亚丁基苯酞于多巴胺神经前驱细胞移植治疗的应用的制作方法

本发明关于使用亚丁基苯酞（bp）于细胞移植治疗的应用，尤其是关于亚丁基苯酞（bp）在多巴胺神经前驱细胞移植治疗的应用，包括使用亚丁基苯酞（bp）以提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益，以及于多巴胺神经前驱细胞移植治疗中并用亚丁基苯酞（bp）与经亚丁基苯酞（bp）处理过的多巴胺神经前驱细胞。前述应用尤其是关于使用亚丁基苯酞（bp）以提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗于治疗巴金森氏症的效益。

背景技术：

巴金森氏症（parkinson’sdisease）是一种常见的中枢神经退化性疾病，主要病因为多巴胺神经元细胞退化及／或死亡所导致的多巴胺分泌量下降，进而使患者失去运动控制的能力，因此，巴金森氏症的病征多为肢体动作上的障碍。目前临床上用以治疗巴金森氏症的药物（例如l-dopa）是通过增加体内多巴胺的含量来控制病情。然而，随着病情进展，当患者体内的多巴胺神经元死亡达到一定程度，l-dopa或更侵入性的刺激治疗方式所能提供的治疗效果则相当有限。

因此，业界及相关研究单位都持续致力于开发可有效治疗巴金森氏症的药物或方法。近年，多巴胺神经前驱细胞移植治疗为巴金森氏症病患带来治疗新契机。所谓“多巴胺神经前驱细胞移植治疗”，是通过将多巴胺神经前驱细胞移植到患者脑部，使多巴胺神经前驱细胞在患者脑部分化成多巴胺神经元，借此达到补充患者体内多巴胺神经元的数目以增加神经轴突生长（neuriteoutgrowth）的目的。然而，经发现，当多巴胺神经前驱细胞被以细胞团块的形式移植至患者脑部后，虽可分化成多巴胺神经元，但大部分的多巴胺神经元仍集中于细胞团块之中、无法移动到细胞团块外，故无法有效建立新的神经网络，所达到的治疗效果仍然有限。

针对上述问题，本申请发明人研究发现，在多巴胺神经前驱细胞分化成多巴胺神经元的过程中，于细胞培养环境中加入亚丁基苯酞（bp），可诱使多巴胺神经元移动、促进多巴胺神经元移动到细胞团块外、帮助快速建立神经连结。因此，亚丁基苯酞（bp）可用于多巴胺神经前驱细胞移植治疗中，以促进多巴胺神经前驱细胞在分化成多巴胺神经元后移动到细胞团块外、帮助快速建立神经连结，具有提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益的效果。

技术实现要素：

本发明的一个目的，在于提供一种提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益的方法，其包含使用一含有一活性成分的多巴胺神经前驱细胞培养液以处理该多巴胺神经前驱细胞，其中该活性成分是亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐。较佳地，该培养液中的活性成分的含量为以亚丁基苯酞（bp）计每毫升培养液0.5至20微克。举例言之，前述方法具有可提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗于治疗巴金森氏症的效益。

本发明的另一个目的，在于提供一种组合，其包含以下组成：（1）一条件培养液（conditionalmedium），包含一基础培养液以及一神经诱导因子；以及（2）亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐。较佳地，该神经诱导因子选自以下群组：纤维母细胞生长因子、转化生长因子抑制剂、肝醣合成酶激酶抑制剂、嘌吗啡胺（purmorphamine）及前述的组合，且其中，该纤维母细胞生长因子是纤维母细胞生长因子-2（fibroblastgrowthfactor-2，fgf-2）及纤维母细胞生长因子-8b（fibroblastgrowthfactor-8b，fgf-8b）的至少一种，该转化生长因子抑制剂是sb-431542，该肝醣合成酶激酶抑制剂是bio。更佳地，该神经诱导因子是纤维母细胞生长因子-8b（fgf-8b）及嘌吗啡胺（purmorphamine）。

