本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及产膝沟藻毒素的微小亚历山大藻的培养方法。
技术背景
自1957年石房蛤毒素(saxitoxinstx)首次被发现，共有57种麻痹性贝类毒素(paralyticshellfishtoxinspsts)同系物被记载。
麻痹性贝类毒素是一类具有神经麻痹作用的生物碱，其中毒机理是毒素结合了钠离子通道结构，阻碍了钠离子的流动。中毒后没有解药，唯一的解救方法是人工呼吸和输液。psts因其毒性强烈、无色无味且具有麻痹作用，在军事上有应用于生化武器的可能性，在医疗上则作为探索新型麻醉剂的前体物质，而在环境和食品检测方面，国外已有部分psts毒素标准品出售，但售价昂贵。
麻痹性贝类毒素在医用方面具有广泛的应用。一方面环境保护、食品安全方面需要防止这类毒素的危害，另一方面，由于其强烈的生理活性，又可以加以利用。在毒素药用方面，类似于芋螺毒素，以麻痹性贝类毒素为先导化合物，开发毒性小、活性高的生物制品是当前研究的热点之一。
由于具有麻痹作用，stx因此具有开发新型麻醉剂的可能。为了克服毒性问题，可将stx制成脂质体试剂，stx脂质体试剂具有缓慢释放的特性，有望应用于临床。膝沟藻毒素gtx2/3同样具有临床潜能，它们被用来治疗肛裂是比较安全和有效的，也可被用来治疗慢性紧张型头痛。随着越来越多的毒素被发现，麻痹性贝类毒素的应用价值会进一步的提升，展现出良好的应用前景。
麻痹性贝类毒素主要产生于微藻，通过对有害微藻产毒因素的探究，人们可以更好地预警有害赤潮的爆发和影响，降低财产损失和健康风险；也可以探索选育产毒能力高的产毒藻，制备标品，应用于科研及医学检验。因此，对产麻痹性贝类毒素的有害藻类生长和产毒影响因素进行相应的研究有着重要意义。
微小亚历山大藻(alexandriumminutum)隶属原生生物界(protoctista)、甲藻门(dinoflagellata)、亚历山大属(alexandrium)，是一种有甲片的海洋浮游甲藻，细胞大小在13-30μm，分布广泛并且与产麻痹性贝类毒素(paralyticshellfishtoxinspsts)赤潮有关。其体内产生的膝沟藻毒素(gonyautoxin)gtx1、gtx2、gtx3、gtx4，经软体动物富集，最终通过食物链传递给贝类、鱼类和人类，可引起人严重的麻痹性贝类毒素中毒(paralyticshellfishpoisoningpsp)，国内已发生多起因食用含麻痹性贝类毒素的织纹螺而导致死亡的事故。
然而目前对于麻痹性贝类毒素却才存在非常大的缺口，由于获取方式较为单一，目前对麻痹性贝类毒素的获取方式得到的毒素远远不能满足需要。因此，需要开发更广阔高效的获取毒素的方法。
现有技术如授权公告号为cn103834567b的中国发明专利，公开了一种微藻培养方法，所述方法将微藻固定化培养和液体培养相结合，具体是将微藻接种到固体材料上进行固定化培养，然后将经过固定化培养的微藻接种到液体中继续培养。使用本发明的方法培养微藻不需要严苛的条件，能耗较低，不易发生污染，并且能够产生高密度的藻细胞，能够通过固-液培养结合的方法实现色素、脂类、烃类和糖类等次生代谢物的产业规模化生产。然而，该方法培养基组成复杂，微藻生长速率较慢。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种简单高效的产膝沟藻毒素的微小亚历山大藻的培养方法，培养过程不易发生污染，且微小亚历山大藻生长速率快、产毒含量高。
本发明针对
背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：
产膝沟藻毒素的微小亚历山大藻的培养方法，包括如下内容：
微小亚历山大藻采用常规的培养方法和条件，且在微小亚历山大藻培养初期，在培养基中添加海洋红酵母提取物，培养基中添加海洋红酵母提取物的量为10-100mg/l。
作为优选，海洋红酵母提取物的制备方法为：取海洋红酵母干粉，加入红酵母干粉质量2-5倍的蒸馏水、红酵母干粉质量0.03-0.08％的(s)-(+)-3-(1-萘氧基)-1-苯基-1-丙醇和0.02-0.05％的柠檬酸，制成悬浮液，于功率500-600w下超声10-40min；调节ph至5.0-6.5，温度45-65℃，加入红酵母干粉质量0.1-1％的木瓜蛋白酶，酶解6-24h；离心，取上清液冷冻干燥，得海洋红酵母提取物；(s)-(+)-3-(1-萘氧基)-1-苯基-1-丙醇和柠檬酸具有耦合作用，在超声作用下，能够促进海洋红酵母细胞破裂，使得细胞内β-葡聚糖、甘露寡糖、活性多肽以及虾青素等活性物质溶出，为微小亚历山大藻生长繁殖提供充沛的营养物质，同时活性多肽能够抑制炎症和抵抗微生物感染，有利于在微小亚历山大藻培养初期就营造健康和谐的培养基系统，从而提高培养效率。
