物素0.2g/l,硫酸5.0ml/l，其余为水；本发明提供的技术方案四，是上述新型葡糖淀粉酶的应用。优选地，上述葡糖淀粉酶可以在10～300m3发酵体系下用于淀粉液化液为原料和同步糖化并被聚合级d-乳酸或聚合级l-乳酸生产菌种代谢利用高效制备乳酸单体。有益效果：1、本发明中所使用的葡糖淀粉酶其催化属性(最适作用ph为5.0～9.0，最适作用温度为30～50℃)具有与乳酸单体生产菌种生长和产酸条件吻合的特征，可以在同步糖化同步产乳酸的过程中高效发挥催化作用。2、本发明中所建立的葡萄淀粉酶制备方法具备大体量发酵体系下高效制备的特征，可以满足工业化乳酸单体生产体系淀粉液化液预糖化和乳酸发酵过程同步糖化的需要。所形成的同步糖化同步发酵生产乳酸单体的工艺，具备工艺简单，操作稳定等特点，可以大大降低操作难度，节约经济成本。可以实现10m3到200m3及更大规模的聚合级乳酸单体的高效制备过程。附图说明：图1本发明glafs056编码葡糖淀粉酶与原始葡糖淀粉酶最适ph测定曲线；图2本发明glafs056编码葡糖淀粉酶与原始葡糖淀粉酶最适温度测定曲线；图3本发明glafs056编码葡糖淀粉酶ph稳定性曲线；图4本发明glafs056编码葡糖淀粉酶温度稳定性曲线。具体实施方式：为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明涉及的具体方法有：基因的获得技术：(1)采用thermofisher公司的plusrna纯化系统将试剂的裂解能力与rna小量提取试剂盒硅胶离心柱方便的rna提取技术相结合，快速分离提取黑曲霉总rna。(2)在逆转录酶试剂盒reversetranscriptaseassaykit的作用下合成cdna，以上述cdna为模板pcr扩增获得葡糖淀粉酶的编码基因gla。(3)上述获得的葡糖淀粉酶的编码基因克隆入ppic9k质粒的snabi/ecori位点中获得重组质粒ppic-gla。(4)将重组质粒ppic-gla线性化后电击转化的方式在毕赤酵母gs115中整合表达，并通过组氨酸营养缺陷型筛选和g418抗性筛选获得阳性转化子。(5)将上述获得的阳性转化子采用thermofisher(invitrogen)公司提供的毕赤酵母操作手册阳性转化子发酵验证方法制备酶液。测定酶液中的葡糖淀粉酶酶活并进一步确认其酶学性质。(6)以上述获得酶学特性最接近葡糖淀粉酶glaf的氨基酸序列为依据，参考毕赤酵母的密码子偏好性优化上述基因的核酸序列，密码子优化过程中消除原有基因中已有的smai和bamhi位点同时不形成新的上述两个酶切位点，并通过全基因合成的方式获得酶活最优的相关葡糖淀粉酶编码基因。(7)以上述全合成的基因片段为模板采用通用长引物和低温易错pcr的组合方式获得全新的基因片段。并筛选获得最适作用温度接近40～45℃，最适作用ph接近7.0的新型葡糖淀粉酶编码基因，命名为glafs056。(8)葡糖淀粉酶的制备所用发酵培养基为bsm无机盐培养基，组成如下：成分1l添加量(g)磷酸(85％)26.70mlcaso4·2h2o1.18k2so418.20mgso47.27koh4.13甘油10.00—50.00(9)发酵过程中所使用的微量元素母液为ptm1母液，组成如下：成分1l添加量(g)cuso4·5h2o6.00nai0.08mnso4·h2o3.00namoo4·2h2o0.20h3bo30.02cocl20.50zncl220.00feso4·7h2o65.00生物素0.2硫酸6.0ml实施例1待筛选葡糖淀粉酶基因的功能验证以黑曲霉aspergillusnigercicimf0215菌株(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)为出发菌株进行培养，收集菌体。采用trnzol总rna提取试剂提取它们的总rna。以总rna为模板，参照rt-pcr试剂盒说明书，以oligo(dt)为引物逆转录合成第一链cdna。分别以染色体dna或第一链cdna为模板，使用引物(seqidno:1～seqidno:14；相邻的两个为一对上下游引物)进行pcr扩增出葡萄糖淀粉酶的编码基因glaa、glab、glac、glad、glae、glaf和glag。pcr反应条件如下：94℃预变性5min；94℃30s，61℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。将pcr产物与质粒ppic9k分别用snabi和avrii(或noti)进行酶切、纯化，再进行连接，转化escheriachiacolijm109感受态细胞。用含有氨苄青霉素的lb固体培养基筛选阳性转化子，并提取其质粒，用限制性内切酶酶切进行验证。毕赤酵母的遗传转化及筛选：分别将构建成功的7个重组质粒ppic9k-glaa、ppic9k-glab、ppic9k-glac、ppic9k-glad、ppic9k-glae、ppic9k-glaf和ppic9k-glag用saci或sali进行单酶切线性化。