本发明的再一个目的，在于提供一种使用一活性成分于制备一药剂的用途，其中该活性成分是亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐，且该药剂与经亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐处理过的多巴胺神经前驱细胞并用于细胞移植治疗中。其中，该处理以含有亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的多巴胺神经前驱细胞培养液进行，较佳地，该培养液中的亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的含量为以亚丁基苯酞（bp）计每毫升培养液0.5至20微克。较佳地，该药剂以选自以下群组的至少一种方式施用：口服投药、鼻腔投药、皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射及皮下注射；经处理过的该多巴胺神经前驱细胞以选自以下群组的至少一种方式施用：皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射及皮下注射。举例言之，该药剂与该经处理过的多巴胺神经前驱细胞并用于治疗巴金森氏症的细胞移植治疗中。

本发明的又一个目的，在于提供一种多巴胺神经前驱细胞移植治疗方法，其包含对一个有需要的个体投予一有效量的第一部分以及一有效量的第二部分，其中该第一部分包含亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐，该第二部分经亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐处理过的多巴胺神经前驱细胞。较佳地，该第一部分以选自以下群组的至少一种方式施用：口服投药、鼻腔投药、皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射及皮下注射；该第二部分以选自以下群组的至少一种方式施用：皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射及皮下注射。举例言之，本发明的多巴胺神经前驱细胞移植治疗方法可用于治疗巴金森氏症。

本发明的详细技术内容及部分具体实施方案，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域普通技术人员以此了解本发明的特征。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是显示以influx细胞分选仪侦测细胞表面的corin表现情形的结果图；

图2是显示以julitmbr细胞影像分析仪对未经亚丁基苯酞（bp）处理的多巴胺神经前驱细胞的分化过程进行连续拍摄的照片图；

图3是显示以倒立式显微镜观察各组细胞的照片图，其中，对照组是培养于不含亚丁基苯酞（bp）的条件培养液中6天的多巴胺神经前驱细胞，“bp（5）”组、“bp（10）”组、“bp（20）”组、“bp（50）”组、及“bp（100）”组则是分别培养于亚丁基苯酞（bp）浓度为5、10、20、50及100微莫耳浓度的条件培养液中6天的多巴胺神经前驱细胞；以及

图4是显示以正立荧光显微镜观察各组细胞的照片图，其中，对照组培养于不含亚丁基苯酞（bp）的条件培养液中10天的多巴胺神经前驱细胞，“bp（5）”组、“bp（10）”组、“bp（20）”组、“bp（50）”组、及“bp（100）”组则是分别培养于亚丁基苯酞（bp）浓度为5、10、20、50及100微莫耳浓度的条件培养液中10天的多巴胺神经前驱细胞，且其中，绿色荧光代表多巴胺神经前驱细胞，红色荧光代表多巴胺神经元，蓝色荧光则代表细胞核。

具体实施方式

以下将描述根据本发明的部分具体实施方案；但是，在不背离本发明精神下，本发明还可以多种不同形式的方案来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的内容。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中（尤其是在权利要求书中）所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“个体”是指人类或非人的哺乳动物。

本说明书中所使用的数值范围（例如5至100）应理解为也包含在该范围中的所有有理数以及在该范围中的任何有理数所组成的范围，因此，本说明书中所使用的数值范围包含介于所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合。

于本文中，所谓“医药可接受的盐”，包括“所述含有酸性官能基的化合物”与“有机或无机碱”所形成的“医药可接受碱加成盐”以及“所述含有碱性官能基的化合物”与“有机或无机酸”所形成的“医药可接受酸加成盐”。

其中，该与无机碱所形成的“医药可接受碱加成盐”的例子包括但不限于，碱金属盐（如钠盐、钾盐）、碱土金属盐（如钙盐、镁盐）、过渡金属盐（如铁盐、锌盐、铜盐、锰盐及铝盐）以及铵盐。

