本发明属于微生物技术领域，具体涉及到一种高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其发酵方法。
背景技术：
γ-聚谷氨酸(poly(γ-glutamicacid)，γ-pga)是由l-谷氨酸和d-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基聚合而成的一种独特的生物高分子。通常是由500-5000个谷氨酸单体聚合而成，分子量在100-1000kda之间。γ-聚谷氨酸分子中的谷氨酸残基上带有大量游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子间形成氢键，具有极高的水溶性和吸水保湿性；这些游离羧基同时提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子具有良好的吸附性。除此之外，γ-聚谷氨酸作为一种环境友好型生物高分子，还具有一些独特的优良特性，如可食用、可降解、生物兼容性、对人体和环境无毒害等。聚谷氨酸应用范围很广，主要集中于食品、饲料、医药环保等领域，有研究表明，pga具有独特的生物化学与营养保健功效。
γ-聚谷氨酸目前可以通过化学合成法、酶转化法和微生物发酵法生产。化学合成法生产γ-聚谷氨酸过程复杂、难度大，收率低，工业应用价值不大，但对于了解γ-pga的结构与功能的关系以及发展γ-pga实际应用的修饰技术等具有一定的理论和应用价值。酶转化法是以谷氨酸为单体，采用谷氨酰转肽酶(gtp)一步酶促反应，催化谷氨酰基转移到受体上，当供体和受体为同一物质时则会发生自动转肽，避免了全合成途径中复杂的反馈调节作用，且基质组成简单，有利于产品的分离纯化。但谷氨酰转肽酶在微生物菌体中含量和活力都比较低，且分离纯化困难，制约了酶转化法的发展及应用。1942年bovarnick等人首次发现芽孢杆菌属细菌能在培养基中积累γ-pga，由此揭开了微生物发酵法生产γ-pga的研究历史。同化学合成法及酶转化法相比，微生物发酵法生产γ-pga具有生产过程容易控制、发酵产量稳定、提取率高、目标产物产量较高以及产物分子量适宜、环境友好等优点，已成为研究和生产γ-pga的主要方法和途径。几十年来，利用微生物发酵法生产γ-pga的研究一直是人们关注的热点，相关研究十分活跃，内容涉及菌种筛选、发酵培养基优化、发酵条件控制、γ-pga的分离提纯、γ-pga结构及性质的研究、γ-pga的合成机制等多个方面。目前，日本已实现了γ-pga批量生产。国内开展γ-pga的研究比较晚，近几年来，一些院校科研单位开始对γ-pga的产生菌的筛选、诱变育种、发酵条件的优化、生物合成途径和机制以及分批发酵生产等进行了研究，取得了一些阶段性研究成果。但是微生物法生产γ-pga仍然存在成本高，γ-pga产量和纯度低等缺点。因此，筛选γ-pga的高产菌株是非常有必要的。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其发酵方法。
(二)技术方案
本发明通过以下技术方案予以实现：
一种用于发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)hjba058，所述菌株于2014年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno：9383，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述枯草芽孢杆菌能够代谢产生γ-聚谷氨酸。
优选地，所述枯草芽孢杆菌hjba058生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌hjba058接种至lb固体培养基中，并在37℃的恒温下培养22-24小时；
2)种子培养：取适量步骤1中制备的菌种斜面，在无菌条件下，每支斜面均以5毫升无菌水将斜面菌苔清洗下来，以1-3％的接种量接入种子培养液中，在37℃的恒温下，以20-50r/min的转速振荡培养12-20小时；
3)发酵罐发酵：取发酵液体积3％-6％步骤2中的种子液，并接种至30l发酵罐中的发酵培养液中，控制温度在37℃，以20-50r/min的转速进行振荡培养48-96小时；
4)提取γ-聚谷氨酸：将步骤3中的发酵液的ph值调节至3.0-3.5，再将发酵液温度降至4℃，并以8000r/min的转速对其离心15min，去除菌体后得上清液，然后将上清液加入适量乙醇中使其沉淀，最后收集沉淀，将沉淀物置于50℃温度下真空烘干至恒重，即得γ-聚谷氨酸。