酶切产物经纯化回收后电转化转化pichiapastorisgs115，均匀涂布于md平板，30℃恒温培养至单菌落形成。挑取多个单克隆重组酵母分别接种于终浓度为0.5、2mg/ml的ypd/g418平板上进行筛选，30℃培养箱培养至长出单菌落，挑取生长情况好的重组酵母菌株保存，并分别对这7株重组菌进行命名glaa、glab、glac、glad、glae、glaf和glag。采用毕赤酵母表达操作手册给定的培养方法和甲醇诱导发酵方法制备相应的葡糖淀粉酶酶液。葡糖淀粉酶的酶活测定及定义参考国标《gb1886.174-2016》进行。7种葡糖淀粉酶的酶学特性汇总于表1。表1重组毕赤酵母中7种葡糖淀粉酶的酶学特性比较菌株酶活(u/ml)最适作用温度最适作用phglaa2005604.0glab2756604.5glac4642405.0glad3195604.0glae3218406.0glaf3684456.5glag2356505.5基于该葡糖淀粉酶后续将应用于乳酸发酵，其阶段温度维持42～45℃，ph维持7.0的控制要求，选择菌株glaf中的glaf基因作为后续出发酶蛋白进行酶学特性的人工进化的基础。实施例2新型葡糖淀粉酶基因的筛选文库的建立及新型葡糖淀粉酶重组菌的获得以实施例1中筛选获得的glaf核酸序列(seqidno.20所示)为基础序列，参考毕赤酵母的密码子偏好性优化上述基因的核酸序列，密码子优化过程中不形成snabi，avrii和noti等酶切位点，并委托上海生工或华大基因等公司通过全基因合成的方式获得葡糖淀粉酶编码基因glafs(seqidno.19所示)。以上述glafs基因中相对保守序列中的部分碱基串联组成长引物(seqidno:15和seqidno:16；上游引物引入snabi，avrii和noti位点，下游引物引入ecori位点)，短时pcr条件下[95℃10min；30×(94℃30s；56℃1min；72℃0.1～2s)；68℃10min]扩增获得目的条带。将pcr产物与质粒ppic9k分别用snabi和avrii(或noti)进行酶切、纯化，再进行连接，转化escheriachiacolijm109感受态细胞。用含有氨苄青霉素的lb固体培养基筛选阳性转化子，并提取其质粒，用限制性内切酶酶切进行验证。获得重组质粒pk-glafsx(“x”代表转化子的编号)。获得重组质粒在大肠杆菌jm109中保存。作为葡糖淀粉酶基因文库用于分泌表达型新型葡糖淀粉酶编码基因的筛选。毕赤酵母的遗传转化及筛选：分别将构建成功的重组质粒pk-glafsx(“x”代表转化子的编号)用saci或sali进行单酶切线性化。酶切产物经纯化回收后电转化转化pichiapastorisgs115，均匀涂布于md平板，30℃恒温培养至单菌落形成。挑取多个单克隆重组酵母分别接种于终浓度为0.5、2mg/ml的ypd/g418平板上进行筛选，30℃培养箱培养至长出单菌落，挑取生长情况好的重组酵母菌株保存，并分别对重组菌进行命名。采用毕赤酵母操作手册给定的培养方法和甲醇诱导发酵方法制备相应的葡糖淀粉酶酶液。通过测定酶液中葡糖淀粉酶酶活水平选择出最优的转化子。筛选酶活显著提高的转化子及酶活水平见表2。其中编号为glafs056的重组菌产酶水平较出发菌株提高了162.62％，作为最优重组菌用于后续酶液制备和应用。对重组菌株glafs056中的葡糖淀粉酶基因进行测序，如seqidno.18所示，并命名为glafs056基因，该基因对应的氨基酸需如seqidno.17所示。表2转化子及酶活水平实施例325l发酵体系下新型葡糖淀粉酶的制备方法甘油管接种重组菌glafs056至ypd平板，30℃培养40h；单菌落接种ypd液体培养基，250ml三角瓶装液量30ml，30℃培养温度下200r/min摇床培养40h，菌悬液为一级种子；5ml上述菌悬液接种二级种子培养基(液体ypd)，500ml三角瓶装液量100ml，30℃培养温度下200r/min摇床培养16h，od600测定为10时，停止培养用于发酵罐接种；发酵罐准备：按照11l初始装液量配制发酵培养基(bsm，含甘油40g/l)，氨水调节ph至5.0，搅拌充分后，121℃30min灭菌，同时准备补料瓶等，并配制50％甘油5.5l用于补料；接种：按照10％接种量接种，将131.59ml微量元素ptm1母液加入罐中并开始发酵，发酵温度为30℃，ph维持5.0，do维持20％以上；菌体生长阶段：发酵培养基中含4％的甘油可以用于菌体生长约20h，甘油耗尽后，do会快速上升，随即进入补料生长阶段；补料生长阶段：流加50％甘油(每升甘油中事先添加了12mlptm1母液)，初始流加速度为4.0ml/min，当do低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，do快速上升后，使菌体保持饥饿状态1h，然后进入诱导产酶阶段；诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了12mlptm1母液)，初始流加速率为1.8ml/min；当do低于20％时停止流加，待甲醇耗尽，do快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至4.3ml/min；2h后流加甲醇速率提高至8.5ml/min，诱导90h后发酵结束，经测定葡糖淀粉酶发酵液酶活为105000u/ml。