该与有机碱所形成的“医药可接受碱加成盐”的例子包括但不限于，与甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、异丙基胺、三丙基胺、三丁基胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺乙醇、2-二乙基胺乙醇、二环己基胺、离胺酸盐、精胺酸盐、组胺酸盐、咖啡碱、海巴胺（hydrabamine）、胆碱、甜菜碱、乙烯二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌啶、n-乙基哌啶、四甲基铵化合物、四乙基铵化合物、吡啶、n,n-二甲基苯胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗啉、二环己基胺、二苯甲基胺、n,n-二苯甲基苯乙基胺、1-伊芬胺（1-ephenamine）、n,n-二苯甲基乙烯二胺、聚胺树脂及其类似物等所形成的盐。

该与无机酸所形成的“医药可接受酸加成盐”的例子包括但不限于，与氢溴酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、过氯酸等所形成的盐。

该与有机酸所形成的“医药可接受酸加成盐”的例子包括但不限于，与磺酸（如对甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、萘磺酸）、羧酸（如乙酸、丙酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、琥珀酸）、阴离子胺基酸（如谷胺酸、天门冬胺酸）、羟基酸（如柠檬酸、乳酸、酒石酸、乙醇酸、苹果酸）、脂肪酸（如己酸、辛酸、癸酸、油酸、硬脂酸）、双羟萘酸、树脂酸等所形成的盐。

于本文中，所谓“以亚丁基苯酞（bp）计”，指当以bp的医药上可接受的盐作为活性成分时，以该bp的医药上可接受的盐所能提供的bp的量为基准来返算得到的该盐用量。

如上述，巴金森氏症主要病因为多巴胺神经元细胞退化及／或死亡所导致的多巴胺分泌量下降，进而使患者失去运动控制的能力，而多巴胺神经前驱细胞移植治疗已为巴金森氏症病患带来治疗新契机。目前，用于细胞移植治疗的多巴胺神经前驱细胞则多由诱导胚胎干细胞分化而来；举例言之，以一基础培养液对胚胎干细胞进行培养，并于该培养液中加入纤维母细胞生长因子（例如fgf-2、fgf-8b）、转化生长因子抑制剂（例如sb-431542）、肝醣合成酶激酶抑制剂（例如bio）、及／或嘌吗啡胺（purmorphamine）等神经诱导因子，可诱使胚胎干细胞分化成多巴胺神经前驱细胞。

然而，当多巴胺神经前驱细胞被以细胞团块的形式移植至患者脑部后，虽可分化成多巴胺神经元，但大部分的多巴胺神经元仍集中于细胞团块之中、无法移动到细胞团块外，故无法有效建立新的神经网络，治疗效果有限。前述可参见例如humanipscell-deriveddopaminergicneuronsfunctioninaprimateparkinson'sdiseasemodel.nature548,592-596(2017)及predictivemarkersguidedifferentiationtoimprovegraftoutcomeinclinicaltranslationofhesc-basedtherapyforparkinson'sdisease.cellstemcell20,135-148,(2017)，该文献的全文并于此处以供参考。

本申请发明人研究发现，在多巴胺神经前驱细胞分化成多巴胺神经元的过程中，于细胞培养环境中加入亚丁基苯酞（bp），可诱使多巴胺神经元移动、促进多巴胺神经元移动到细胞团块外、帮助快速建立神经连结。从而，可使用亚丁基苯酞（bp）于多巴胺神经前驱细胞移植治疗中，以促进多巴胺神经前驱细胞在分化成多巴胺神经元后移动到细胞团块外、帮助快速建立神经连结，具有提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益的效果。

因此，本发明关于亚丁基苯酞（bp）于提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益及应用，尤其是提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗于治疗巴金森氏症的效益，包括提供提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益的方法及组合。其中，该方法包含使用一含有亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的多巴胺神经前驱细胞培养液以处理该多巴胺神经前驱细胞，该组合包含（1）一含有基础培养液及神经诱导因子的条件培养液、以及（2）亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐。