作为优选，微小亚历山大藻的培养条件为：温度15-50℃，光照强度100-600μmol/m2/s，培养时间2-10天。
作为优选，培养在不完全封闭或开放式的环境进行；不完全封闭的环境比如通风的玻璃大棚等，开放式的环境比如跑道池等；采用半连续的培养方式，可及时考察及调整微生物培养的条件参数，有利于寻求最佳的培养环境，提高培养效率，且具有培养周期短，光利用率高等优点。
作为优选，产膝沟藻毒素的微小亚历山大藻培养基，具体包括以下质量浓度的各组分：nano3为1.1-1.8g/l，k2hpo4·3h2o为0.02-0.05g/l，mgso4·7h2o为0.05-0.08g/l，znso4为0.02-0.04g/l，cocl2为0.001-0.004g/l，mncl2为0.02-0.04g/l，fecl3·6h2o为0.002-0.005g/l，na2edta·2h2o为0.001-0.003g/l，柠檬酸为0.003-0.006g/l，天然海水。
进一步优选，天然海水做如下处理：在海水中添加0.02-0.03‰的月桂酸和0.006-0.01％的山梨酸钾，搅拌均匀，静置24-36h后过滤；月桂酸和山梨酸钾的特殊存在能够抑制海水中有害微生物的脱氢酶系统，使微生物的蛋白质凝固和变性，从而抑制有害微生物的的生存和繁殖，为培养基的构建提供健康有利的环境，能够加强培养基组成的稳定性，从而提高了培养基的耐生长性，有利于提高微小亚历山大藻的扩繁效益，避免因污染等不稳定因素造成的成本浪费；同时，有利于促进微小亚历山大藻的生长速率，最终可提高微小亚历山大藻产毒含量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明在微小亚历山大藻培养初期，在培养基中添加海洋红酵母提取物，其海洋红酵母提取物细胞内富含β-葡聚糖、甘露寡糖、活性多肽以及虾青素等活性物质，能够为微小亚历山大藻生长繁殖提供充沛的营养物质，同时活性多肽能够抑制炎症和抵抗微生物感染，有利于在微小亚历山大藻培养初期就营造健康和谐的培养基系统，从而提高培养效率；2)在微小亚历山大藻培养基成分天然海水中添加月桂酸和山梨酸钾，能够抑制海水中有害微生物的脱氢酶系统，使微生物的蛋白质凝固和变性，从而抑制有害微生物的的生存和繁殖，为培养基的构建提供健康有利的环境，能够加强培养基组成的稳定性，从而提高了培养基的耐生长性，有利于提高微小亚历山大藻的扩繁效益，避免因污染等不稳定因素造成的成本浪费；同时，有利于促进微小亚历山大藻的生长速率，最终可提高微小亚历山大藻产毒含量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
考察海洋红酵母提取物含量对微小亚历山大藻培养的影响。
将处于对数生长期的微小亚历山大藻藻液接种于20l的开放式跑道池反应器中，培养基包括以下质量浓度的各组分：nano3为1.6g/l，k2hpo4·3h2o为0.03g/l，mgso4·7h2o为0.06g/l，znso4为0.03g/l，cocl2为0.002g/l，mncl2为0.04g/l，fecl3·6h2o为0.004g/l，na2edta·2h2o为0.002g/l，柠檬酸为0.005g/l，天然海水；接种后微小亚历山大藻的初始密度为1×106个/ml，添加不同含量的海洋红酵母提取物进行培养实验；实验在30℃进行培养，光照强度350μmol/m2/s，光暗周期24h，光暗时间比为14﹕10(小时)，培养6天后，用血球计数法在显微镜下对微小亚历山大藻的数量以及杂菌和病虫害的数量进行观察计数，所得的结果如表1；
上述天然海水做如下处理：在海水中添加0.02‰的月桂酸和0.007％的山梨酸钾，搅拌均匀，静置24h后过滤；月桂酸和山梨酸钾的特殊存在能够抑制海水中有害微生物的脱氢酶系统，使微生物的蛋白质凝固和变性，从而抑制有害微生物的的生存和繁殖，为培养基的构建提供健康有利的环境，能够加强培养基组成的稳定性，从而提高了培养基的耐生长性，有利于提高微小亚历山大藻的扩繁效益，避免因污染等不稳定因素造成的成本浪费；同时，有利于促进微小亚历山大藻的生长速率，最终可提高微小亚历山大藻产毒含量；
