本发明涉及一种海藻糖的清洁生产工艺，属于发酵工程技术领域。
背景技术
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1,1键结合而成的非还原性双糖，广泛存在于细菌、真菌、藻类、低等植物及昆虫中。经研究发现，该糖具有独特的生物学功能，有保护生物大分子，保护细胞膜，保护蛋白质免受冷冻、干燥及渗透压变化等造成的破坏的作用，在食品、医药、化妆品、农业等领域均具有广泛应用。
目前，国内外市场对海藻糖的需求不断扩增，其生产技术也在不断追求进步。早期，海藻糖产品主要通过从酵母细胞中提取，产率低，成本高，工艺复杂，限制海藻糖的应用；近年来，在许多微生物中发现能够一步转化麦芽糖生成海藻糖的海藻糖合酶，该途径不消耗高能物质，不依赖磷酸，且底物麦芽糖便于获得，与海藻糖相比有较大的优势。因此，该途径极有工业化前景。
但是，这些能够分泌海藻糖合酶的微生物产量均不高，大大限制了这些微生物在工业生产方面的应用，因此，已经有许多研究试图通过基因工程等手段提高这些能够分泌海藻糖合酶的微生物的产量或提高这些海藻糖合酶本身的活性以满足工业化需求，例如，构建基因工程菌、构建突变体等。
不过，构建基因工程菌对提高这些能够分泌海藻糖合酶产量的帮助有限，构建突变体则随机性太强，因此，或许可通过发酵工程手段，对现有的一些海藻糖合酶生产菌的发酵条件进行优化，以提高它们的海藻糖合酶产量。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供了一种海藻糖的清洁生产工艺。此方法通过将含有海藻糖合成酶或其突变体基因的大肠杆菌基因工程菌接种于添加有脂肪酸和/或乳糖和/或卵磷脂，且以葡萄糖和麦芽糖作为复合碳源的发酵培养基中进行诱导发酵培养，大大提高了海藻糖的产量以及培养基中葡萄糖和麦芽糖的利用率；使用此方法，可将海藻糖的产量从82g/l提高至157g/l，具有极大的应用前景。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种海藻糖的清洁生产工艺，所述方法为将含有海藻糖合成酶或其突变体基因的大肠杆菌基因工程菌接种于添加有脂肪酸和/或乳糖和/或卵磷脂的发酵培养基中进行发酵培养，制备海藻糖。
所述含有海藻糖合成酶或其突变体基因的大肠杆菌基因工程菌记载于公开号为cn107227304a、申请号为201710585267.5的专利文献中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将含有海藻糖合成酶或其突变体基因的大肠杆菌基因工程菌接种于种子培养基进行种子培养，得到种子液；然后将种子液接种于添加有脂肪酸和/或乳糖和/或卵磷脂的发酵培养基中进行发酵培养，制备海藻糖。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸的添加量为3～5g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸的添加量为3g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酸包含亚麻酸、亚油酸、油酸。
在本发明的一种实施方式中，所述乳糖的添加量为5～8g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述乳糖的添加量为6g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述卵磷脂的添加量为0.8～1.2g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述卵磷脂的添加量为1g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含3～5g/l脂肪酸、5～8g/l乳糖、0.8～1.2g/l卵磷脂、8～15g/l葡萄糖、15～30g/l麦芽糖、8～15g/l蛋白胨、6～10g/l柠檬酸、0.5～1g/lk2hpo4、0.1～0.5g/lkh2po4以及0.01～0.05mmol/liptg(异丙基硫代-β-d半乳糖苷)。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含3g/l脂肪酸、6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖、12g/l蛋白胨、8g/l柠檬酸、0.8g/lk2hpo4、0.3g/lkh2po4以及0.01mmol/liptg(异丙基硫代-β-d半乳糖苷)。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的ph为6～8。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的ph为7。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含5～12g/l蛋白胨、3～8g/l酵母粉以及5～12g/lnacl。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉以及10g/lnacl。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的ph为6～8。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的ph为7。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的温度为20～30℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的温度为25℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的转速为250～350rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的转速为280rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的时间为20～30h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的时间为24h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的温度为30～40℃。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的温度为37℃。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的时间为1～3h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的时间为2h。
本发明提供了上述一种海藻糖的清洁生产工艺在生产海藻糖方面的应用。
有益效果：
发明的方法通过将含有海藻糖合成酶或其突变体基因的大肠杆菌基因工程菌接种于添加有脂肪酸和/或乳糖和/或卵磷脂，且以葡萄糖和麦芽糖作为复合碳源的发酵培养基中进行诱导发酵培养，大大提高了海藻糖的产量以及培养基中葡萄糖和麦芽糖的利用率；使用本发明的方法，可将海藻糖的产量从82g/l提高至157g/l，具有极大的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的大肠杆菌基因工程菌为记载于公开号为cn107227304a、申请号为201710585267.5的专利文献中含有海藻糖合成酶突变体m106k基因的大肠杆菌基因工程菌。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉以及10g/lnacl
