全反式维甲酸在间充质干细胞分化调节中的应用的制作方法

本申请涉及间充质干细胞领域，具体涉及一种全反式维甲酸在间充质干细胞分化调节中的应用。
背景技术：
：间充质干细胞是一类异质性很高的基质干细胞类群。目前采用了一套公认的表面标记分子来定义间充质干细胞，人源的间充质细胞不表达造血细胞相关的分子如cd45、cd34、cd14及共刺激分子cd80、cd86等，主要表达cd44、cd90、cd73和cd71等表面分子。而鼠源的间充质干细胞同样也不表达造血相关的分子如cd45、ter119及内皮细胞相关分子cd31等，主要表达pdgfrα、sca-1及cd44等表面分子。虽然已经用了大量的表面分子来定义间充质干细胞，但是这些表面分子定义的间充质干细胞仍然是一群异质性很高的细胞类群，并不是单一的细胞类群。间充质干细胞最早从骨髓分离出来，体外培养时可以形成纺锤形并具有克隆形成能力的单核细胞。间充质干细胞在体外培养时不仅可以作为造血干细胞的支持细胞，还具有多种的分化潜能，可以分化为成骨细胞，脂肪细胞以及软骨细胞。除了体外功能，大量的研究表明间充质干细胞在体内同样是造血干细胞微环境中的重要组成部分，还在多种组织损伤修复中发挥了重要的调节作用以及修复作用。除了这两方面的功能，间充质干细胞还被报道具有显著的免疫调节功能。在多种急性炎症模型或者自身免疫疾病模型中，体内输注的间充质干细胞可以迁移至炎症区域，通过分泌多种免疫调节因子发挥相应的免疫调节功能，并且促进损伤细胞的存活。间充质干细胞具有多种分化潜能，体外培养的间充质干细胞在特定的培养条件下可以定向分化为成骨细胞、脂肪细胞以及软骨细胞。此外利用谱系追踪的方法在体内也证明间充质干细胞可以分化为成骨细胞、脂肪细胞以及软骨细胞。并且间充质干细胞在多种病理生理条件下参与组织损伤修复。鉴于间充质干细胞分化功能的重要性，深入的研究间充质干细胞分化功能的调节机制显得尤为必要。技术实现要素：本申请的目的提供一种全反式维甲酸在间充质干细胞分化调节中的新的应用。为了实现上述目的，本申请采用了一下技术方案：本申请的一方面公开了全反式维甲酸在间充质干细胞分化调节中的应用，该应用包括采用全反式维甲酸同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化。需要说明的是，目前绝大部分研究认为，间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化是相互拮抗的过程，也就是说，间充质干细胞向成骨细胞分化增强会伴随着向脂肪细胞分化减弱。但是，本申请研究发现全反式维甲酸能够同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化，从而提出了全反式维甲酸的新的应用功能。本申请的另一面公开了全反式维甲酸在制备同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的试剂中的应用。可以理解，由于本申请研究发现了全反式维甲酸能够同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化，因此，可以将全反式维甲酸制成相应的同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的试剂。本申请的再一面公开了一种同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的试剂，该试剂中含有全反式维甲酸。优选的，本申请同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的试剂中，全反式维甲酸的浓度为100nmol/l-10μmol/l。本申请的同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的试剂中，全反式维甲酸的浓度是其试剂储存浓度，在该浓度下既可以有效的储存，又能够满足大部分的使用需求。可以理解，本申请的试剂的具体用量，可以根据具体所需要的全反式维甲酸工作浓度而定，例如本申请的一种实现方式中其工作浓度为1μmol/l。本申请的再一面公开了一种间充质干细胞的培养方法，包括在培养基中添加全反式维甲酸，使其同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化。优选的，本申请的培养方法中，全反式维甲酸在培养基中的工作浓度为100nmol/l-10μmol/l。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请经过研究证实全反式维甲酸能够同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化，本申请基于此提供了全反式维甲酸的新的功能用途，这为间充质干细胞的分化调节研究，以及定向调控间充质干细胞分化潜能，提供了一种新的工具和调节手段。