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液后添加5％食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型α-葡萄糖苷酶成品。实施例4300m3发酵体系下新型葡糖淀粉酶的制备方法将实施例3中工艺调整为300m3发酵体系对应的比例，同步换算补料速率和甲醇流加速率。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种；菌体生长阶段：发酵培养基中含5％的甘油可以用于菌体生长约28h，甘油耗尽后，do会快速上升，随即进入补料生长阶段；补料生长阶段：流加60％甘油(每升甘油中事先添加了15mlptm1母液)，初始流加速度为8.0ml/min，当do低于20％时停止流加。待甘油再次耗尽，do快速上升后，使菌体保持饥饿状态2h，然后进入诱导产酶阶段；诱导产酶阶段：流加甲醇(每升甲醇中事先添加了15mlptm1母液)，初始流加速率为3.6ml/min；当do低于20％时停止流加，待甲醇耗尽，do快速上升后，重新开始流加，流加速率提高至7.3ml/min；2h后流加甲醇速率提高至10.9ml/min，诱导75h后发酵结束，发酵结束后发酵液酶活力为118000u/ml；发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液10倍后添加辅助制剂(每吨成品添加nacl25kg，糊精10kg，苯甲酸钠0.25kg，尼铂金乙脂和尼铂金丙脂各0.25kg)后精滤制备葡糖淀粉酶液体成品。实施例5glafs056编码新型葡糖淀粉酶酶学性质测定葡糖淀粉酶的酶活测定参考国标《gb1886.174-2016》进行。本实施例在不同温度下对比新型葡糖淀粉酶酶活的差异性，并与酶源菌株aspergillusnigercicimf0215发酵液不同温度下酶活特性进行对比(如图1，图2)，新型葡糖淀粉酶的最适作用温度为40℃，最适作用ph为6.5。将本发明所述的新型葡糖淀粉酶分别在不同ph及温度下保存后，在45℃，ph为6.5下测定酶活，发现新型葡糖淀粉酶在乳酸单体发酵过程的对应的温度(40～45℃)和ph(5.5-6.5)条件下稳定性良好(图3和图4所示)。实施例6—同步糖化同步发酵生产聚合级d-乳酸单体获得的cgmccno.11059(zl201210102731.8)菌种在200m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。发酵前期进行淀粉液化液的预处理，淀粉液化液无需调整ph，温度降至50℃添加实施例4所得葡糖淀粉酶0.3l/吨绝干淀粉，预糖化8h。菌体在25-36℃进行好氧培养至od600值约为15-40，将发酵罐温度设定为37-50℃继续好氧培养0-120min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段0-3h发酵温度为33-39℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％，其中补加实施例4所得葡糖淀粉酶0.2l/吨绝干淀粉，3-6h发酵温度为37-42℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％，6-10h发酵温度为38-45℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，10-16h发酵温度为40-48℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％，其中补加实施例4所得葡糖淀粉酶0.2l/吨绝干淀粉，16-24h发酵温度为45-50℃流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％。其发酵培养基为(g/l)：磷酸氢二铵11-25，磷酸二氢钾3-5，磷酸氢二钠，15-25，氯化钠2-5，mgso40.2-0.5，feso40.3-1，fecl30.2-1，cocl20.3-1，cucl20.4-1，na2moo40.2-1，h3bo30.1-1，mncl20.2-1，柠檬酸10-25，硫胺素0.2-1，木糖5-50，甘油5-50，葡萄糖5-50，硫酸1-5，其余为水，ph6.0-7.5。重复发酵过程5个批次。详细发酵结果见表3。