于本发明的提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益的方法中，所谓“使用一含有亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的多巴胺神经前驱细胞培养液以处理该多巴胺神经前驱细胞”是指于进行该处理时，多巴胺神经前驱细胞存在于多巴胺神经前驱细胞培养液中。此外，于根据本发明方法所使用的多巴胺神经前驱细胞培养液包含一基础培养液以及神经诱导因子，其中该基础培养液可提供多巴胺神经前驱细胞生长所需养分与条件（如酸碱值等）的必要成分。一般而言，可采用的基础培养液的例子包括但不限于，添加有n2补充剂（n2supplement）的dmem/f12培养液（dulbecco'smodifiedeaglemedium:nutrientmixturef-12）及添加有n2补充剂的神经基础培养液（neuralbasalmedium）。举例言的，可使用添加有n2补充剂的dmem/f12培养液作为基础培养液，以进行多巴胺神经前驱细胞的处理。

该用以处理多巴胺神经前驱细胞的培养液中的亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的含量，通常为以亚丁基苯酞（bp）计每毫升培养液0.5至20微克；较佳为以亚丁基苯酞（bp）计每毫升培养液2至15微克；更佳为以亚丁基苯酞（bp）计每毫升培养液3至12微克。举例言之，如后附实施例所示，当以每毫升培养液使用0.9至19微克的亚丁基苯酞（bp）时（相当于使用5至100微莫耳浓度的亚丁基苯酞（bp）），可有效地诱使多巴胺神经元移动、促进多巴胺神经元移动到细胞团块外。

根据本发明所提供的组合，包含以下组成：（1）一条件培养液（conditionalmedium），包含一基础培养液以及一神经诱导因子；以及（2）亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐。于该组合中，有关基础培养液的选用、以及亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的用量范围，均如上述的说明。

除基础培养液以外，根据本发明所提供的组合的组成（1）条件培养液可还含有任何可以帮助诱导干细胞分化成多巴胺神经前驱细胞的神经诱导因子，例如，纤维母细胞生长因子、转化生长因子抑制剂、肝醣合成酶激酶抑制剂、嘌吗啡胺（purmorphamine）及前述的组合，但不以此为限。较佳地，该纤维母细胞生长因子是纤维母细胞生长因子-2（fibroblastgrowthfactor-2，fgf-2）及纤维母细胞生长因子-8b（fibroblastgrowthfactor-8b，fgf-8b）的至少一种，该转化生长因子抑制剂是sb-431542，该肝醣合成酶激酶抑制剂是bio。更佳地，该神经诱导因子是纤维母细胞生长因子-8b（fgf-8b）及嘌吗啡胺（purmorphamine）。

于根据本发明所提供的组合可以是一套组或一组合物。当根据本发明所提供的组合是一套组，该组成（1）条件培养液与组成（2）亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐通常分开包装、各自储存于不同的容纳空间（例如塑料袋、塑料瓶、玻璃瓶、安瓿（ampoule））中，且可各自分开运送或销售，也可组合成套一起配送与销售。此外，该组成（1）条件培养液的子成分也可分开包装、各自储存。该套组可另外包含一使用说明书，以利使用者在使用时，可根据其中所拟定的程序与流程，于现场才混合各成分以进行细胞培养、处理及施用。

举例言之，当根据本发明所提供的套组中的组成（1）条件培养液的子成分、及组成（2）亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐分开包装、各自储存于不同的容纳空间，且各自分开运送或销售时，可将神经诱导因子（例如fgf-2、fgf-8b、sb-431542及bio等）、以及亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐置于-20°c以下的环境下避光保存；将基础培养液置于-20°c的环境下保存。又例如，当本发明套组的各成分组合成套以配送与销售时，可以一内部呈-20°c的避光容器来盛装前述神经诱导因子、亚丁基苯酞（bp），并以一内部呈-20°c的容器来盛装基础培养液。各容器的形状、大小并无特殊限制，只要各容器的容纳空间具有与外部的温度隔绝的功能，使各成分于一起配送与销售时不会互相影响保存温度即可。

在使用根据本发明的套组时，各成分的调配混合顺序并无特殊限制。当条件培养液的子成分分开包装时，例如可先调配好条件培养液，再与亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐混合；也可先将亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐与基础培养液混合，再与其他子成分混合；或者，可将条件培养液的各子成分与亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐同时混合。此外，可直接混合亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐与条件培养液或基础培养液；或者，可先将亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐溶解于一溶剂中以提供一亚丁基苯酞（bp）溶液，之后再将该亚丁基苯酞（bp）溶液与条件培养液或基础培养液混合。其中，可用于溶解亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的溶剂的例子包括但不限于，二甲基亚砜（dmso）、乙醇及植物性油。

