一种羧甲基茯苓多糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种羧甲基茯苓多糖的制备方法，具体提供一种通过调控茯苓培养基中碳源和氮源的种类与比例发酵制备羧甲基茯苓多糖的方法。包括茯苓菌种活化、种子液制备、发酵培养和羧甲基茯苓多糖提取的过程，其特点在于所述发酵培养过程中，发酵培养基的组成按重量百分比计为：碳源（葡萄糖2.0％～4.5％，羧甲基纤维素0.1％～4.5％）、氮源（酵母浸膏0.45％～0.65％、蛋白胨0.35％～0.55％）、K2HPO40.1％、KH2PO40.046％、MgSO4·7H2O0.05％，其余为水。本发明可直接获得具有一定取代度的羧甲基茯苓多糖，无化学残留，可广泛用于药品、食品等领域。
【专利说明】一种羧甲基茯苓多糖的制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及多糖的制备方法，具体涉及一种羧甲基茯苓多糖的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前茯苓加工利用或提取制备茯苓多糖的主要原料来源为茯苓菌核。但传统的茯苓栽培法生产的茯苓菌核的生产周期长，产量也不高，且松材消耗量大。用液体培养技术生产茯苓菌丝体，从茯苓菌丝体和发酵液中提取茯苓多糖等活性物质，可较好地解决人工种植茯苓的替代问题，节省了大量的木材，对我国资源和生物多样性的保护有着重要的意义。
[0003]制备羧甲基茯苓多糖(CMP)传统工艺一般采用水媒法和溶媒法(如异丙醇法)。水媒法首先用稀碱溶液溶解茯苓多糖，再加入一定量的氯乙酸或其钠盐，在适当条件下进行醚化反应获得羧甲基茯苓多糖。溶媒法则是先把多糖悬浮在有机溶剂(如异丙醇、乙醇、丙酮等)中，经过一定时间的碱化，再加入氯乙酸，适当条件下进行醚化反应获得羧甲基茯苓多糖。
[0004]有机溶媒法是以有机溶剂为反应介质，与水媒法相比，在多糖的碱化、醚化过程中，传热、传质更迅速，反应更均匀、稳定，并且有效的减少了在水媒法中出现的副反应，醚化剂的利用率也大幅提高；而且，水媒法一般只能得到取代度较低的羧甲基多糖，而有机溶剂能通过分散多糖分子，制备得到高取代度羧甲基多糖。对于通过发酵法获得的茯苓多糖多采用溶媒法制备羧甲基茯苓多糖。茯苓多糖的化学修饰法无论采用溶媒法，还是采用水媒法制备羧甲基茯苓多糖均存在化学药剂残留的问题。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过调控茯苓培养基中碳源和氮源的种类与比例发酵制备羧甲基茯苓多糖的方法。
[0006]为达到上述目的，采用的技术方案如下:
[0007]一种羧甲基茯苓多糖的的制备方法，包括茯苓菌种活化、种子液制备、发酵培养和羧甲基茯苓多糖提取的过程，其特点在于:
[0008]所述发酵培养过程中，发酵培养基的组成按重量百分比计为:碳源(葡萄糖
2.0%~4.5%，羧甲基纤维素0.5%~3.5% )、氮源(酵母浸膏0.45%~0.65%、蛋白胨
0.35%~0.55%), K2HPO40.1 %, KH2PO40.046%、MgSO4.7Η200.05%，其余为水；培养基的初始pH值在3.0~6.0。
[0009]按上述方案，所述发酵培养过程采用摇瓶培养基，培养基装液量为摇瓶体积的20%-40% (发酵培养基与摇瓶的体积比)加入，接种量为装液量的5%-10% (种子液与培养基的体积比)。
[0010]按上述方案，所述培养过程的摇床转速150r/min、培养温度24 V~28°C、培养时间10天。
[0011]本发明在真菌合成多糖过程中，添加含目标官能团的某些分子进入真菌细胞内并作为碳源进入其代谢途径，合成含目标官能团的多糖分子，从而改变多糖的化学结构而产生生物修饰的多糖。
