本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
近年来，抗体药物以其安全有效、特异性高等优点被广泛应用于肿瘤、移植排异、感染性疾病、自身免疫疾病等多种疾病的临床治疗。抗体药物的药物代谢是临床前和临床试验研究中的重要检测指标。
贝伐珠单抗是一种以血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，vegf）为特异性靶点的重组人源化igg1型单克隆抗体，它能特异性结合vegf，阻断vegf与vegf受体1和2的结合及信号传导，抑制vegf的生物学活性，使血管生成受阻，从而无法提供肿瘤组织生长所需的氧和其他营养，发挥抗癌作用，贝伐珠单抗可用于治疗转移型结肠直肠癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等。
由于贝伐珠单抗的靶点vegf是可溶性蛋白，其研发机构在该药物的药物代谢（pharmacokinetics，pk）研究中使用了一种检测血清总药物浓度的方法，该方法不区分游离的药物和与靶点vegf结合的药物（详见贝伐珠单抗产品说明），因此要求检测用试剂能同时识别游离的贝伐珠单抗和已与vegf结合的贝伐珠单抗。安维汀（avastin，基因泰克公司）说明书中关于pk检测的叙述明确表明检测血液中药物浓度时，应包括游离的药物和已结合配体的药物。而国内常用的检测手段，主要采用抗原vegf包板检测，不能检测到已和vegf结合的贝伐珠单抗，无法同时检测游离的药物和已结合配体的药物，因此，在临床检测中无法反映出生物样本中全部的药物含量。
综上所述，研发一种有效检测血液中贝伐珠单抗浓度的单克隆抗体，能同时检测游离药物和已结合配体的药物，在临床前和临床试验检测贝伐珠单抗的血药浓度的，为临床试验的生物分析提供有力的工具，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现要素：
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体能够结合抗贝伐珠单抗，作为监测评估药物代谢过程的工具，在临床分析贝伐珠单抗的药物代谢方面发挥重要作用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链cdr1的氨基酸序列为seqidno.3，轻链cdr2的氨基酸序列为seqidno.4，轻链cdr3的氨基酸序列为seqidno.5；
所述单克隆抗体的重链cdr1的氨基酸序列为seqidno.6，重链cdr2的氨基酸序列为seqidno.7，重链cdr3的氨基酸序列为seqidno.8。
所述单克隆抗体fab段的轻链氨基酸序列为seqidno.1，所述单克隆抗体fab段的重链氨基酸序列为seqidno.2。
所述seqidno.1如下所示：
divltqtpaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswk.
所述seqidno.2如下所示：
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所述seqidno.3如下所示：
ksvstsgysymh.
所述seqidno.4如下所示：
ylvsnles.
所述seqidno.5如下所示：
nihpveeeda.
所述seqidno.6如下所示：
tcsvtgdsitsnywn.
所述seqidno.7如下所示：
mgyinysgstyynpslks.
所述seqidno.8如下所示：
vttedtatyycarwttvvsm.
本发明中，发明人通过深入研究现有技术中对于贝伐珠单抗的药物浓度检测的优缺点，通过设计大量复杂实验，反复筛选并最终发现了上述单克隆抗体，验证了该抗体能特异性识别贝伐珠单抗，同时不影响贝伐珠单抗与vegf的结合，药物代谢是临床上评测药物在体内作用的重要手段，对给药方式和剂量有重要的参考作用，因此准确的检测出抗体药物浓度关乎临床用药的效果，本发明提供的特异结合抗贝伐珠单抗的抗体，可以作为监测评估贝伐珠单抗药物代谢过程的工具，在临床分析贝伐珠单抗的药物代谢方面发挥重要作用。
本发明提供的单克隆抗体命名为5a9，是以贝伐珠单抗作为免疫原，利用单克隆抗体技术制备获得的特异性抗贝伐珠单抗的单克隆抗体，所述单克隆抗体的序列跟已有序列均不同，具有新颖性和创造性。
所述贝伐珠单抗包括安维汀（avastin）及其生物类似药。
第二方面，本发明提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞分泌第一方面所述的单克隆抗体。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的单克隆抗体或第二方面所述的杂交瘤细胞用于制备评估贝伐珠单抗代谢过程的药物和/或试剂盒的用途。
第四方面，本发明提供一种制备如第一方面所述单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
（1）动物免疫；
（2）细胞融合；
（3）杂交瘤细胞的筛选；
（4）杂交瘤细胞的克隆化；
（5）单克隆抗体的制备。
作为优选技术方案，一种制备如第一方面所述单克隆抗体的方法，具体包括如下步骤：
（1）动物免疫：采用6周龄balb/c雌鼠，抗原为商品化的贝伐珠单抗avastin，免疫途径为皮下注射；
（2）细胞融合：制备脾细胞悬液、骨髓瘤细胞悬液和饲养层细胞，采用peg介导融合法进行融合；
（3）杂交瘤细胞的筛选：常规间接elisa方法筛选步骤（2）得到的融合细胞的阳性孔；
（4）杂交瘤细胞的克隆化：将步骤（3）筛选出的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株5a9细胞；