当根据本发明所提供的组合是一组合物，则该组成（1）条件培养液与组成（2）亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐通常经混合而储存于相同的容纳空间（例如塑料袋、塑料瓶、玻璃瓶、安瓿（ampoule））中。

根据本发明，将本发明所提供的组合使用于多巴胺神经前驱细胞移植治疗，可诱使多巴胺神经元移动、促进多巴胺神经元移动到细胞团块外、帮助快速建立神经连结，从而达到提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益的效果。举例言之，但不以此为限，当使用本发明的组合于多巴胺神经前驱细胞移植治疗中时，可先使用一包含基础培养液、以及fgf-2、fgf-8b、sb-431542、bio、purmorphamine等神经诱导因子的条件培养液培养一干细胞，以诱导该干细胞分化成多巴胺神经前驱细胞；接着，再将前述条件培养液置换成一包含基础培养液与亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的条件培养液，继续培养该多巴胺神经前驱细胞8至12天；最后再将所获得的多巴胺神经前驱细胞移植至有需要的个体中。

于根据本发明的使用亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐于制备一药剂的用途中，该药剂与经亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐处理过的多巴胺神经前驱细胞并用于细胞移植治疗中。其中，该处理以含有亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的多巴胺神经前驱细胞培养液进行，且该培养液中的亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐的含量通常为以亚丁基苯酞（bp）计每毫升培养液0.5至20微克；较佳为以亚丁基苯酞（bp）计每毫升培养液2至15微克；更佳为以亚丁基苯酞（bp）计每毫升培养液3至12微克。

根据本发明所提供的药剂可呈任何合宜的形式，并无特殊限制，只根据所需要的用途而呈对应的适宜剂型。举例言之，但不以此为限，该药剂可以口服或非经口服（例如：鼻腔投予、皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射、及皮下注射）的投药方式施用至个体上。根据使用形式及用途而定，可选用适宜的载剂以提供该药剂，其中该载剂包括赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂等。

以适于口服的剂型为例，可于根据本发明所提供的药剂中含有任何不会不利影响活性成分（即，亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐）的所欲效益的医药上可接受的载剂，例如：水、食盐水、葡萄糖（dextrose）、甘油、乙醇或其类似物、纤维素、淀粉、糖膨润土（sugarbentonite）及前述的组合。可利用任何适宜的方法，将该药剂以适于口服投药的剂型提供，例如：锭剂（例如糖衣锭）、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、酊剂等。

至于适于皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射、或皮下注射的针剂或点滴剂，则可于根据本发明所提供的药剂中含有一或多种例如等张溶液、盐类缓冲液（如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液）、增溶剂、乳化剂、5%糖溶液以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂或干粉悬液注射剂等剂型提供该药剂。或者，将该药剂制备成一注射前固体，以可溶于其他溶液或悬浮液中的剂型或可乳化的剂型提供该注射前固体，并于投予至该有需要的个体前将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，提供所需要的注射剂。

根据需要地，可于根据本发明所提供的药剂中另外含有适宜用量的添加剂，例如可提高该药剂于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该药剂的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。此外，该药剂可根据需要另外含一种或多种其他活性成分，或者与含该一种或多种其他活性成分的药物并用，以进一步加强该药剂的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分（即，亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐）的效益没有不利的影响即可。

于根据本发明的用途中，除了施用本发明所提供的药剂外，也须对该有需要的个体投予经亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐处理过的多巴胺神经前驱细胞，该经处理过的多巴胺神经前驱细胞的投予可与该药剂的投予同时或分别进行。其中，该经处理过的多巴胺神经前驱细胞的施用方式并无特殊限制，只根据所需要的用途而呈对应的适宜剂型。举例言之，但不以此为限，该经处理过的多巴胺神经前驱细胞可以呈针剂、细胞输注剂等剂型，且可通过皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射、皮下注射等投药方式施用至个体上。当该经处理过的多巴胺神经前驱细胞呈针剂、细胞输注剂等剂型时，可于这些剂型中另外含一种或多种医药上可接受的载剂，例如：生理食盐水。