[0012]本发明的有益效果:
[0013]发酵培养基中添加一定浓度的羧甲基纤维素可促进茯苓菌丝的生长和多糖产量的提高，并可直接获得具有一定取代度的羧甲基茯苓多糖。
[0014]对于一般发酵法制备的茯苓多糖，还要采用化学修饰法转化为羧甲基茯苓多糖，本发明可作为一种茯苓多糖的生物修饰法，替代目前制备羧甲基茯苓多糖的化学修饰法；与茯苓多糖的化学修饰相比，不受茯苓菌核原料限制，且解决了化学药剂残留的问题，制备的羧甲基茯苓多糖可广泛用于药品、食品等领域。
[0015]在培养基中添加不同种类的多糖可以制备性能各异的改性真菌多糖，拓宽了真菌多糖的应用领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:为羧甲基茯苓多糖、茯苓多糖和羧甲基纤维素的红外光谱图。
【具体实施方式】
[0017]实施例进一步阐释本发明的技术方案，不作为对保护范围的限制。
[0018]菌种活化培养基的制备按质量百分比计为:葡萄糖2.0%，酵母菌膏0.2%，蛋白胨
0.2%，K2HPO40.1 %、KH2PO40.046%, MgSO4.7Η200.05%,琼脂 2.0%，其余为水，pH 值为自然状态。
[0019]液体种子培养基的制备按质量百分比计为:葡萄糖2.0%，酵母菌膏0.5%，蛋白胨
0.4%, K2HPO40.1 %、KH2PO40.046%, MgSO4.7Η200.05%,其余为水，用酸碱调节 pH 为 5.0。
[0020]实施例1
[0021]I)菌种活化:由斜面菌种挑起I块约1.0cm2菌块接入装有活化培养基的平皿中央，26°C恒温培养4天，菌丝均匀长满培养皿，作为固体菌种备用；
[0022]2)种子液的制备:在250mL三角瓶装入60mL液体种子培养基，用打孔器把生长于平板外侧的菌丝打孔接种到三角瓶，每瓶接种4块直径为8mm的菌块，培养温度为26°C，摇瓶转速为150r/min的培养条件下进行摇瓶培养7天，作为液体菌种备用；
[0023]3)发酵培养:转接占培养基体积6%液体种子到摇瓶发酵培养基中(发酵培养基:葡萄糖3.0%，羧甲基纤维素0.5%、酵母浸膏0.5%、蛋白胨0.4%、K2HPO40.1 %、KH2PO40.046%, MgSO4.7H200.05%、其余为水；培养基装液量占摇瓶体积比24%)，酸碱调节发酵培养基的初始PH值为5.0，用封口膜封口，置于恒温摇床中培养；摇床转速为150r/min，26°C培养 10 天。
[0024]4)羧甲基茯苓多糖的提取:采用水提醇沉法提取摇瓶发酵液中羧甲基茯苓多糖。提取步骤为:抽滤、滤液在不大于90°C下减压浓缩至原体积的五分之一、加入等体积的无水乙醇在4°C冰箱中沉淀18小时以上、离心收集沉淀物、用乙醚、丙酮沉淀物洗涤数次、60°C烘干得羧甲基茯苓多糖粗品。
[0025]经检测:本发明产品质量指标:羧甲基茯苓多糖粗品颜色为褐色，易溶于水，每升发酵液中的多糖粗品和菌丝体的干重分别达10.14g和8.42g，采用滴定法测量羧甲基茯苓多糖分子链上的羟基为羧甲基基取代的取代度为0.329。红外光谱分析结果如图1所示，a-本实施例所得羧甲基茯苓多糖；b —般茯苓多糖；c羧甲基纤维素；所制备的羧甲基茯苓多糖的红外图谱显示在3433.90CHT1处出现了羟基缔结峰，环上C-O吸收峰在1067.55cm_1处为一较强吸收峰，在903.07cm^处有β-D-葡聚糖特征吸收峰。除此之外，1325.26CHT1处次甲基振动吸收峰和1639.22cm-1处C=O非对称伸缩振动吸收峰，表明羧甲基的成功引入，即以生物发酵法生成了羧甲基茯苓多糖。
[0026]实施例2