优选地，步骤1所述的lb固体培养基的组份及其浓度如下：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、琼脂2％，所述lb固体培养基中的ph值为7.0-7.2。
优选地，步骤2所述的种子培养基的组份及其浓度如下：麦芽糖20-50g/l、酵母粉5-10g/l、谷氨酸钠10-30g/l、氯化钠10g/l、kh2po45g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，所述种子培养基中的ph值为6.5-7.0。
优选地，步骤3所述的发酵培养基的组份及其浓度如下：麦芽糖50-70g/l、酵母粉10-20g/l、谷氨酸钠80-100g/l、氯化钠30g/l、kh2po46g/l、mgso4·7h2o1.5g/l，所述发酵培养基中的ph值为6.5-7.0。
优选地，步骤4中所述的乙醇与上清液的体积比为3-5：1，乙醇的质量分数为95％。
(三)有益效果
本发明的突出优点在于提供了一株能够高效生产γ-聚谷氨酸的菌株枯草芽孢杆菌hjba058，其发酵方法简单，生产成本低，发酵条件容易控制，同时其发酵产物产量高达56.5g/l，产物分子量分布窄，纯度高，能够广泛的投入到γ-聚谷氨酸的工业生产中去。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
分离鉴定枯草芽孢杆菌hjba058
该菌株分离自雏鸡肠道中。具体实施步骤如下：
1、制备菌悬液：取一定日龄(4-5天)的健康雏鸡剖杀后，刮取回肠或盲肠表面粘液及内容物置于装有无菌生理盐水的三角瓶中，在室温下磁力搅拌30分钟，制成菌悬液，于80℃处理15min；
2、菌悬液稀释、菌落挑取：将上述所得菌悬液采用10倍倍比稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液，分别选择稀释103、104、105、106倍的菌悬液各100μl涂布于固体培养基平板上；在37℃恒温培养2天后，挑取菌落表面粗糙不透明、粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落；
3、划线纯化：用平整、圆滑的接种环，在无菌操作条件下，将获得的单菌落在固体培养基平板上连续划线纯化，37℃恒温培养24h后，挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面，经培养后保存，待用；
4、pcr鉴定：对上述菌株进行镜检，选取革兰氏阳性芽孢杆菌，进行pcr检测，pcr检测采用16srna通用引物对27f/1492r，碱基序列为：
27f：5′-gagagtttgatcctggctcag-3′；
1492r：5′-ggttaccttgttacgactt-3′；
pcr总体积为25μl，其中2.5μlbuffer，1μldntp(10mmol/l)，引物27f1μl(10μmol/l)，引物1492r1μl(10μmol/l)，模板1μl，taq0.1μl，ddh2o18.4μl。反应条件：95℃5min；95℃1min，55℃45s，72℃2min，30个循环；72℃10min。
pcr产物进行琼脂糖电泳，选取目标条带约在1450bp的pcr产物测序，得到的测序结果在ncbi上进行blast比对，鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌hjba058。
利用枯草芽孢杆菌hjba058发酵生产γ-聚谷氨酸以及发酵产物的检测，其具体操作步骤如下：
1、菌种活化：将枯草芽孢杆菌hjba058接种至lb固体培养基中(其组份及其浓度如下：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、琼脂2％，所述lb固体培养基中的ph值为7.0)，并在37℃的恒温下培养22小时；
2、种子培养：取上述步骤1中制备的菌种斜面适量，在无菌条件下，每支斜面均以5毫升无菌水将斜面菌苔清洗下来，以1％的接种量接入种子培养液中(其组份及其浓度如下：麦芽糖50g/l、酵母粉10g/l、谷氨酸钠30g/l、氯化钠10g/l、kh2po45g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，ph值为7.0)，在37℃的恒温下，以40r/min的转速振荡培养12小时；