附图说明图1为本申请实施例中小鼠腹腔注射后流式分析小鼠骨髓间充质干细胞的结果图；图2为本申请实施例中实时荧光定量pcr检测的pdgfrα基因、pdgfrα+cd51基因的表达量结果图；图3为本申请实施例中全反式维甲酸抑制小鼠骨髓间充质干细胞克隆形成的苏木素染色结果观察图；图4为本申请实施例中处理后形成的小鼠骨髓间充质干细胞克隆的统计结果图；图5为本申请实施例中全反式维甲酸对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化潜能影响的茜素红染色结果图；图6为本申请实施例中成骨分化潜能影响的实时荧光定量pcr检测runx2基因表达量结果图；图7为本申请实施例中成骨分化潜能影响的实时荧光定量pcr检测col1α1基因表达量结果图；图8为本申请实施例中全反式维甲酸对小鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化潜能影响的油红染色结果图；图9为本申请实施例中成脂分化潜能影响的实时荧光定量pcr检测fabp4基因表达量结果图；图10为本申请实施例中成脂分化潜能影响的实时荧光定量pcr检测cebpα基因表达量结果图。具体实施方式全反式维甲酸(atra)是维生素a的代谢产物，临床上主要用于治疗早幼粒性白血病。本申请研究发现全反式维甲酸可以显著的抑制间充质干细胞的分化潜能，尤其是能够同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化，因此，全反式维甲酸处理间充质干细胞可以形成一种新的定向调控间充质干细胞分化潜能的调节手段。基于以上研究发现，本申请提供了全反式维甲酸在间充质干细胞分化调节中的应用，该应用包括采用全反式维甲酸同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化。下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。除非特别说明，以下实施例中采用的仪器、材料都是实验室常规使用的器材。实施例一、试验方法1.全反式维甲酸调控小鼠骨髓间充质干细胞数量的试验本例采用市购的健康c57bl/6小鼠进行腹腔注射试验，并通过流式分析检测试验后的小鼠骨髓间充质干细胞的数量。具体如下：将c57bl/6小鼠平均分为三组，每组8只小鼠。第一组为试验组，小鼠腹腔注射全反式维甲酸，每隔一天注射一次，注射的剂量为100μl浓度为10μmol/l的全反式维甲酸溶液。注射7次后处死小鼠，流式分析小鼠骨髓间充质干细胞的数目和比例。其中，全反式维甲酸溶液由全反式维甲酸粉末溶于有机溶剂dmso(二甲基亚砜)中而制成溶液。第二组为pbs对照组，小鼠腹腔注射等量的pbs溶液，注射剂量和方法与第一组相同。同样的，注射7次后处死小鼠，流式分析小鼠骨髓间充质干细胞的数目和比例。第三组为dmso对照组，即只注射溶剂的对照试验，具体的，小鼠腹腔注射等量的dmso溶液，注射剂量和方法与第一组相同。同样的，注射7次后处死小鼠，流式分析小鼠骨髓间充质干细胞的数目和比例。本例分别采用流式细胞仪统计分析了各组pdgfrα+以及pdgfrα+cd51+的细胞占所有骨髓细胞的比例。2.全反式维甲酸抑制小鼠骨髓间充质干细胞克隆形成潜能的试验用酶解法分离的骨髓单细胞悬液计数后，按照104cells/cm2接种于6孔板，用含有10μmol/l的y-27632(rockinhibitor)的低糖dmem完全培养基(20％fbs、％1ps)进行培养，7天后进行克隆计数，检测间充质干细胞克隆出形成能力。在间充质干细胞克隆形成过程中，分别采用pbs、dmso以及1μmol/l浓度的全反式维甲酸处理体外培养的间充质干细胞，每三天更换一次培养基并加入新的全反式维甲酸。待培养7天后进行苏木素染色并进行计数。即将骨髓单细胞悬液分为相同的三组，一组的低糖dmem完全培养基中添加1μmol/l浓度的全反式维甲酸，另一组添加等量的pbs，另一组添加等量的dmso。检测全反式维甲酸对小鼠骨髓间充质干细胞克隆形成潜能的影响。3.全反式维甲酸抑制小鼠骨髓间充质干细胞体外分化潜能的试验酶解法分离的小鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养，待细胞聚合度至70-90％，分别进行成骨和成脂分化。成骨分化培养基为含有10％胎牛血清、1×双抗、1×丙酮酸钠、50μg/ml的抗坏血酸、10mm的β磷酸甘油以及10nm的地塞梅松的memα-basic培养基，每三天更换一次成骨分化培养基，一共分化两周，在分化过程中分别用pbs、dmso以及1μmol/l浓度的全反式维甲酸进行处理，每次更换分化培养基后均加入pbs、dmso或全反式维甲酸进行处理。两周后通过茜素红染色以及定量pcr检测间充质干细胞成骨分化情况。即将小鼠骨髓间充质干细胞分为相同的三组，一组的成骨分化培养基中添加1μmol/l浓度的全反式维甲酸，另一组添加等量的pbs，另一组添加等量的dmso。检测全反式维甲酸对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化潜能的影响。与此同时，采用实时荧光定量pcr方法，检测成骨分化基因runx2和col1α1的表达量，本例分别检测了处理0天和处理14天后的runx2和col1α1基因表达量，对比分析全反式维甲酸处理对成骨分化基因表达量的影响，即对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化潜能的影响。