一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法。首先，根据DNA池测序结果，检测到的基因多态性包括：在黄牛的Pax3基因序列转录起始位点-580位T或G的单核苷酸多态性；在Taq?DNA聚合酶、Buffer（缓冲环境）、Mg＋＋、dNTPs存在的情况下，PCR扩增黄牛Pax3基因，分别用HinfI和HaeIII限制性内切酶消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳分型。本发明提供的检测方法为Pax3基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，从而快速高效、精确地培育中国优质、特色的肉牛新品系。
【专利说明】—种检测黄牛pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子遗传学领域，涉及中国地方黄牛单核苷酸多态性(SNP)分子标记的筛查和检测，特别涉及一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的方法。
【背景技术】
[0002]我国肉牛业生产实力与世界畜牧业发达国家相比还存在相当大的差距。培育中国专门化肉牛品种，建立现代中国肉牛种牛业，是发展我国肉牛业的战略任务。这就需要通过分子育种技术提高肉牛的培育速度和肉牛品质，并通过现代生物技术加快扩繁，从而快速、高效的选育我国特有的优质牛品种。
[0003]分子标记是遗传标记的重要组成部分，现已成为家畜分子育种的核心技术。遗传标记大致可分为两类:I类是间接反映DNA水平遗传变异的遗传标记，如形态标记、细胞标记和生化标记；II类是直接反映DNA水平遗传变异的分子标记。分子标记之所以能反映DNA水平的遗传变异情况主要是基于被研究的DNA分子由于点突变、缺失、插入、易位、倒位、重排或存在长短与重排不一的重复机制而产生多态性。如今分子标记在生命科学研究领域中已经被广泛应用，在遗传标记中占主导地位。
[0004]应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而提高肉牛的生长速度和改善肉品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状 密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。
[0005]PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后，分析突变序列引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。
[0006]Pax3基因属于Pax基因家族的成员，该基因定位于人染色体2号染色体(2q36.1)，鼠I号染色体，全长99110bp，含有8个外显子，mRNA全长3112bp，CDS在mRNA的382bp_1593bp区域。Pax3属于Pax基因家族的第一类，分布于细胞核，是一类重要的转录调控因子，在胚胎发育过程中对组织和器官的分化起着重要的调控作用，是强有力的生肌性诱导物，能使多能干细胞转变为生肌性细胞，在骨骼的发育和再生过程中起着至关重要的作用。尤其对脊椎动物四肢的形成起重要作用。除此之外，Pax3基因突变也与某些疾病有关，Pax3基因表达发生在神经管细胞开始分化之前，在整个神经管轴的侧翼板、神经嵴细胞及顶板均有表达，Pax3突变或表达失调会引起某些神经系统相关的出生缺陷和遗传综合征。例如人的神经管畸形(NTDs) (Lu W，Zhu H, Wen S，et al.Screening fornovel Pax3polymorphisms and risks of spina bifida[J].Birth Defects ResearchPart A: Clinicaland Molecular Teratology, 2007，79 (I): 45-49)、Waardenburg 综合症 I型、2 型和 3 型(Tassabehji M, Read A P, Newton V E, et al.Mutations in the Pax3genecausing Waardenburg syndrome typeland type2[J].NatGenet, 1993, 3(I):26-30 ；Hoth CF, Milunsky A, Lipsky N, et al.Mutations in the paired domainof the human Pax3genecause Klein-ffaardenburg syndrome (WS-1II) as well as Waardenburg syndrome typeI (WS-1)[J].Am J HumGenet, 1993，52(3):455-462)。
[0007]目前，国内外对黄牛的Pax3基因研究甚少，主要集中在人和小鼠等方面，而且大都集中于基因功能方面，关于家畜Pax3基因遗传变异或者SNP研究的研究国内外尚未见报道。因此，对中国地方黄牛Pax3基因遗传变异领域的研究至关重要，并且将该基因位点的遗传变异与黄牛生长性状(如:体重、体高、体长、日增重等性状)关联分析，可以为我国黄牛分子育种提供理论依据。
【发明内容】
[0008]本发明解决的问题在于利用DNA池测序的方法筛查中国地方黄牛Pa3基因的目的DNA序列的多态性，寻找与黄牛生长性状相关的SNP作为分子标记，提供一种黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性及其检测方法，以此作为黄牛分子育种和标记辅助选择的分子遗传标记，加快良种选育速度。
[0009]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0010]一种检测黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，以包含Pax3基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1和P2为引物，PCR扩增黄牛Pax3基因，然后分别用限制性内切酶消化PCR扩增产物，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛Pax3基因编码区多态性。所述的引物对P1为:
[0011]上游引物P1-F:5’ -CCCTTCTTTCCCCAGGTTAGAGAC-3’ 24nt [0012]下游引物P1-R:5’ -GGGCTCGGGAGCATTTATT-3’19nt
[0013]用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第-580位的碱基多态性；
[0014]所述的引物对P2为:
[0015]上游引物P2-F:5’ -GCGAAGAGGAGGAGACCGA-3’ 19nt
[0016]下游引物P2-R:5’ -AGATTCCGAGGGACTGTGAG-3’ 20nt
[0017]用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第4617位的碱基多态性。
[0018]所述的PCR-RFLP方法，所述的PCR扩增的条件是:25 μ L反应体系，包括0.625UTaq DNA 聚合酶，2 XBuffer 12.5 μ L〈内含 Mg++、dNTPs 等〉，0.45 μ L 黄牛基因组 DNA，IOpmoI/ μ L上、下游引物各0.5 μ L和灭菌超纯水10.8 μ L。
[0019]所述P1引物所需PCR反应程序为:95°C预变性5min ;94°C变性30s，54.5°C退火30s, 72°C延伸 35s, 30 ~35 个循环；72°C延伸 IOmin0
[0020]所述P2引物所需PCR反应程序为:95°C预变性5min ;94°C变性30s，64.(TC退火30s, 72°C延伸 40s, 30 ~35 个循环；72°C延伸 IOmin0
