本发明属于生物医学
技术领域：
，具体涉及一种基于细胞外囊泡dna检测egfr-tki敏感突变的方法。
背景技术：
表皮生长因子受体egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。egfr锚定在细胞膜上，并通过络氨酸激酶(tyrosinekinase,tk)向下传导信号的作用。egfr在肿瘤的发生中起重要作用，针对egfr-tk的靶向抑制剂(egfr-tkinhibitor,egfr-tki)，阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、转移以及血管生成等，促进肿瘤细胞的凋亡。但是，并不是所有肿瘤细胞对egfr-tki都有反应，只有当egfr基因18-21外显子发生egfr-tki敏感突变时，egfr-tki才会发挥较好的肿瘤抑制作用，这类突变占整个东亚人群的～45％。当肿瘤细胞不携带egfr-tki敏感突变时，egfr-tki类药物的有效率将低至10％。因此，在临床实践中，检测egfr-tki敏感突变，对于治疗方案的选取具有重要意义。目前检测egfr-tki敏感突变的dna来源主要包括组织dna和外周血cfdna等。然而，这些dna来源样本存在较多不足之处。对于组织dna来说，虽然可以通过组织活检、或者手术得到较多的组织，并提取到足量的dna。但是，其缺点也非常明显，对于许多无法获得组织样本的患者而言，就无法获得足量dna进行检测。另外，由于癌症组织异质性的特点，即使得到癌症组织，也仍然存在较大可能得不到有效的目标dna。外周血cfdna虽然可以弥补癌症组织来源dna的不足，但是由于ctdna在cfdna中占比非常少，并且容易受到血液中其他物质的干扰，因此，在实际应用中存在灵敏度和特异性较低的情况。细胞外囊泡(extracellularvesicles,evs)具有磷脂双分子层结构，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体等。研究证实，evs可作为信使，通过血液、尿液、乳汁以及唾液等途径介导细胞间的信号的传导。虽然evs的形成机理仍然不是特别清楚，但是研究发现，evs携带各种蛋白、核酸，甚至全基因组的dna。所以，evs内容物在一定程度上反映了肿瘤的相关信息，针对肿瘤检测而言是一种潜在的肿瘤分子标志物，并且研究发现，肿瘤组织释放外泌体等evs的量远高于正常组织。因此，利用evs所含dna检测egfr-tki敏感突变具有较高实用价值。技术实现要素：为了克服现有检测dna样本来源的缺点，本发明的目的在于提供一种基于细胞外囊泡dna检测egfr-tki敏感突变的方法。本发明使用evs中所含有的dna，进行egfr-tki敏感突变检测，其能有效的获得足量的目标dna，进而对egfr-tki进行敏感突变检测，其检测灵敏度和特异性高。本发明的技术方案具体介绍如下。一种基于细胞外囊泡dna检测egfr-tki敏感突变的方法，具体步骤如下：(1)通过常规细胞外囊泡evs提取方法，对肿瘤患者体液中细胞外囊泡evs进行提取，得到细胞外囊泡evs；(2)通过表面活性剂的作用，使细胞外囊泡evs结构破坏，释放出dna，通过常规dna提取的方法，得到目标dna；(3)通过常用egfr-tki灵敏突变检测的方法进行检测。本发明中，步骤(1)中，常规细胞外囊泡evs提取方法包括超速离心法、peg沉淀法和成品试剂盒。本发明中，步骤(1)中，体液来源包括血液、尿液、胸水、乳汁、胆汁和唾液。本发明中，步骤(2)中，表面活性剂细胞为细胞裂解表面活性剂；其选自sds或tritonx-100中任一种，表面活性剂的浓度为0.1wt％-50wt％。本发明中，步骤(2)中，常规dna提取的方法包括酚氯仿法、磁珠法和成品试剂盒。本发明中，步骤(3)中，egfr-tki敏感突变检测方法包括pcr、一代测序和二代测序。和现有技术相比，本发明的有益效果在于：evs中直接携带了母本细胞的遗传物质，这些dna保存了非常完整的母本细胞的遗传信息，并且其中的dna长度较长，避免了cfdna非常短的缺点。另外evs是由活细胞主动分泌到外周血中的，因此直接反映了患者的实时生理状态，提高了检测的准确性，进而对egfr-tki进行敏感突变检测，其检测灵敏度和特异性高。具体实施方式下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细介绍。实施例1armspcr检测非小细胞肺癌患者血液evs-dna和cfdna的egfr-tki敏感突变检测，并进行对比，患者信息如表1所示。1、患者静脉取血5ml，30min内2600g离心15min，取上层血浆1ml。2、向1ml血浆中加入等体积15％peg(w/v)的nacl(1m)溶液。混合均匀后，4℃静置1h。3、静置后，4℃下3000g离心15min，弃去上清。4、向沉淀中加入200μl1％sds裂解液，56℃孵育30min。5、向孵育液中加入等体积饱和酚溶液，轻柔晃动5min。4℃下5000g离心15min。取上清。6、向上清中加入等体积氯仿，剧烈震动5min。4℃下5000g离心5min。取上清。7、加入3倍体积冻乙醇(-20℃)，混匀。8、11000转离心2min，小心弃去上清，加入30μlte缓冲液，得到evs-dna。9、取步骤1中分离的血浆1ml。10、加入1ml2％sds裂解液，56℃孵育30min。11、向孵育液中加入等体积饱和酚溶液，轻柔晃动5min。4℃下5000g离心15min。取上清。