此外，于根据本发明的用途中，该药剂以及该经亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐处理过的多巴胺神经前驱细胞可分别以一日一次、一日多次、数日一次或数周一次等不同频率施用，只根据投予个体的需求、年龄、体重及健康状况而异。于该药剂中，可根据实际应用需求，调整本发明活性成分（即，亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐）于药剂中的含量。举例言之，当以每日口服两次的方式施用该药剂，并以每两周脑内注射一次的方式将经亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐处理过的多巴胺神经前驱细胞投予至一个体以治疗巴金森氏症及／或延缓其发病时，该药剂的用量，以亚丁基苯酞（bp）计，通常为每次30毫克／公斤体重至2,000毫克／公斤体重，较佳为每次50毫克／公斤体重至1,000毫克／公斤体重，更佳为每次100毫克／公斤体重至500毫克／公斤体重，其中，该单位“毫克／公斤体重”指每公斤体重个体所须的投药量。此外，所采用的多巴胺神经前驱细胞的用量，通常为每次1x10⁵个至5x10⁶个多巴胺神经前驱细胞，较佳为每次1x10⁶个至2x10⁶个多巴胺神经前驱细胞。

本发明另外关于一种多巴胺神经前驱细胞移植治疗方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的第一部分以及一有效量的第二部分，其中该第一部分包含亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐，该第二部分经亚丁基苯酞（bp）及／或其医药上可接受的盐处理过的多巴胺神经前驱细胞。前述该有需要的个体是指，多巴胺神经元退化、多巴胺神经元退化死亡及／或多巴胺分泌量不足的个体。其中，有关该第一部分及第二部分的用量范围及使用条件，如上述用途的说明。

现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围如权利要求书所示。

实施例

制备实施例]

a.条件培养液的制备

a-1.以添加有n2补充剂（n2supplement；购自gibco公司，产品编号：17502048）的dmem/f12培养液（dulbecco'smodifiedeaglemedium/nutrientmixturef-12；购自gibco公司，产品编号：11320033）作为基础培养液，于其中进一步添加bio（购自sigma-aldrich公司，产品编号：b1686）、sb-431542（购自sigma-aldrich公司，产品编号：s4317）、fgf-2（购自peprotech公司，产品编号：100-18b）、purmorphamine（购自caymanchemical公司，产品编号：10009634）、及fgf-8b（购自r&dsystem公司，产品编号：423-f8）等神经诱导因子，使前述这些神经诱导因子于基础培养液中的最终浓度分别为bio（0.5微莫耳浓度（µm））、sb-431542（10微莫耳浓度）、fgf-2（10奈克／毫升（ng/ml））、purmorphamine（1微莫耳浓度）及fgf-8b（50奈克／毫升），以提供一条件培养液。

比照[制备实施例a-1]制备，但仅于基础培养液中进一步添加purmorphamine及fgf-8b，并使前述这些神经诱导因子于基础培养液中的最终浓度分别purmorphamine（1微莫耳浓度）及fgf-8b（50奈克／毫升），以提供另一条件培养液。

多巴胺神经前驱细胞的制备

b-1.胚胎干细胞的前培养

将胚胎干细胞（由台灣茂盛医院提供）培养于含有20%血清替代物（knockoutserumreplacement，ksr；购自gibco公司，产品编号：10828028）的dmem/f12培养液中，历时2天，以使细胞成为悬浮球状。

胚胎干细胞的分化

将[制备实施例b-1]所提供的悬浮球状胚胎干细胞培养于[制备实施例a-1]所提供的条件培养液中，历时2天。接着，移除培养液，再以[制备实施例a-2]所提供的条件培养液继续培养6天，以获得一细胞液。