[0027]I)菌种活化:由斜面菌种挑起I块约1.0cm2菌块接入装有活化培养基的平皿中央，26°C恒温培养4天，菌丝均匀长满培养皿，作为固体菌种备用；
[0028]2)种子液的制备:在250mL三角瓶装入60mL液体种子培养基，用打孔器把生长于平板外侧的菌丝打孔接种到三角瓶，每瓶接种4块直径为8mm的菌块，培养温度为26°C，摇瓶转速为150r/min的培养条件下进行摇瓶培养7天，作为液体菌种备用；
[0029]3)发酵培养:转接占培养基体积6%液体种子到摇瓶发酵培养基中(发酵培养基:葡萄糖2.5 %，羧甲基纤维素1.0 %、酵母浸膏0.5 %、蛋白胨0.4 %、K2HPO40.1 %,KH2PO40.046%, MgSO4.7H200.05%、其余为水；培养基装液量占摇瓶体积比24%)，发酵培养基的初始pH值为5.0，用封口膜封口，置于恒温摇床中培养；摇床转速为150r/min，28°C培养10天。
[0030]4)羧甲基茯苓多糖的提取:采用水提醇沉法提取摇瓶发酵液中羧甲基茯苓多糖。提取步骤为:抽滤、滤液在不大于90°C下减压浓缩至原体积的五分之一、加入等体积的无水乙醇在4°C冰箱中沉淀18小时以上、离心收集沉淀物、用乙醚、丙酮沉淀物洗涤数次、60°C烘干得羧甲基茯苓多糖粗品。
[0031]经检测:本发明产品质量指标:羧甲基茯苓多糖粗品颜色为褐色，易溶于水，每升发酵液中的多糖粗品和菌丝体的干重分别达15.81g和9.22g，采用滴定法测量羧甲基茯苓多糖分子链上的羟基为羧甲基基取代的取代度为0.383。
[0032]实施例3
[0033]I)菌种活化:由斜面菌种挑起I块约1.0cm2菌块接入装有活化培养基的平皿中央，26°C恒温培养4天，菌丝均匀长满培养皿，作为固体菌种备用；
[0034]2)种子液的制备:在250mL三角瓶装入60mL液体种子培养基，用打孔器把生长于平板外侧的菌丝打孔接种到三角瓶，每瓶接种4块直径为8mm的菌块，培养温度为26°C，摇瓶转速为150r/min的培养条件下进行摇瓶培养7天，作为液体菌种备用；
[0035]3)发酵培养:转接占培养基体积6%液体种子到摇瓶发酵培养基中(发酵培养基:葡萄糖2.0%，羧甲基纤维素1.5 %、酵母浸膏0.5 %、蛋白胨0.4 %、K2HPO40.1 %,KH2PO40.046%, MgSO4.7H200.05%、其余为水；培养基装液量占摇瓶体积比24%)，发酵培养基的初始pH值为5.0，用封口膜封口，置于恒温摇床中培养；摇床转速为150r/min，26°C培养10天。
[0036]4)羧甲基茯苓多糖的提取:采用水提醇沉法提取摇瓶发酵液中羧甲基茯苓多糖。提取步骤为:抽滤、滤液在不大于90°C下减压浓缩至原体积的五分之一、加入等体积的无水乙醇在4°C冰箱中沉淀18小时以上、离心收集沉淀物、用乙醚、丙酮沉淀物洗涤数次、60°C烘干得羧甲基茯苓多糖粗品。[0037]经检测:本发明产品质量指标:羧甲基茯苓多糖粗品颜色为褐色，易溶于水，每升发酵液中的多糖粗品和菌丝体的干重分别达18.48g和8.61g，采用滴定法测量羧甲基茯苓多糖分子链上的羟基为羧甲基基取代的取代度为0.667。
[0038]实施例4
[0039]I)菌种活化:由斜面菌种挑起I块约1.0cm2菌块接入装有活化培养基的平皿中央，26°C恒温培养4天，菌丝均匀长满培养皿，作为固体菌种备用；
[0040]2)种子液的制备:在250mL三角瓶装入60mL液体种子培养基，用打孔器把生长于平板外侧的菌丝打孔接种到三角瓶，每瓶接种4块直径为8mm的菌块，培养温度为26°C，摇瓶转速为150r/min的培养条件下进行摇瓶培养7天，作为液体菌种备用；