海洋红酵母提取物的制备方法为：取海洋红酵母干粉，加入红酵母干粉质量4倍的蒸馏水、红酵母干粉质量0.05％的(s)-(+)-3-(1-萘氧基)-1-苯基-1-丙醇和0.03％的柠檬酸，制成悬浮液，于功率550w下超声30min；调节ph至6.5，温度50℃，加入红酵母干粉质量0.6％的木瓜蛋白酶，酶解20h；离心，取上清液冷冻干燥，得海洋红酵母提取物；(s)-(+)-3-(1-萘氧基)-1-苯基-1-丙醇和柠檬酸具有耦合作用，在超声作用下，能够加速海洋红酵母细胞破裂，使得细胞内β-葡聚糖、甘露寡糖、活性多肽以及虾青素等活性物质溶出，为微小亚历山大藻生长繁殖提供充沛的营养物质，同时活性多肽能够抑制炎症和抵抗微生物感染，有利于在微小亚历山大藻培养初期就营造健康和谐的培养基系统，从而提高培养效率。
表1海洋红酵母提取物含量对微小亚历山大藻培养的影响
实施例2：
考察温度、光强对微小亚历山大藻培养的影响。
将处于对数生长期的微小亚历山大藻藻液接种于20l的开放式跑道池反应器中，培养基包括以下质量浓度的各组分：nano3为1.6g/l，k2hpo4·3h2o为0.03g/l，mgso4·7h2o为0.06g/l，znso4为0.03g/l，cocl2为0.002g/l，mncl2为0.04g/l，fecl3·6h2o为0.004g/l，na2edta·2h2o为0.002g/l，柠檬酸为0.005g/l，天然海水；接种后微小亚历山大藻的初始密度为1×106个/ml，添加80mg/l的海洋红酵母提取物进行培养实验；培养光暗周期24h，光暗时间比为14﹕10(小时)，培养6天后，用血球计数法在显微镜下对微小亚历山大藻的数量以及杂菌和病虫害的数量进行观察计数，所得的结果如表2；
上述天然海水做如下处理：在海水中添加0.02‰的月桂酸和0.007％的山梨酸钾，搅拌均匀，静置36h后过滤；月桂酸和山梨酸钾的特殊存在能够抑制海水中有害微生物的脱氢酶系统，使微生物的蛋白质凝固和变性，从而抑制有害微生物的的生存和繁殖，为培养基的构建提供健康有利的环境，能够加强培养基组成的稳定性，从而提高了培养基的耐生长性，有利于提高微小亚历山大藻的扩繁效益，避免因污染等不稳定因素造成的成本浪费；同时，有利于促进微小亚历山大藻的生长速率，最终可提高微小亚历山大藻产毒含量；
海洋红酵母提取物的制备方法为：取海洋红酵母干粉，加入红酵母干粉质量4倍的蒸馏水、红酵母干粉质量0.05％的(s)-(+)-3-(1-萘氧基)-1-苯基-1-丙醇和0.03％的柠檬酸，制成悬浮液，于功率550w下超声30min；调节ph至6.5，温度50℃，加入红酵母干粉质量0.6％的木瓜蛋白酶，酶解20h；离心，取上清液冷冻干燥，得海洋红酵母提取物；(s)-(+)-3-(1-萘氧基)-1-苯基-1-丙醇和柠檬酸具有耦合作用，在超声作用下，能够加速海洋红酵母细胞破裂，使得细胞内β-葡聚糖、甘露寡糖、活性多肽以及虾青素等活性物质溶出，为微小亚历山大藻生长繁殖提供充沛的营养物质，同时活性多肽能够抑制炎症和抵抗微生物感染，有利于在微小亚历山大藻培养初期就营造健康和谐的培养基系统，从而提高培养效率。
表2温度、光强对微小亚历山大藻培养的影响
由实施例1-2可知，产膝沟藻毒素的微小亚历山大藻的培养方法，当海洋红酵母提取物添加量为80mg/l，培养温度为30℃，光照强度为350μmol/m2/s时，微小亚历山大藻的生长最具有优势。
对比例1：
海洋红酵母提取物制备过程中不添加(s)-(+)-3-(1-萘氧基)-1-苯基-1-丙醇和柠檬酸，且海洋红酵母提取物的添加量为80mg/l，其余部分和实施例1完全一致；由此条件下测得的微小亚历山大藻生物量为5.76×107个/ml，杂菌和病虫害细胞数量为1.43×106个/ml，表明(s)-(+)-3-(1-萘氧基)-1-苯基-1-丙醇和柠檬酸具有耦合作用，能够促进海洋红酵母细胞破裂，使得细胞内β-葡聚糖、甘露寡糖、活性多肽以及虾青素等活性物质溶出，为微小亚历山大藻生长繁殖提供充沛的营养物质，同时活性多肽能够抑制炎症和抵抗微生物感染，提高培养效率。
对比例2：
天然海水处理中未添加月桂酸和山梨酸钾，且海洋红酵母提取物的添加量为80mg/l，其余部分和实施例1完全一致；由此条件下测得的微小亚历山大藻生物量为9.33×107个/ml，杂菌和病虫害细胞数量为1.25×105个/ml，表明月桂酸和山梨酸钾的特殊存在能够抑制有害微生物的的生存和繁殖，为培养基的构建提供健康有利的环境。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。