（5）单克隆抗体的制备：将步骤（4）得到的5a9细胞扩大培养，注射小鼠腹腔，收集腹水离心取上清，纯化得到所述单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的单克隆抗体能特异性识别avastin，与其他igg1型抗体无交叉反应，不阻断贝伐珠单抗与vegf的结合，没有中和能力，能够监测评估贝伐珠单抗的代谢过程，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
附图说明
图1为本发明的单克隆抗体5a9与贝伐珠单抗avastin的结合特异性结果图；
图2为本发明的单克隆抗体5a9对avastin的中和活性结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1单克隆抗体5a9的制备过程
本实施例的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、杂交瘤细胞的克隆化和单抗的制备等。
（1）动物免疫：采用6周龄balb/c雌鼠，抗原为商品化的贝伐珠单抗安维汀，采用常规免疫法，免疫途径为皮下注射，用50μgavastin与福氏完全佐剂等体积混合，于小鼠背部皮下分3到4点注射；经两周后进行二次相同剂量免疫，用福氏不完全佐剂；两周后进行三次免疫，用福氏不完全佐剂；两周后加强免疫，用福氏不完全佐剂；3天后取脾细胞进行融合；
（2）细胞融合：最后一次免疫后第三天制备；
脾细胞悬液的制备：于细胞融合当天制备，取已经免疫的balb/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清，同时颈脱位致死小鼠，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液；
骨髓瘤细胞悬液的制备：提前两周复苏细胞，保证使用时细胞处于对数生长期；
饲养层细胞的制备：提前两天获得小鼠腹腔巨噬细胞，加入96孔板培养；
细胞融合：采用peg介导融合方法，取脾细胞与骨髓瘤细胞按照5:1的比例，在无血清的dmem培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，去掉上清，用力振动离心管，振散细胞，在1分钟内加入1ml50%peg（ph8.0，40℃）融合细胞，边加边摇动，加完后静置90秒，加入无血清的dmem培养基终止融合，1500rpm离心5分钟，沉淀用hat培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5%co2的细胞培养箱中培养；
（3）杂交瘤细胞筛选
细胞培养箱中培养5天后，用hat培养基换液一次，第10天用ht培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接elisa方法筛选阳性孔。用avastin包板，检测杂交瘤细胞培养上清，二抗为酶标记羊抗鼠抗体，小鼠抗血清作为阳性对照，筛选出抗体表达量高的杂交瘤细胞；
（4）杂交瘤细胞克隆化
筛选出的特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株5a9细胞；
从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或者多个杂交瘤细胞，他们分泌的抗体是不同质的，为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化；
制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的ht培养基稀释至每毫升含8个细胞，同时在杂交瘤细胞悬液中加入小鼠腹腔细胞，每毫升加入5e4个细胞。按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含0.8个杂交瘤细胞；37℃、5%co2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存，同时再进一步对阳性孔的细胞进行克隆化，用elisa的方法对克隆化的单抗进行鉴别，筛选出阳性克隆细胞株5a9细胞；
（5）制备抗体
将筛选出的杂交瘤细胞进行扩大培养，取6周龄左右的小鼠，腹腔注射0.5ml石蜡油，一周后腹腔注射2e6个杂交瘤细胞，注射后7天可见小鼠腹部明显变大，收集腹水，离心取上清，获得单克隆抗体腹水，用proteina吸附柱纯化抗体，最终获得纯化后的单克隆抗体5a9细胞。
单克隆抗体5a9的氨基酸序列
以下为单克隆抗体5a9轻链与重链可变区的序列，其轻链可变区的序列与已知序列如下，重链可变区的序列，序列比对结果显示如下，跟已有序列都有不同，具有特异性；
fab轻链氨基酸序列：108个氨基酸
seqidno.1：
divltqtpaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswk
cdr区信息如下
cdr1:27-38seqidno.3为ksvstsgysymh
cdr2:53-60seqidno.4为ylvsnles
cdr3:78-87seqidno.5为nihpveeeda
fab重链氨基酸序列：132个氨基酸
seqidno.2：
eievkleesgpslvkpsqtlsltcsvtgdsitsnywnwirkfpgnkleymgyinysgstyynpslksrisitrdtsknqyflqlnsvttedtatyycarwttvvsmdywgqgtsvtvssakttppsvynrrp
cdr区信息如下
cdr1:23-37：seqidno.6为tcsvtgdsitsnywn.
cdr2:50-67：seqidno.7为mgyinysgstyynpslks.
cdr3:87-106：seqidno.8为vttedtatyycarwttvvsm.