3、发酵罐发酵：取步骤2中的种子液适量，按发酵液体积的3％接种，(培养基组份及其浓度如下：麦芽糖50g/l、酵母粉10g/l、谷氨酸钠80g/l、氯化钠30g/l、kh2po46g/l、mgso4·7h2o1.5g/l，所述发酵培养基中的ph值为7.0)，在37℃的恒温下，在30l发酵罐中培养60小时，以40r/min的转速进行搅拌；
4、提取γ-聚谷氨酸：将步骤3中的发酵液的ph值调节至3.0，再将发酵液温度降至4℃，并以8000r/min的转速对其离心15min，去除菌体后得上清液，然后将上清液直接缓慢加入3倍体积的95％的乙醇中使其沉淀，最后收集沉淀，将沉淀物置于50℃温度下真空烘干24h至恒重，即得γ-聚谷氨酸。
5、采用ft-ir、1h-nmr，紫外吸收光谱等确定发酵产物为γ-聚谷氨酸；
6、γ-聚谷氨酸分子量测定，采用凝胶渗透色谱仪测定发酵产物γ-聚谷氨酸的分子量，结果表明，通过本培养条件培养枯草芽孢杆菌hjba058，发酵得到的γ-聚谷氨酸分子量为：280kd。
实施例2：
本实施例中分离鉴定枯草芽孢杆菌hjba058与实施例1相同。
利用枯草芽孢杆菌hjba058发酵生产γ-聚谷氨酸以及发酵产物的检测，其具体操作步骤如下：
1、菌种活化：将枯草芽孢杆菌hjba058接种至lb固体培养基中(其组份及其浓度如下：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、琼脂2％，所述lb固体培养基中的ph值为7.2)，并在37℃的恒温下培养24小时；
2、种子培养，取上述步骤1中制备的菌种斜面适量，在无菌条件下，每支斜面均以5毫升无菌水将斜面菌苔清洗下来，以1.5％的接种量接入种子培养液中(其组份及其浓度如下：麦芽糖50g/l、酵母粉10g/l、谷氨酸钠30g/l、氯化钠10g/l、kh2po45g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，ph值为6.8)，在37℃的恒温下，以50r/min的转速振荡培养12小时；
3、发酵罐发酵：取步骤2中的种子液适量，按发酵液体积的3％接种，(培养基组份及其浓度如下：麦芽糖60g/l、酵母粉10g/l、谷氨酸钠80g/l、氯化钠30g/l、kh2po46g/l、mgso4·7h2o1.5g/l，所述发酵培养基中的ph值为7.0)，在37℃的恒温下，在30l发酵罐中培养48小时，以50r/min的转速进行搅拌；
4、提取γ-聚谷氨酸：将步骤3中的发酵液的ph值调节至3，再将发酵液温度降至4℃，并以8000r/min的转速对其离心15min，去除菌体后得上清液，然后将上清液直接缓慢加入3倍体积的95％的乙醇中使其沉淀，最后收集沉淀，将沉淀物置于50℃温度下真空烘干30h至恒重，即得γ-聚谷氨酸。
5、采用ft-ir、1h-nmr，紫外吸收光谱等确定发酵产物为γ-聚谷氨酸；
6、γ-聚谷氨酸分子量测定，采用凝胶渗透色谱仪测定发酵产物γ-聚谷氨酸的分子量，结果表明，通过本培养条件培养枯草芽孢杆菌hjba058，发酵得到的γ-聚谷氨酸分子量为：276kd。
实施例3：
本实施例中分离鉴定枯草芽孢杆菌hjba058与实施例1相同。
利用枯草芽孢杆菌hjba058发酵生产γ-聚谷氨酸以及发酵产物的检测，其具体操作步骤如下：
1、菌种活化：将枯草芽孢杆菌hjba058接种至lb固体培养基中(其组份及其浓度如下：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、琼脂2％，所述lb固体培养基中的ph值为7.0)，并在37℃的恒温下培养22小时；
2、种子培养，取上述步骤1中制备的菌种斜面适量，在无菌条件下，每支斜面均以5毫升无菌水将斜面菌苔清洗下来，以3％的接种量接入种子培养液中(其组份及其浓度如下：麦芽糖50g/l、酵母粉10g/l、谷氨酸钠30g/l、氯化钠10g/l、kh2po45g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，ph值为7.0)，在37℃的恒温下，以20r/min的转速振荡培养14小时；
3、发酵罐发酵：取步骤2中的种子液适量，按发酵液体积的4％接种，(培养基组份及其浓度如下：麦芽糖50g/l、酵母粉20g/l、谷氨酸钠100g/l、氯化钠30g/l、kh2po46g/l、mgso4·7h2o1.5g/l，所述发酵培养基中的ph值为6.8)，在37℃的恒温下，在30l发酵罐中培养72小时，以20r/min的转速进行搅拌；
4、提取γ-聚谷氨酸：将步骤3中的发酵液的ph值调节至3.0，再将发酵液温度降至4℃，并以8000r/min的转速对其离心15min，去除菌体后得上清液，然后将上清液加入5倍体积的95％的乙醇中使其沉淀，最后收集沉淀，将沉淀物置于50℃温度下真空烘干36h至恒重，即得γ-聚谷氨酸。
