本发明属于生物与新医药中轻工和化工生物技术的天然产物有效成份的分离提取技术，涉及提取与应用领域，具体为一种茯苓多糖的提取纯化方法及应用。
背景技术
真菌多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、降血糖、降胆固醇、降血脂等多种功效，并且通过免疫调节作用抑制肿瘤或癌细胞的生长，对正常细胞无毒副作用。茯苓作为传统中药，其在提高免疫力、抗肿瘤、镇静、利尿消肿等多个方面扮演重要的角色。茯苓含有多种有效成份，主要有茯苓多糖、木聚糖、酸性多糖、甘露聚糖、茯苓酸等，其中茯苓多糖的含量最高。
目前传统的茯苓多糖提取方法一般采用热水浸提法、酸碱液浸提法等。但是，热水浸提法耗时长且多糖提取率低，而酸碱浸提法浸提程序繁琐，浸提条件较剧烈，极易破坏多糖的立体结构。因此开发简单高效的多糖提取方法具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供了一种茯苓多糖的提取纯化方法及应用，可缩短提取时间、提高茯苓多糖的提取率、提高茯苓多糖的纯化效率及多糖纯度。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种茯苓多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
（1）筛选合格的茯苓，采用粉碎机粉碎至40目得到茯苓粉，备用；
（2）将茯苓粉加10～12倍量水浸泡30min后加入复合酶进行酶解，然后将酶解后的料液升温至80℃超声浸提，过滤并收集滤液，滤渣再加10倍量水在相同条件下超声提取，合并滤液，得茯苓提取液；
（3）将茯苓提取液在真空度-0.85mpa、温度65℃条件下浓缩至茯苓提取液体积的10%即得浓缩液；向浓缩液中加入4倍量的无水乙醇，搅拌均匀后冷藏静置，离心，收集沉淀，沉淀物经无水乙醇洗涤后放入烘箱中干燥，得茯苓多糖粗品；
（4）将茯苓多糖粗品用去离子水溶解，溶解液先经滤袋过滤，再经0.2μm聚砜微滤膜过滤，最后采用超滤装置对滤液进行纯化得茯苓多糖提取液；
（5）将茯苓多糖提取液真空浓缩至原提取液体积的10%后冷冻干燥，干燥品经粉碎得纯化茯苓多糖。
优选的，所述步骤（2）中复合酶添加量为1%，复合酶包括60%纤维素酶、20%中性蛋白酶、20%果胶酶。
优选的，所述步骤（2）中酶解浸泡条件为温度48±2℃，ph值为5，酶解时间为1～1.5h。
优选的，所述步骤（2）中超声提取条件为超声功率：40～50w，提取2～3次，每次提取1.5～2h。
优选的，所述步骤（3）中冷藏静置条件为:冷藏温度≤4℃，时间24～30h。
优选的，所述步骤（3）中沉淀物干燥条件为：温度50～60℃，时间0.5～1h。
优选的，所述步骤（4）超滤装置中滤材为10kda聚砜膜，操作压力为0.225mpa、温度为25℃、初始料液比2g/l。
优选的，所述步骤（5）中冷冻干燥条件为：冻干物料温度-25～-30℃，解析温度35℃，解析时间10～12h。
本发明所述的一种茯苓多糖的提取纯化方法及应用具有以下有益效果，本发明采用酶解联合超声浸提的方法提取茯苓多糖，不仅显著的缩短了提取时间缩、提升了多糖提取率，同时能保持茯苓多糖的生物活性；此外，本发明采用超滤法提高茯苓多糖的提取纯度，不仅操作简单、条件温和、分离效率，还可防止热敏物质失活等优点。经本发明制备的茯苓多糖对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用。
具体实施方式
【实施例一】
一种茯苓多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
（1）筛选合格的茯苓，采用粉碎机粉碎至40目得到茯苓粉，备用；
（2）将茯苓粉加10倍量水浸泡30min后加入1%复合酶，在温度48℃、ph值5的条件下酶解1h，然后将酶解后的料液升温至80℃，在40w功率的条件下超声浸提1.5h，过滤并收集滤液，滤渣再加10倍量水在相同条件下超声提取1次，合并滤液，得茯苓提取液；