实施例2评估单克隆抗体5a9与贝伐珠单抗结合的特异性
实验步骤
（1）包被：用包被缓冲液分别稀释avastin，及对照抗体erbitux至5μg/ml，分别加入到不同的96孔板上，100μl/孔，2-8℃过夜；
（2）洗板：用洗液洗板3次，300μl/孔；
（3）封闭：200μl/孔0.1%bsa溶液，室温2.5小时；
（4）洗板：用洗液洗板3次，300μl/孔；
（5）稀释样品：用缓冲液稀释抗体5a9，然后连续2倍稀释，得到12个浓度样品，依次为：400ng/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.12ng/ml，1.56ng/ml，0.78ng/ml，0.39ng/ml和0.19ng/ml；
（6）将稀释好的样品转移到96孔板，100μl/孔；
（7）孵育：2-8℃过夜孵育；
（8）洗板：用洗液洗板3次，300μl/孔；
（9）酶结合物：羊抗鼠iggfc片段酶结合物igg-hrp，用缓冲液稀释1:8000，100μl/孔，37℃孵育30分钟；
（10）洗板：用洗液洗板3次，300μl/孔；
（11）底物：加新鲜配制的底物，100μl/孔，37℃孵育6分钟；
（12）终止：2mh2so4，50μl/孔；
（13）测定：酶标仪读数，波长450nm；
（14）结果：采用4-参数方程，结果见图1；
由图1可知，采用两种igg1型的治疗性单克隆抗体（avastin和erbitux）进行elisa包板，检测5a9识别avastin的特异性，5a9仅能与avastin结合，不识别erbitux，表明5a9能特异性识别avastin，与其他igg1型抗体无交叉反应。
实施例3单克隆抗体5a9的中和活性评估
实验步骤
（1）包板：将重组人vegf抗原用包被液稀释至50ng/ml，加入到elisa板中，每孔100μl，于4℃条件下孵育过夜；
（2）洗板：第2天，将板取出，倒空液体，用300μl洗液清洗三次并拍干残留液体；
（3）封闭：每个孔中加200μl封闭液，室温孵育2h；
（4）洗板：倒空液体，用300μl洗液清洗三次并拍干残留液体；
（5）样品的稀释和加样：用缓冲液稀释抗体avastin至6μg/ml，然后连续2倍稀释，得到12个浓度：3000ng/ml，1500ng/ml，750ng/ml，375ng/ml，187.5ng/ml，93.8ng/ml，46.88ng/ml，23.4ng/ml，11.72ng/ml，5.86ng/ml，2.93ng/ml，1.96ng/ml，用缓冲液稀释抗体5a9至20μg/ml，然后连续2倍稀释，得到12个浓度：20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1.25μg/ml，625ng/ml，312.5ng/ml，156.25ng/ml，78.12ng/ml，39.06ng/ml，19.63ng/ml和9.76ng/ml，随后将各稀释梯度的5a9与6μg/ml的avastin等体积混合，室温孵育2h；
（6）去掉封闭液，立即加入孵育好的混合样品及avastin标准曲线，100μl/孔，室温孵育1.5h；
（7）洗板：倒空液体，用300μl洗液清洗三次并拍干残留液体；
（8）二抗：羊抗人iggfc片段酶结合物igg-hrp，用缓冲液稀释1：10000，100μl/孔，37℃孵育1h；
（9）洗板：倒空液体，用300μl洗液清洗三次并拍干残留液体；
（10）底物：加入tmb显色液，每孔100μl，室温避光放置10分钟；
（11）终止：加入2mh2so4，每孔50μl，终止反应；
（12）读板：酶标仪上读板（od450nm）并分析数据，结果见图2；
如图2所示，贝伐珠单抗的浓度曲线随着5a9浓度的升高没有呈下降趋势，表明5a9不可以阻断贝伐珠单抗与vegf的结合，没有中和能力。
综上所述，本发明提供了一种识别贝伐珠单抗的单克隆抗体及其应用，本通过大量复杂实验筛选并验证了所述单克隆抗体能特异性结合贝伐珠单抗，同时不影响贝伐珠单抗与vegf的结合，能够监测评估贝伐珠单抗的代谢过程，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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