发酵培养基：12g/l蛋白胨、8g/l柠檬酸、0.8g/lk2hpo4、0.3g/lkh2po4以及0.01mmol/liptg(异丙基硫代-β-d半乳糖苷)
下述实施例中涉及的检测方法如下：
产量检测方法：高效液相色谱(hplc)法
色谱柱：氨基柱(赛默飞aps-2hypersil)
流动相为乙腈：水＝80：20。
标准品：称取海藻糖(纯度＝99.5％)标准品0.5g，精确至0.0001g，用超纯水溶解并定容至50ml，摇匀。用0.2um微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用。
样品制备：将糖化结束的催化液于沸水中煮沸10分钟灭酶，用超纯水稀释10倍，12000r/min离心25分钟。用0.2um微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用。
试样的测定：首先用流动相以0.8ml/min的流速冲洗管路30分钟，装上色谱柱，正式进样分析前，将所用流动相输入参比池40分钟，走基线，待基线走稳后,将标准溶液和制备好的试样分别进样10ul。根据标准品的保留时间定性样品中的糖组分，根据样品的峰面积，以外标法计算糖组分的浓度。
结果计算：
式中：cm—海藻糖浓度，单位为(g/l)；
am—样品峰面积；
as—标准品峰面积；
cs—标准品质量，g。
对比例1
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入30g/l葡萄糖；
(3)将100ml含有30g/l葡萄糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为82g/l。
对比例2
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入30g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有30g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为97g/l。
实施例1
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入3g/l亚麻酸、6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有3g/l亚麻酸、6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为157g/l。
实施例2
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入3g/l亚油酸、5g/l乳糖、0.8g/l卵磷脂、8g/l葡萄糖、15g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有3g/l亚油酸、5g/l乳糖、0.8g/l卵磷脂、8g/l葡萄糖、15g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为139g/l。
实施例3
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入5g/l油酸、8g/l乳糖、1.2g/l卵磷脂、15g/l葡萄糖、30g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有5g/l油酸、8g/l乳糖、1.2g/l卵磷脂、15g/l葡萄糖、30g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为151g/l。
实施例4
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为109g/l。
实施例5
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为127g/l。
实施例6
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入3g/l亚麻酸、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有3g/l亚麻酸、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为133g/l。
实施例7
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入3g/l亚麻酸、6g/l乳糖、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有3g/l亚麻酸、6g/l乳糖、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为137g/l。
实施例8
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入3g/l亚麻酸、6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、20g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有3g/l亚麻酸、6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、20g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为121g/l。
实施例9
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入3g/l亚麻酸、6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖；
(3)将100ml含有3g/l亚麻酸、6g/l乳糖、1g/l卵磷脂、10g/l葡萄糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为103g/l。
实施例10
具体步骤如下：
(1)将50ml种子培养基装于250ml摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌基因工程菌(m106k)种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，37℃培养2h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入6g/l乳糖、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖；
(3)将100ml含有6g/l乳糖、10g/l葡萄糖、20g/l麦芽糖的发酵培养基装于500nl摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，25℃、280rpm培养24h，得到发酵液。
检测发酵液中海藻糖的产量，产量为115g/l。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。