（3）将茯苓提取液在真空度-0.85mpa、温度65℃条件下浓缩至茯苓提取液体积的10%即得浓缩液，向浓缩液中加入4倍量的无水乙醇，搅拌均匀后置于温度≤4℃条件下冷藏24h，离心，收集沉淀，沉淀物经无水乙醇洗涤后放入烘箱中50℃干燥1h，得茯苓多糖粗品；
（4）将茯苓多糖粗品按料液比2g/l用去离子水溶解，溶液先经滤袋过滤，再经0.2μm聚砜微滤膜过滤，最后控制10kda聚砜膜超滤装置压力0.225mpa、温度25℃对滤液进行纯化，得茯苓多糖提取液；
（5）将茯苓多糖提取液真空浓缩至原提取液体积的10%后进行冷冻干燥，冻干物料温度-25℃，解析温度35℃、解析时间10h，干燥品经粉碎得纯化茯苓多糖，多糖含量75.7%。
【实施例二】
一种茯苓多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
（1）筛选合格的茯苓，采用粉碎机粉碎至40目得到茯苓粉，备用；
（2）将茯苓粉加11倍量水浸泡30min后加入1%复合酶，在温度48℃、ph值5的条件下酶解1.5h，然后将酶解后的料液升温至80℃，在45w功率的条件下超声浸提2h，过滤并收集滤液，滤渣再加10倍量水在相同条件下超声提取2次，合并滤液，得茯苓提取液；
（3）将茯苓提取液在真空度-0.85mpa、温度65℃条件下浓缩至茯苓提取液体积的10%即得浓缩液，向浓缩液中加入4倍量的无水乙醇，搅拌均匀后置于温度≤4℃条件下冷藏28h，离心，收集沉淀，沉淀物经无水乙醇洗涤后放入烘箱中55℃干燥1h，得茯苓多糖粗品；
（4）将茯苓多糖粗品按料液比2g/l用去离子水溶解，溶解液先经滤袋过滤，再经0.2μm聚砜微滤膜过滤，最后控制10kda聚砜膜超滤装置压力0.225mpa、温度25℃对滤液进行纯化，得茯苓多糖提取液；
（5）将茯苓多糖提取液真空浓缩至原提取液体积的10%后进行冷冻干燥，冻干物料温度-30℃，解析温度35℃、解析时间12h，干燥品经粉碎得纯化茯苓多糖，茯苓多糖含量81.3%。
【实施例三】
一种茯苓多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：
（1）筛选合格的茯苓，采用粉碎机粉碎至40目得到茯苓粉，备用；
（2）将茯苓粉加12倍量水浸泡30min后加入1%复合酶，在温度48℃、ph值5的条件下酶解1h，然后将酶解后的料液升温至80℃，在50w功率的条件下超声浸提1.5h，过滤并收集滤液，滤渣再加10倍量水在相同条件下超声提取2次，合并滤液，得茯苓提取液；
（3）将茯苓提取液在真空度-0.85mpa、温度65℃条件下浓缩至茯苓提取液体积的10%即得浓缩液，向浓缩液中加入4倍量的无水乙醇，搅拌均匀后置于温度≤4℃条件下冷藏30h，离心，收集沉淀，沉淀物经无水乙醇洗涤后放入烘箱中60℃干燥0.5h，得茯苓多糖粗品；
（4）将茯苓多糖粗品按料液比2g/l用去离子水溶解，溶解液先经滤袋过滤，再经0.2μm聚砜微滤膜过滤，最后控制10kda聚砜膜超滤装置压力0.225mpa、温度25℃对滤液进行纯化，得茯苓多糖提取液；
（5）将茯苓多糖提取液真空浓缩至原提取液体积的10%后进行冷冻干燥，冻干物料温度-25℃，解析温度35℃、解析时间12h，干燥品经粉碎得纯化茯苓多糖，茯苓多糖含量77.4%。
实施例1-3所得茯苓多糖对肿瘤细胞增殖的抑制作用
将实施例1-3所制得的茯苓多糖分别用去离子水配置成浓度为2mg/l的溶液。
将生长良好的s180细胞（1×108･l-1）、k562细胞（5×107･l-1）分别接种于96孔培养板每孔100μl，再加入2mg/l茯苓多糖溶液（对照组加入生理盐水）20μl后于0.05co2、37℃、充分湿化条件下培养24h。每孔加入5g･l-1的mtt10μl，继续培养4h进行显色反应，以50%n,n-二甲酰胺（含20%sds）100μl终止反应，再置0.05co2、37℃、充分湿化条件下16～18h后在511型全自动酶标仪测570nm波长处吸光度，计算百分抑制率。结果见下表：
表茯苓多糖对肿瘤细胞增殖的抑制作用（n=4）
由上表可知，茯苓多糖对动物肿瘤细胞(s180)和人白血病细胞(k562)均有明显的抑制作用。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。