[0041]3)发酵培养:转接占培养基体积5%液体种子到摇瓶发酵培养基中(发酵培养基:葡萄糖4.5%，羧甲基纤维素3.5%、酵母浸膏0.65%、蛋白胨0.55%, K2HPO40.1 %,KH2PO40.046%, MgSO4.7H200.05%、其余为水；培养基装液量占摇瓶体积比20%)，发酵培养基的初始PH值为6.0，用封口膜封口，置于恒温摇床中培养；摇床转速为150r/min，24°C培养10天。
[0042]4)羧甲基茯苓多糖的提取:采用水提醇沉法提取摇瓶发酵液中羧甲基茯苓多糖。提取步骤为:抽滤、滤液在不大于90°C下减压浓缩至原体积的五分之一、加入等体积的无水乙醇在4°C冰箱中沉淀18小时以上、离心收集沉淀物、用乙醚、丙酮沉淀物洗涤数次、60°C烘干得羧甲基茯苓多糖粗品。
[0043]经检测:本发明产品质量指标:羧甲基茯苓多糖粗品颜色为褐色，易溶于水，每升发酵液中的多糖粗品和菌丝体的干重分别达23.15g和8.50g，采用滴定法测量羧甲基茯苓多糖分子链上的羟基为羧甲基基取代的取代度为 0.528。
[0044]实施例5
[0045]I)菌种活化:由斜面菌种挑起I块约1.0cm2菌块接入装有活化培养基的平皿中央，26°C恒温培养4天，菌丝均匀长满培养皿，作为固体菌种备用；
[0046]2)种子液的制备:在250mL三角瓶装入60mL液体种子培养基，用打孔器把生长于平板外侧的菌丝打孔接种到三角瓶，每瓶接种4块直径为8mm的菌块，培养温度为26°C，摇瓶转速为150r/min的培养条件下进行摇瓶培养7天，作为液体菌种备用；
[0047]3)发酵培养:转接占培养基体积10%液体种子到摇瓶发酵培养基中(发酵培养基:葡萄糖2 %，羧甲基纤维素2.0 %、酵母浸膏0.45 %、蛋白胨0.35%、K2HPO40.1 %,KH2PO40.046%, MgSO4.7H200.05%、其余为水；培养基装液量占摇瓶体积比40%)，发酵培养基的初始pH值为3.0，用封口膜封口，置于恒温摇床中培养；摇床转速为150r/min，26°C培养10天。
[0048]4)羧甲基茯苓多糖的提取:采用水提醇沉法提取摇瓶发酵液中羧甲基茯苓多糖。提取步骤为:抽滤、滤液在不大于90°C下减压浓缩至原体积的五分之一、加入等体积的无水乙醇在4°C冰箱中沉淀18小时以上、离心收集沉淀物、用乙醚、丙酮沉淀物洗涤数次、60°C烘干得羧甲基茯苓多糖粗品。
[0049]经检测:本发明产品质量指标:羧甲基茯苓多糖粗品颜色为褐色，易溶于水，每升发酵液中的多糖粗品和菌丝体的干重分别达20.23g和8.65g，采用滴定法测量羧甲基茯苓多糖分子链上的羟基为羧甲基基取代的取代度为0.517。
【权利要求】
1.一种羧甲基茯苓多糖的的制备方法，包括茯苓菌种活化、种子液制备、发酵培养和羧甲基茯苓多糖提取的过程，其特征在于: 所述发酵培养过程中，发酵培养基的组成按重量百分比计为:葡萄糖2.0%~4.5%，羧甲基纤维素0.5 %~3.5 %、酵母浸膏0.45 %~0.65 %、蛋白胨0.35 %~0.55 %、K2HPO40.1 %、KH2PO40.046%, MgSO4.7Η200.05%，其余为水；培养基的初始 pH 值为 3.0 ~6.0。
2.如权利要求1所述的羧甲基茯苓多糖的的制备方法，其特征在于所述发酵培养过程采用摇瓶培养基，培养基装液量为摇瓶体积的20%-40%，接种量为装液量体积的5%-10%。
3.如权利要求1所述的羧甲基茯苓多糖的的制备方法，其特征在于所述培养过程的摇床转速150r/min，培养温度24°C~28°C，培养时间10天。
【文档编号】C12R1/645GK103484510SQ201310466107
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】胡国元, 陈默, 李伟伟, 刘涛, 毛军军 申请人:武汉工程大学