本发明涉及生物医学
技术领域：
，尤其涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法。
背景技术：
：帕金森病(parkinson’sdisease，pd)是常见于老年人的神经系统退行性疾病，其发病率仅次于阿尔兹海默病，位于第二位，一直是临床治疗的难点。目前认为其主要是因为脑中多巴胺能神经元的退行性变，大脑的特定部位缺少多巴胺所致。目前可用的药物和手术疗法能缓解疾病的早期临床症状，但无法阻止或逆转多巴胺能神经元退行性变，而且长期使用有明显的副作用。且随着我国人口平均寿命延长和社会老龄化进程加速，帕金森病的发病率呈明显上升趋势，已成为一个严重的社会问题，帕金森病主要的病理生化改变是位于中脑黑质致密区的多巴胺能神经元渐进性变性坏死，致使黑质-纹状体通路多巴胺神经递质水平下降，引起锥体外系的功能失调，从而导致以随意运动减慢、肌张力僵直、肢体震颤和正常的姿势平衡反射丧失为主的临床症状。长期以来，人们一直在寻找能够有效治疗帕金森病的方法，由于本病主要是源于多巴胺能神经元变性死亡而致，若能将合成和分泌多巴胺的细胞移植入黑质-纹状体系统，理论上讲是最为理想的治疗措施，可以起到治愈该病的作用。但这种疗法却存在难以克服的困难，主要限制因素是无法同时获得足够用于移植的胚胎组织，所以，寻找新的细胞来源已成为细胞替代治疗首要解决的问题。自2000年的erices等报道脐带血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞以来，因脐带血间充质干细胞的多向分化潜能，免疫调节作用和无伦理问题等优点，备受研究者的关注。随后，有学者分别报道了脐带血间充质干细胞在体外可诱导表达神经元标志物和神经胶质细胞标志物。目前，人们已经可以成功的体外分离培养脐带血间充质干细胞，且对其生物学特性、表面标志和免疫原性有了进一步的了解。近年来成功地诱导脐带血间充质干细胞分化为骨、脂肪、软骨、肝脏及神经等成体细胞，展示了脐带血间充质干细胞的无限分化潜能和广阔的应用前景，从而为体外诱导脐带血间充质干细胞分化各种成体细胞和各种疾病的治疗提供了新的思路。脐带间充质干细胞(msc)是中胚层起源的，能够进行自我更新，并具备向成骨、软骨和脂肪三种中胚层系细胞分化潜能的一种成体干细胞。近年来研究发现，msc在中胚层之外，还可以跨胚层进行转分化，如分化成外胚层系的神经细胞和上皮细胞以及内胚层系的肝细胞和胰腺细胞。因为msc来源广泛，易于分离培养，免疫原性较低，且不存在胚胎干细胞所面临的伦理学问题，这使其在再生医学方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。中枢神经系统的神经退行性疾病如帕金森氏综合征以及外部创伤造成的神经损伤等长期困扰人类的问题也因此将有更为现实可行的解决之道。目前体外诱导的方法主要分为3种：①神经营养因子和细胞因子，如维甲酸、脑源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等诱导分化。②化学试剂，如二甲基亚砜、2-巯基乙醇、丁羟茴醚等诱导分化。③基因转染或修饰的诱导分化。全骨髓培养得到的mscs在体外合适条件和诱导因子作用12天可分化为表达多巴胺神经元标志物酪氨酸羟化酶(th)的神经元样细胞，并具有一定的电生理活性，分化效率可达67％，是目前骨髓间充质干细胞能达到的最大分化率以及最短的诱导时间。然而，目前技术难以通过体外诱导分化得到足够数量的单一且成熟的多巴胺能神经元，而且移植后的细胞存活数量有限、移植细胞不易与原有神经网络融合都在一定程度上限制了其临床应用。因此，在细胞替代治疗帕金森病，提高骨髓间充质干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元的分化效率是解决这些问题的关键。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，该脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法可将脐带间充质干细胞定向分化为多巴胺能神经元，且分化效率高，诱导时间短，同时操作简单、方便。本发明的采用的技术方案是，一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，该方法包括预诱导分化步骤，所述预诱导分化步骤包括以下操作：将间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待间充质干细胞贴壁后，于低氧环境下用含黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天；其中，黄酮类诱导物在诱导液中的浓度为8-12ng/ml。本发明的方法中，对间充质干细胞先进行预诱导分化，且在预诱导过程中于低氧环境下采用黄酮类诱导物对间充质干细胞进行诱导，黄酮类诱导物可与间充质干细胞表面的受体相结合，从而使间充质干细胞向多巴胺能神经元方向分化。具体的，黄酮类诱导物可激活间充质干细胞内与神经细胞定向分化相关的信号通路wnt/β-cantine、bmps/smad和nother等，从而促进间充质干细胞向神经细胞分化；另外，黄酮类诱导物还可能促进间充质干细胞上与神经生长、分化有关的细胞因子表达，如ngf、nt-3和bdnf等细胞因子，这些因子能诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化。同时，低氧环境对间充质干细胞向多巴胺能神经元分化也起着关键性作用，因为在分化过程中间充质干细胞还受外部环境影响和调控，低氧环境有利于间充质干细胞向多巴胺能神经元分化，且低氧环境与黄酮类诱导物可产生协同作用，有效提高了间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的效率和选择性。作为对上述技术方案的进一步限定，该方法还包括于所述预诱导分化步骤后进行的诱导分化步骤。作为对上述技术方案的进一步限定，所述诱导分化步骤包括以下操作：将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有胶质细胞源性神经营养因子和音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天。