本发明涉及微生物化学技术领域，具体为一种利用粉红粘帚霉真菌制备苯酚类化合物的方法。
背景技术
粉红粘帚霉(gliocladiumroseumbainier.)属半知菌门,丝孢纲,丛梗孢目,丛梗孢科,粘帚霉属,是一种分布广泛的土壤习居菌和重寄生菌,具有生长速度快、产孢量大、寄主范围广、寄生能力强、拮抗机制多样等优点。粉红粘帚霉是农业生物防治上极具潜力的生防因子之一。它能产生几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等细胞壁降解霉,从而侵染核盘菌、禾谷镰刀菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢等多种对瓜果蔬菜、观赏性植物、水稻具有危害的病原真菌细胞壁,达到生物防治的作用,避免化学防治所带来的环境污染、农药残留以及病菌抗药性等问题。它在重金属生物修复中也具有潜在的应用价值。有研究发现gliocladiumroseum能使不溶性碳酸铅转化成可溶性草酸铅,可修复采矿场周围重金属的污染。粉红粘帚霉次生代谢物具有显著的杀线虫能力。
学者dong等从菌株编号为ymf1.00133的粉红粘帚霉属小麦固体发酵物中分离出一系列具有杀线虫作用的化合物gliocladinea-e,verticillina,11'-deoxyverticillina,sch52900andsch52901。学者song等继续dong的研究从gliocladiumroseumymf1.00133小麦固体发酵物中分离得到两个具有杀线虫活性化合物gliocladinc、5-n-heneicosylresorcinol。粉红粘帚霉真菌在微生物转化方面也有很好的应用前景。
gliocladiumroseum可通过经济环保、绿色可持续的方法进行生物合成球形、结晶、单分散的硒纳米粒子。andre´sgarcı´a-granados使用gliocladiumroseumcect2733微生物转化方法实现了化学方法很难实现的倍半萜-4-羟基琥珀酸-1,6-二酮c-11位羟基化的转化获得三个新化合物。学者fu使用gliocladiumroseumcgmcc3.3657实现了结构复杂的天然产物熊果酸饱和碳上的羟基化反应,此生物转化新产物较熊果酸具有较好的抗hcv活性。fu还发现gliocladiumroseumcgmcc3.3657对刺囊酸的微生物转化可作为改造齐墩果酸五环三萜类化合物a环的新方法。
粉红粘帚霉应用广泛,可进一步研究其应用价值,为新药的开发和寻找新颖的化合物提供帮助。
技术实现要素：
本发明通过对粉红粘帚霉gliocladiumroseumcgmcc3.3657的液体发酵产物进行了研究,从其乙酸乙酯提取物中分离得到4个苯酚类化合物：对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸，化学式为：
所述粉红粘帚霉菌种名为gliocladiumroseum，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为cgmcc3.3657。
制备方法为：配制pda培养液，接种所述粉红粘帚霉，培养15-20天，过滤发酵液，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得粗提物，粗提物经中压c18柱色谱甲醇-水梯度洗脱，再用硅胶柱层析石油醚:丙酮等度洗脱即得。
本发明从gliocladiumroseumcgmcc3.3657发酵液乙酸乙酯粗提物中分离得到4个苯酚类化合物,经核磁共振波谱分别鉴定为对羟基苯甲醛(1)、对羟基苯甲酸(2)、3,4-二羟基苯甲酸(3)、3,5-二羟基苯甲酸(4)。采用中压制备色谱、硅胶柱层析法分离次生代谢产物,通过核磁共振技术进行化合物结构鉴定，该4种化合物均为首次从该品种中分离得到，产量高，菌种易获取，进一步挖掘了该菌株的应用价值,为生产相关药品提供了新的技术。
具体实施方式
下面结合实施例进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
实施例1
本发明从粉红粘帚霉gliocladiumroseumcgmcc3.3657的液体发酵产物的乙酸乙酯提取物中分离得到4个苯酚类化合物：对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸，化学式为：
1.材料与方法
1.1仪器与材料agilentdd2400-mrnmr型核磁共振仪,tms为内标(美国agilent公司);sepacore中压制备系统(瑞士büchi公司);反相c18填料(ods,日本富士硅化学株式会社);薄层色谱硅胶gf254和柱色谱硅胶(300～400目,中国青岛海洋化工公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);bs-2f恒温摇床(常州华冠仪器制造有限公司);生物净化台(苏州净化仪器有限公司);三相紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)。
gliocladiumroseumcgmcc3.3657购于中国微生物菌种保藏中心,菌种pda斜面保藏于4℃冰箱。
1.2菌株的液体发酵培养和次生代谢产物的萃取将土豆削皮切小块加入水中煮大约30min,用8层纱布过滤土豆汤汁,加入葡萄糖混匀分装(土豆:葡萄糖:蒸馏水=1:0.1:5),121℃高温灭菌20min。在无菌操作台内将保存的gliocladiumroseumcgmcc3.3657活化两次后挑取三小块菌丝体连同培养基接种到盛有40mlpda培养液的100ml锥形瓶内,150r/min28℃摇床培养4天制作母液。同样在无菌操作台内将母液接种到含有400ml培养液的1l锥形内,一共30l培养液以同样条件发酵培养15天。发酵完成后抽滤瓶过滤菌丝体和发酵液,乙酸乙酯萃取三次,减压浓缩得粗提物6.0g。
1.3粗提物的分离纯化粗提物6.0g经中压c18柱色谱(50mm×460mm)甲醇-水(10%→100%,v/v)梯度洗脱粗分成6部分(fr.1~6)。fr.3用硅胶柱层析(石油醚:丙酮=2:1,v/v)等度洗脱得化合物3(17mg)和化合物4(80mg);fr.4用硅胶柱层析(石油醚:丙酮=1.5:1,v/v等度洗脱),得化合物1(25mg)和化合物2(749.2mg)。
2.结果
我们对真菌gliocladiumroseumcgmcc3.3657进行发酵培养积累次生代谢产物,从中分离得到4个苯酚类化合物,分别鉴定为：对羟基苯甲醛(1)、对羟基苯甲酸(2)、3,4-二羟基苯甲酸(3)、3,5-二羟基苯甲酸(4)。
2.1化合物1黄色结晶,25mg。13c-nmr(400mhz,c3d6o)δ:191.16(cho),163.88(c-4),132.79(c-2,6),115.76(c-3,5)。以上数据与文献[11]报道一致,确定化合物1为对羟基苯甲醛。
2.2化合物2白色粉末,749.2mg。13c-nmr(400mhz,c3d6o)δ:167.27(c-7),161.82(c-4),131.87(c-2,6),121.57(c-1),115.10(c-3,5)。以上数据与文献[12]基本一致,确定化合物2为对羟基苯甲酸。
2.3化合物3白色粉末,17mg。13c-nmr(400mhz,cd3od)δ:168.08(cooh),151.08(c-4),145.90(c-3),123.97(c-6),123.40(c-1),117.80(c-2),116.03(c-5)。以上数据与文献[13]报道一致,确定化合物3为3,4-二羟基苯甲酸。
2.4化合物4黄色结晶,80mg。13c-nmr(400mhz,cd3od)δ:168.91(cooh),158.05(c-3,5),132.15(c-1),107.91(c-2,6),106.97(c-4)。以上数据与文献[14]报道一致,确定化合物4为3,5-二羟基苯甲酸。