[0021]所述的用于电泳检测的琼脂糖凝胶浓度为3.0%。
[0022]所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第_580位的碱基多态性为:GG基因型表现为210bp条带；TG基因型表现为210、188和22bp条带；TT基因型表现为188和22bp条带。
[0023]所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第4617位的碱基多态性为:AA基因型表现为222和127bp条带；AC型表现为222、127、91和36bp条带；CC基因型表现为222,91和36bp条带。
[0024]与现有技术相比，本发明把DNA池测序筛查SNP与PCR-RFLP结合起来解决了 SSCP的繁琐和不稳定性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的遗传标记，可用于黄牛的分子育种。
[0025]本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛Pax3基因第4617位的一处同义密码子突变可能产生编码蛋白表达水平发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当碱基由A突变为C时，原有的编码Ala的密码子GCA发生突变为GCC，导致在转录的mRNA在翻译过程由于携带该氨基酸的tRNA丰度不同而影响翻译的效率，从而影响该蛋白的表达量。
[0026]本发明对上述SNP进行了群体遗传学分析，统计了 5个中国地方黄牛品种中该位点的基因型和等位基因频率，结果表明该位点在不同品种间的分布存在差异。
[0027]Pax3基因对早期肌肉发育具有重要的作用，将黄牛Pax3基因的这两个SNPs位点与黄牛不同月龄的体重体尺性状进行方差分析表明，黄牛6、12月龄的体尺性状受到显著影响，因此，Pax3基因第-580位和4617位的多态位点均可以作为早期标记辅助选育(MAS)的分子标记。 【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本发明中PCR克隆筛选到的黄牛Pax3基因的-580位T>G突变的SNP多态性测序结果图；
[0029]图2为本发明中PCR克隆筛选到的黄牛Pax3基因的4617位A>C突变的SNP多态性测序结果图；
[0030]图3为黄牛Pax3基因包含第_580位突变位点的HinfI酶切电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为3.0%，图中出现的三种条带型为:GG基因型表现为210bp条带；TG基因型表现为210、188和22bp条带；TT基因型表现为188和22bp条带。其中，22bp片段太小在图中无法显示；
[0031]图4为黄牛Pax3基因包含第4617位突变位点的HaeIII酶切电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为3.0%，图中出现的三种条带型为:AA基因型表现为222和127bp条带；AC型表现为222，217，91和36bp条带；CC基因型表现为222、91和36bp条带。其中，36bp片段太小在图中无法显示。
【具体实施方式】
[0032]本发明根据Pax3基因组序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序后得到黄牛Pax3基因的部分序列。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0033]a、黄牛Pax3基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测
[0034]1、样本采集及基因组DNA提取
[0035]( I)血液样本的采集[0036]本发明具体以5个中国地方黄牛品种的种群的1241头黄牛作为检测对象，具体采集样本见表1:南阳牛(220)，郏县红牛(398)，秦川牛(224)，鲁西牛(166)和草原红牛(233)。
[0037]表1样品来源
【权利要求】
1.一种检测黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，以中国地方黄牛基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg+ +、dNTPs存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物P1和P2，进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定黄牛单核苷酸多态性。 所述的聚合酶链式反应引物P1为:
上游引物 P1-F:5’ -CCCTTCTTTCCCCAGGTTAGAGAC-3’ 24nt 下游引物 P1-R:5’ -GGGCTCGGGAGCATTTATT-3’19nt 用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第-580位的碱基多态性； 所述的聚合酶链式反应引物P2为: 上游引物 P2-F: 5，-GCGAAGAGGAGGAGACCGA-3， 19nt 下游引物 P2-R: 5 ’ -AGATTCCGAGGGACTGTGAG-3 ’ 20nt 用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛的Pax3基因第4617位的碱基多态性。
2.权利要求1所述的黄牛Pax3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是:25 μ L反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2 XBuffer 12.5 μ L< 内含 Mg+\dNTPs 等〉，0.45 μ L 黄牛基因组 DNA, IOpmoI/ μ L 上、下游引物各0.5 μ L和灭菌超纯水10.8 μ L0 所述P1引物所需PCR反应程序为:95°C预变性5min ;94°C变性30s，54.5°C退火30s，72°C延伸35s, 30~35个循环；72°C延伸IOmin0 所述P2引物所需PCR反应程序为:95°C预变性5min ;94°C变性30s，64.(TC退火30s，72°C延伸40s, 30~35个循环；72°C延伸IOmin0
3.如权利要求1所述的黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度都为3.0%。
4.根据权利要求1所述的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，检测到的中国地方黄牛Pax3基因编码区的多态性为:基因组第-580位的T>G突变；基因组第4617位的A>C突变。
5.权利要求1所述的黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性，其特征在于，通过电泳判定黄牛Pax3基因第-580位的碱基多态性为:GG基因型表现为210bp条带；TG基因型表现为.210、188和22bp条带；TT 基因型表现为188和22bp条带。
6.权利要求1所述的黄牛Pax3基因的单核苷酸多态性，其特征在于，通过电泳判定黄牛Pax3基因第4617位的碱基多态性为-M基因型表现为222和127bp条带；AC型表现为.222、127、91和36bp条带；CC基因型表现为222,91和36bp条带。
【文档编号】C12Q1/68GK103789406SQ201310465936
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】陈宏 , 徐瑶, 石涛, 周扬, 蔡含芳, 蓝贤勇 申请人:西北农林科技大学