5、采用ft-ir、1h-nmr，紫外吸收光谱等确定发酵产物为γ-聚谷氨酸；
6、γ-聚谷氨酸分子量测定，采用凝胶渗透色谱仪测定发酵产物γ-聚谷氨酸的分子量，结果表明，通过本培养条件培养枯草芽孢杆菌hjba058，发酵得到的γ-聚谷氨酸分子量为：283kd。
实施例4：
本实施例中分离鉴定枯草芽孢杆菌hjba058与实施例1相同。
利用枯草芽孢杆菌hjba058发酵生产γ-聚谷氨酸以及发酵产物的检测，其具体操作步骤如下：
1、菌种活化：将枯草芽孢杆菌hjba058接种至lb固体培养基中(其组份及其浓度如下：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、琼脂2％，所述lb固体培养基中的ph值为7.1)，并在37℃的恒温下培养24小时；
2、种子培养，取上述步骤1中制备的菌种斜面适量，在无菌条件下，每支斜面均以5毫升无菌水将斜面菌苔清洗下来，以2％的接种量接入种子培养液中(其组份及其浓度如下：麦芽糖50g/l、酵母粉10g/l、谷氨酸钠30g/l、氯化钠10g/l、kh2po45g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，ph值为7.0)，在37℃的恒温下，以30r/min的转速振荡培养14小时；
3、发酵罐发酵：取步骤2中的种子液适量，按发酵液体积的4％接种，(培养基组份及其浓度如下：麦芽糖50g/l、酵母粉20g/l、谷氨酸钠100g/l、氯化钠30g/l、kh2po46g/l、mgso4·7h2o1.5g/l，所述发酵培养基中的ph值为6.8)，在37℃的恒温下，在30l发酵罐中培养72小时，以30r/min的转速进行搅拌；
4、提取γ-聚谷氨酸：将步骤3中的发酵液的ph值调节至3.5，再将发酵液温度降至4℃，并以8000r/min的转速对其离心15min，去除菌体后得上清液，然后将上清液加入4倍体积的95％的乙醇中使其沉淀，最后收集沉淀，将沉淀物置于50℃温度下真空烘干30h至恒重，即得γ-聚谷氨酸。
5、采用ft-ir、1h-nmr，紫外吸收光谱等确定发酵产物为γ-聚谷氨酸；
6、γ-聚谷氨酸分子量测定，采用凝胶渗透色谱仪测定发酵产物γ-聚谷氨酸的分子量，结果表明，通过本培养条件培养枯草芽孢杆菌hjba058，发酵得到的γ-聚谷氨酸分子量为：287kd。
实施例5：
本实施例中分离鉴定枯草芽孢杆菌hjba058与实施例1相同。
利用枯草芽孢杆菌hjba058发酵生产γ-聚谷氨酸以及发酵产物的检测，其具体操作步骤如下：
1、菌种活化：将枯草芽孢杆菌hjba058接种至lb固体培养基中(其组份及其浓度如下：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l、琼脂2％，所述lb固体培养基中的ph值为7.2)，并在37℃的恒温下培养22小时；
2、种子培养：取上述步骤1中制备的菌种斜面适量，在无菌条件下，每支斜面均以5毫升无菌水将斜面菌苔清洗下来，以1.5％的接种量接入种子培养液中(其组份及其浓度如下：麦芽糖50g/l、酵母粉10g/l、谷氨酸钠30g/l、氯化钠10g/l、kh2po45g/l、mgso4·7h2o0.5g/l，ph值为7.0)，在37℃的恒温下，以50r/min的转速振荡培养20小时；
3、发酵罐发酵：取步骤2中的种子液适量，按发酵液体积的6％接种，(培养基组份及其浓度如下：麦芽糖70g/l、酵母粉10g/l、谷氨酸钠100g/l、氯化钠30g/l、kh2po46g/l、mgso4·7h2o1.5g/l，所述发酵培养基中的ph值为7.0)，在37℃的恒温下，在30l发酵罐中培养96小时，以50r/min的转速进行搅拌；
4、提取γ-聚谷氨酸：将步骤3中的发酵液的ph值调节至3.0，再将发酵液温度降至4℃，并以8000r/min的转速对其离心15min，去除菌体后得上清液，然后将上清液直接缓慢加入3倍体积的95％的乙醇中使其沉淀，最后收集沉淀，将沉淀物置于50℃温度下真空烘干36h至恒重，即得γ-聚谷氨酸。
5、采用ft-ir、1h-nmr，紫外吸收光谱等确定发酵产物为γ-聚谷氨酸；
6、γ-聚谷氨酸分子量测定，采用凝胶渗透色谱仪测定发酵产物γ-聚谷氨酸的分子量，结果表明，通过本培养条件培养枯草芽孢杆菌hjba058，发酵得到的γ-聚谷氨酸分子量为：279kd。
从以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。