本例首先采用trizol及氯仿抽提的方法提取细胞的rna，检测浓度后进行反转录，以actin作为内参对runx2及col1α1的表达进行荧光定量pcr检测。成脂分化培养基为含有10％胎牛血清、1×双抗、1×丙酮酸钠、0.5μm异丁基甲基黄嘌呤、60μm的吲哚美希、5μg/μl的胰岛素以及10μm的胰岛素的memα培养基，每三天更换一次分化培养基，一共分化7天，在分化过程中分别用pbs、dmso以及1μmol/l浓度的全反式维甲酸进行处理，每次更换分化培养基后均加入全反式维甲酸进行处理。一周后通过油红染色以及定量pcr检测间充质干细胞成脂分化情况。即将小鼠骨髓间充质干细胞分为相同的三组，一组的成脂分化培养基中添加1μmol/l浓度的全反式维甲酸，另一组添加等量的pbs，另一组添加等量的dmso。检测全反式维甲酸对小鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化潜能的影响。与此同时，采用实时荧光定量pcr方法，检测成脂分化基因fabp4和cebpα的表达量，本例分别检测了处理0天和处理4天后的fabp4和cebpα基因表达量，对比分析全反式维甲酸处理对成脂分化基因表达量的影响，即对小鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化潜能的影响。本例首先采用trizol及氯仿抽提的方法提取细胞的rna，检测浓度后进行反转录，以actin作为内参对fabp4及cebpα的表达进行荧光定量pcr检测。4.实时荧光定量pcr本例分别针对成骨分化基因runx2和col1α1，和成脂分化基因fabp4和cebpα，设计并合成了特异性检测引物，引物序列如表1所示。表1成骨分化基因和成脂分化基因特异性检测引物引物名称序列(3’→5’)seqidno.runx2ftccttttgggcatcatcttcc1runx2rtttgtagtggatcgtgcctcg2col1α1factggtagtctgcaaaaccaaa3col1α1ragagccccatctgtcctctc4fabp4faaggtgaagagcatcataaccct5fabp4rtcacgcctttcataacacattcc6cebpαfcaagaacagcaacgagtaccg7cebpαrgtcactggtcaactccagcac8表1中，“f”表示上游引物，“r”表示下游引物，“runx2f”和“runx2r”分别表示runx2基因的上游引物和下游引物，其余类似。抽提细胞rna：用500μl的trizol充分裂解细胞后，加入100μl氯仿剧烈震荡，待充分分层后，于冷离心机中最大转速离心15分钟，取上清，向上清中加入等量的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，最大转速离心10分钟，弃上清，用depc水稀释的70％乙醇洗涤后充分晾干，用depc水溶解rna。逆转录：用takara(rr036a)逆转录试剂盒进行反转录，反转录250ngrna，双蒸水稀释至100μl进行后续定量pcr。荧光定量pcr：采用翊圣2×sybr及bioradcfx96touch荧光定量pcr仪进行定量pcr实验。pcr反应体系：4.8μl逆转录模板、0.2μl上下游引物混合物、5μl2×sybrmix；其中，上下游引物混合物中上游引物和下游引物的浓度均为10mmol/l。pcr反应程序：95℃预变性1min，然后进入40个循环：95℃5s、60℃30s，并于60℃收集荧光，循环结束后，95℃15s、60℃15s、95℃15s。二、试验结果1.全反式维甲酸对小鼠骨髓间充质干细胞数量和克隆形成的影响小鼠腹腔注射全反式维甲酸及其对照试验的结果如图1和图2所示，图1是流式细胞仪的散点图，其中，pbs表示pbs对照组，dmso表示dmso对照组，atra表示全反式维甲酸试验组；图2实时荧光定量pcr分析的pdgfrα基因表达量，以及pdgfrα和cd51基因的表达量，图中，横坐标“pdgfrα”即pdgfrα基因表达量分析结果，“pdgfrα+cd51”即pdgfrα和cd51基因表达量分析结果，pbs表示pbs对照组，dmso表示dmso对照组，atra表示全反式维甲酸试验组。图1和图2的结果显示，全反式维甲酸处理小鼠后小鼠骨髓间充质干细胞的比例和数目显著减少。全反式维甲酸抑制小鼠骨髓间充质干细胞克隆形成潜能的试验结果如图3和图4所示，图3和图4中，pbs表示pbs对照组，dmso表示dmso对照组，atra表示全反式维甲酸试验组；图3是苏木素染色后的观察结果图，图4是计数结果统计图。图3和图4的结果显示，在体外克隆形成过程中，全反式维甲酸处理后小鼠骨髓间充质干细胞的克隆形成能力显著被抑制。图1至图4的结果显示，全反式维甲酸处理小鼠能够降低骨髓间充质干细胞的数量，并抑制间充质干细胞的克隆形成能力。2.