表3五批次200m3罐发酵生产极高光学纯d-乳酸结果实施例7—同步糖化同步发酵生产聚合级l-乳酸单体将实施例6使用的cgmccno.11059(zl201210102731.8)菌株更换为cgmccno.11060(zl201210102731.8)菌株，其余条件不变，在200m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。发酵过程按照实施例6进行。重复发酵过程5个批次。详细发酵结果见表4。表4五批次200m3罐连续转化生产极高光学纯l-乳酸结果以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。序列表<110>天津科技大学<120>一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用<130>1<141>2018-08-13<160>21<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>29<212>dna<213>人工序列()<400>1gtaactagtttcgttggcaatatggctga29<210>2<211>38<212>dna<213>人工序列()<400>2tgctctagatcagatacgcacgagactaaagatcaaag38<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列()<400>3gtatccttgagtttctcctcagatgtggc29<210>4<211>33<212>dna<213>人工序列()<400>4tgctctagattacgaaggcaccccctcatattc33<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列()<400>5gtaatgcaggcaattgagcaggcag25<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列()<400>6tgctctagatcaaaatgctagaccgacagcggaat35<210>7<211>33<212>dna<213>人工序列()<400>7gtatataccgaggaatacaatggctgttactcc33<210>8<211>31<212>dna<213>人工序列()<400>8tgctctagactagcgtcgatcggggttggtc31<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列()<400>9gtaaatgtgatttccaagcgcg22<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列()<400>10tgctctagactaccgccaggtgtcagtcac30<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列()<400>11gtagatccggcaaacgaatattgcg25<210>12<211>28<212>dna<213>人工序列()<400>12tgctctagattatctgtcgccccctccg28<210>13<211>30<212>dna<213>人工序列()<400>13gtaagcagttatgaacttgtggaaacctgg30<210>14<211>34<212>dna<213>人工序列()<400>14tgctctagattaagccaacaaagcaaaagcaaga34<210>15<211>93<212>dna<213>人工序列()<400>15agcgatatccgcggatccatgcaggctatcatcgttgttgcttctcctggacgtgttaat60cgctgcacctcttctgctgatcccgccgtttct93<210>16<211>86<212>dna<213>人工序列()<400>16ccggaattcttagaaagccagaccaacaaagagatgtcagcagattcagcgatcgggagc60agccagggtgcacagatagacggcag86<210>17<211>661<212>prt<213>人工序列()<400>17metglyvalasphisthrthrlysleuserthrasnglyproglyarg151015gluservalargileglyserasnlystyrtyraspgluglyleuphe202530ileileaspleuglnhismetproglyservalcysglythrtrppro354045alaphetrpserthrglylysasntrpprothraspglygluileasp505560ileilegl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