12、向上清中加入等体积氯仿，剧烈震动5min。4℃下5000g离心5min。取上清。13、加入3倍体积冻乙醇(-20℃)，混匀。14、11000转离心2min，小心弃去上清，加入30μlte缓冲液，得到cfdna。15、将提取得到的dna上样armspcr进行egfr-tki敏感突变检测，如表2所示，跟组织样本金标准对比，evs的灵敏度为25.7％，cfdna的灵敏度为14.2％，利用evs检测的效果较好。armspcr检测的位点包括19外显子缺失常见的10种突变(e746-a750del(ⅰ)；e746-t750deli；e746-t751dela；e746-s752delv；e746-a750del(ⅱ)；l747-t751del；l747-s752del；l747-a750delp；l747-p753dels；l747-t751delp)和21外显子l858r突变，涵盖整个egfr-tki敏感突变的90％。pcr反应体系如表3所示，10×buffer配置如表4所示。反应条件为：表1实验患者基本信息表2cfdna、evs-dna检出情况跟组织dna检出情况对比。表3一份pcr反应液原料加入量10×buffer2.5μl25mmmgcl23μltaq酶0.25μl模板2μl25mmdntps2.5μl上游引物0.25μl下游引物0.25μl探针0.25μlddh2o将总体积补至25μl表410×buffer(总体积1毫升)原料加入量1mtris100μl1mkcl500μltritonx-10010μlte390μl实施例2一代测序检测非小细胞肺癌患者血液evs-dna和cfdna的egfr-tki敏感突变检测，并进行对比。1、患者静脉取血5ml，30min内2600g离心15min，取上层血浆1ml。2、向1ml血浆中加入等体积15％peg(w/v)的nacl(1m)溶液。混合均匀后，4℃静置1h。3、静置后，4℃下3000g离心15min，弃去上清。4、向沉淀中加入200μl1％sds裂解液，56℃孵育30min。5、向孵育液中加入等体积饱和酚溶液，轻柔晃动5min。4℃下5000g离心15min。取上清。6、向上清中加入等体积氯仿，剧烈震动5min。4℃下5000g离心5min。取上清。7、加入3倍体积冻乙醇(-20℃)，混匀。8、11000转离心2min，小心弃去上清，加入30μlte缓冲液，得到evs-dna。9、取步骤1中分离的血浆1ml。10、加入1ml2％sds裂解液，56℃孵育30min。11、向孵育液中加入等体积饱和酚溶液，轻柔晃动5min。4℃下5000g离心15min。取上清。12、向上清中加入等体积氯仿，剧烈震动5min。4℃下5000g离心5min。取上清。13、加入3倍体积冻乙醇(-20℃)，混匀。14、11000转离心2min，小心弃去上清，加入30μlte缓冲液，得到cfdna。15、将提取得到的dna进行普通pcr扩增，扩增引物如表5所示，然后进行一代测序，进行egfr-tki敏感突变检测，检测的位点包括19外显子缺失常见的10种突变(e746-a750del(i)；e746-t750deli；e746-t751dela；e746-s752delv；e746-a750del(ii)；l747-t751del；l747-s752del；l747-a750delp；l747-p753dels；l747-t751delp)和21外显子l858r突变，对30个患者样本进行一代测序，跟组织样本金标准对比，evs的灵敏度为25％，特异性为88.9％，cfdna的灵敏度为8.3％，特异性为83.3％。利用evs-dna检测的效果较好。检测效果较好。表5普通pcr引物列表扩增位点上游引物下游引物19外显子cccagcaatatcagccttaggtggagatgagcagggtctagagl858ratgaacatgaccctgaattcgggctcacccagaatgtctggaga实施例3二代测序检测非小细胞肺癌患者血液evs-dna和cfdna的egfr-tki敏感突变检测，并进行对比。1、患者静脉取血10ml，30min内2600g离心15min，取上层血浆5ml。2、向5ml血浆中加入等体积15％peg(w/v)的nacl(1m)溶液。混合均匀后，4℃静置1h。3、静置后，4℃下3000g离心15min，弃去上清。4、向沉淀中加入200μl1％sds裂解液，56℃孵育30min。5、向孵育液中加入等体积饱和酚溶液，轻柔晃动5min。4℃下5000g离心15min。取上清。6、向上清中加入等体积氯仿，剧烈震动5min。4℃下5000g离心5min。取上清。7、加入3倍体积冻乙醇(-20℃)，混匀。8、11000转离心2min，小心弃去上清，加入30μlte缓冲液，得到evs-dna。9、患者静脉取血10ml，30min内2600g离心15min，取上层血浆5ml。10、加入5ml2％sds裂解液，56℃孵育30min。11、向孵育液中加入等体积饱和酚溶液，轻柔晃动5min。4℃下5000g离心15min。取上清。12、向上清中加入等体积氯仿，剧烈震动5min。4℃下5000g离心5min。取上清。13、加入3倍体积冻乙醇(-20℃)，混匀。14、11000转离心2min，小心弃去上清，加入30μlte缓冲液，得到cfdna。15、对5个患者样本进行egfr-tki敏感性二代测序。evs-dna测序得到两个l858r突变，一个e746-t750deli突变。cfdna检测到一个l858r突变。初步判断evs-dna二代测序效果较好。当前第1页12