全反式维甲酸抑制小鼠骨髓间充质干细胞体外分化潜能试验结果全反式维甲酸对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化潜能影响的茜素红染色结果如图5所示，图中，pbs表示pbs对照组，dmso表示dmso对照组，atra表示全反式维甲酸试验组。图5的结果显示，全反式维甲酸试验组的成骨分化细胞数量明显减少，说明全反式维甲酸处理能够抑制间充质干细胞体外成骨分化。成骨分化潜能影响的实时荧光定量pcr检测runx2基因表达量结果如图6所示，图中，横坐标“day0”表示处理0天时，pbs对照组、dmso对照组和atra试验组的runx2基因表达量，“day14”表示处理14天后，pbs对照组、dmso对照组和atra试验组的runx2基因表达量。图6的结果显示，在处理0天时，三组的runx2基因表达量没有显著差异；处理14天后，全反式维甲酸试验组的runx2基因表达量明显低于其它两个对照组，说明全反式维甲酸处理能够抑制成骨分化基因runx2的表达。成骨分化潜能影响的实时荧光定量pcr检测col1α1基因表达量结果如图7所示，图中，横坐标“day0”表示处理0天时，pbs对照组、dmso对照组和atra试验组的col1α1基因表达量，“day14”表示处理14天后，pbs对照组、dmso对照组和atra试验组的col1α1基因表达量。图7的结果显示，在处理0天时，三组的col1α1基因表达量没有显著差异；处理14天后，全反式维甲酸试验组的col1α1基因表达量明显低于其它两个对照组，说明全反式维甲酸处理能够抑制成骨分化基因col1α1的表达。全反式维甲酸对小鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化潜能影响的油红染色结果如图8所示，图中，pbs表示pbs对照组，dmso表示dmso对照组，atra表示全反式维甲酸试验组。图8的结果显示，全反式维甲酸试验组的成脂分化细胞数量明显减少，说明全反式维甲酸处理能够抑制间充质干细胞体外成脂分化。成脂分化潜能影响的实时荧光定量pcr检测fabp4基因表达量结果如图9所示，图中，横坐标“day0”表示处理0天时，pbs对照组、dmso对照组和atra试验组的fabp4基因表达量，“day4”表示处理4天后，pbs对照组、dmso对照组和atra试验组的fabp4基因表达量。图9的结果显示，在处理0天时，三组的fabp4基因表达量没有显著差异；处理4天后，全反式维甲酸试验组的fabp4基因表达量明显低于其它两个对照组，说明全反式维甲酸处理能够抑制成脂分化基因fabp4的表达。成脂分化潜能影响的实时荧光定量pcr检测cebpα基因表达量结果如图10所示，图中，横坐标“day0”表示处理0天时，pbs对照组、dmso对照组和atra试验组的cebpα基因表达量，“day4”表示处理4天后，pbs对照组、dmso对照组和atra试验组的cebpα基因表达量。图10的结果显示，在处理0天时，三组的cebpα基因表达量没有显著差异；处理4天后，全反式维甲酸试验组的cebpα基因表达量明显低于其它两个对照组，说明全反式维甲酸处理能够抑制成脂分化基因cebpα的表达。以上结果显示，全反式维甲酸能够同时抑制间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化，为间充质干细胞的定向调控和分化潜能调节提供了一种新的研究方案和手段。以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。sequencelisting<110>深圳市蓝思人工智能医学研究院深圳市第二人民医院<120>全反式维甲酸在间充质干细胞分化调节中的应用<130>19i28878<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1tccttttgggcatcatcttcc21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2tttgtagtggatcgtgcctcg21<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3actggtagtctgcaaaaccaaa22<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4agagccccatctgtcctctc20<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5aaggtgaagagcatcataaccct23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6tcacgcctttcataacacattcc23<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7caagaacagcaacgagtaccg21<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8gtcactggtcaactccagcac21当前第1页1 2 3