已知corin为神经管中脑腹侧的专一性表面蛋白，因此，于上述所获得的细胞液中加入corin抗体（购自r&dsystem公司，产品编号：mab2209），作用15分钟后，以pbs清洗细胞一次，接着加入带有荧光的二级抗体（购自invitrogen公司，产品编号：a21208），作用15分钟后，以pbs清洗细胞一次，最后，再用pbs将细胞悬浮。以influx细胞分选仪（购自bd公司）对前述细胞悬浮液进行荧光侦测（如图1所示，共有39.6%的细胞表现corin）并分选出带有荧光讯号的细胞，即为神经管中脑腹侧的多巴胺神经前驱细胞。

多巴胺神经前驱细胞的处理

于37℃、5%二氧化碳下，将[制备实施例b-2]所提供的多巴胺神经前驱细胞培养于[制备实施例a-2]所提供的条件培养液中，历时24小时，接着，将细胞分成六组，并进行以下处理：

（1）对照组：将细胞继续培养于[制备实施例a-2]所提供的条件培养液中（即，将细胞培养于不含亚丁基苯酞（bp）的培养液中），历时10天。

（2）“bp（5）”组、“bp（10）”组、“bp（20）”组、“bp（50）”组、及“bp（100）”组：比照对照组的条件进行，但进一步于各组培养液中添加亚丁基苯酞（bp）（购自sigma-aldrich公司，产品编号：w333301），使亚丁基苯酞（bp）于各组培养液中的最终浓度分别为5、10、20、50及100微莫耳浓度。

实施例1：亚丁基苯酞（bp）对于多巴胺神经前驱细胞的分化能力的影响

为了解亚丁基苯酞（bp）对多巴胺神经前驱细胞分化为多巴胺神经元的影响，以juli^tmbr细胞影像分析仪（购自nanoentek公司）对[制备实施例c]的对照组细胞的分化过程进行连续拍摄（结果示于图2），并于将[制备实施例c]的各组细胞培养至第6天时，使用倒立式显微镜（购自nikon公司）拍照并记录各组细胞的型态（结果示于图3）。

如图2所示，对照组细胞（即，未经亚丁基苯酞（bp）处理的多巴胺神经前驱细胞）于培养至第5天时，可观察到神经分化的现象，培养至第10天时，则可观察到细胞已分化为具有神经轴突型态的多巴胺神经元。此外，如图3所示，对照组、“bp（5）”组、“bp（10）”组、“bp（20）”组、“bp（50）”组、及“bp（100）”组，都能观察到神经纤维的形成。前述这些结果显示，亚丁基苯酞（bp）处理并不会对多巴胺神经前驱细胞的正常神经分化造成影响。

实施例2：亚丁基苯酞（bp）于促进多巴胺神经元移动的效果

为了解亚丁基苯酞（bp）对于多巴胺神经元的影响，将[制备实施例c]的各组细胞于培养至第10天时进行固定，并以sox-1（购自santacruz公司，产品编号：sc-17318）、th（tyrosinehydroxylase；购自millipore公司，产品编号：mab152）及dapi（diamidino-2-phenylindole；购自thermofisherscientific公司，产品编号：d1306）等抗体对各组细胞分别进行荧光染色（其中，sox-1表现于多巴胺神经前驱细胞，th表现于多巴胺神经元，dapi为细胞核染剂），最后，再以正立荧光显微镜（购自nikon公司）观察多巴胺神经前驱细胞（绿色荧光）、多巴胺神经元（红色荧光）及细胞核（蓝色荧光）。结果分别示于图4。

如图4所示，相较于对照组，“bp（5）”组、“bp（10）”组、“bp（20）”组、“bp（50）”组、及“bp（100）”组都能观察到多巴胺神经元移动到细胞团块外的情形，其中又以“bp（50）”组的多巴胺神经元移动的情形最为显著。前述结果显示，亚丁基苯酞（bp）确实可有效诱使多巴胺神经元移动，故可用于多巴胺神经前驱细胞移植治疗中，以促进多巴胺神经前驱细胞在分化成多巴胺神经元后移动到细胞团块外、帮助快速建立神经连结，具有提升多巴胺神经前驱细胞移植治疗的治疗效益的效果。