于预诱导分化步骤后继续进行诱导分化步骤，以使经预诱导分化后形成的神经细胞样形态的细胞经胶质细胞源性神经营养因子和因素波状蛋白进一步诱导从而继续向多巴胺能神经元分化，从而提高分化率及选择性，且也可缩短诱导分化时间。其中，所述胶质细胞源性神经营养因子在间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的进程中可促进ret的表达，而ret通过与间充质干细胞膜表面的gdnfα1受体结合而引起ret二聚化及酪氨酸残基位点发生自体磷酸化，而后进一步激活mark、p13k、plcγ等信号途径，从而激活信息在胞内传到，引起神经细胞表型的转化。所述音速波状蛋白是一种重要的发育调控因子，其在中脑多巴胺能神经元发生、发育和分化过程中起到重要的作用，能够调控着神经轴和背腹轴多巴胺能神经元的发育，同时能序贯激活一系列转录因子，包括otx2、lmx1a/b、en1/2、msx1/2、ngn2、mash1。另外，胶质细胞源性神经营养因子还具有促进多种神经元存活与分化的功能，是一种重要的神经保护因子，其可以激活一系列胞内反应，上调抗凋亡基因bcl-xl的表达，如此可有效降低分化为多巴胺能神经元的凋亡水平，使分化成的多巴胺能神经元具有较高的存活率，且细胞状态好。作为对上述技术方案的进一步限定，所述胶质细胞源性神经营养因子的浓度为30-70ng/ml，所述音速波状蛋白的浓度为5-15ng/ml。作为对上述技术方案的进一步限定，所述低氧环境中的氧浓度为3％-10％。作为对上述技术方案的进一步限定，所述低氧环境中的氧浓度为4％。进一步对低氧环境中的氧浓度进行限定，找出间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的最适宜氧浓度环境，以提高间充质干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化的效率。作为对上述技术方案的进一步限定，所述预诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、10-30u/ml的碱性成纤维细胞生长因子、及10-30ng/ml的表皮细胞生长因子。预诱导培养液中添加的碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子可联合黄酮类诱导物诱导间充质干细胞向多巴胺能神经元分化，三者可产生协同作用，从而有效提高了诱导分化率，并缩短了诱导时间。作为对上述技术方案的进一步限定，所述诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、碱性成纤维细胞生长因子、维生素c、维生素b1、l-谷氨酰胺。维生素c和维生素b1可提供间充质干细胞生长所需的微量元素，l-谷氨酰胺则可提供碳源，如此可有效保证间充质干细胞的正常生长；而碱性成纤维细胞生长因子则可联合胶质细胞源性神经营养因子和音速波状蛋白产生协同作用，有效提高诱导分化率和选择性，使诱导分化得到的多巴胺能神经元不仅保持神经元特异性抗原标志物的高表达，并且能够分泌多巴胺，且高水平表达多巴胺能神经元独有的表面标志蛋白。作为对上述技术方案的进一步限定，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞来源于脐带组织，取材方便，无伦理学争议，且也没有受病源污染的风险，细胞活力有保证；同时脐带组织中间充质干细胞含量非常丰富，且增殖能力强、质量优、活性高、更纯净，可多次使用。作为对上述技术方案的进一步限定，所述黄酮类诱导物为黄酮化合物。具体的，所述黄酮化合物为如下结构式(ⅰ)～(ⅳ)中任一种。与天然黄酮类化合物相比，上述四种所述化合物可有效促进脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化，且分化效率高，选择性好。对于具有结构式(ⅱ)～(ⅳ)的化合物，由于吸电子基团f、cl、br的引入，增强了化合的诱导分化能力。另外，因黄酮化合物本身就具有抗氧化和消除自由基活性的能力，因而可促进间充质干细胞向多巴胺能神经元方向分化。具有结构式(ⅰ)～(ⅳ)的化合物可以通过如下方法合成：将天然芹菜素与乙酰氯、溴代乙酰氯、氯代乙酰氯、氟代乙酰氯以1:1.5～1:3的摩尔比加入至二甲基甲酰胺溶剂中，然后使用碳酸钾作为缚酸剂，反应温度控制在100～130℃，优选115℃，于反应过程中实施进行薄层层析检测，待反应完成后将反应液浓缩并将浓缩液经硅胶层析分离即可制得所述黄酮化合物。采用上述技术，本发明获得的神经细胞至少具有如下特征之一：(1)具有典型的细胞体、轴突和树突等细胞结构；(2)神经细胞占诱导细胞群体的90％以上；(3)对外界刺激具有放电功能。综上所述，本发明所述的脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法可有效提高脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元的分化效率，且诱导周期短，细胞分化均一度高达90％以上，且分化形成的细胞可表达th、dat和psd-95，并能分泌多巴胺神经递质，具备成熟神经元的形态和功能特征。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例本实施例涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，该方法中使用的脐带间充质干细胞来源为经产妇同意授权的新生儿脐带。将剖宫产新生儿的脐带在生理盐水中洗涤三次，去除表面的血污，同时尽量去除脐带内部动脉血管和静脉血管中的残余的血渍，然后将脐带剪成2～3cm左右长的小段，再次洗涤。随后，使用手术剪将脐带沿脐带内血管平行方向剖开，并将两根动脉血管和一根静脉血管从脐带中剥离干净，再将脐带表面羊膜剥掉，而得到华通胶。将得到的华通胶用生理盐水洗涤三次，并用手术剪剪成约1mm3的组织块。将组织块均匀的铺在100mm的培养皿中，室温放置5～10min，以使组织块紧贴在培养皿的底部。向培养皿中加入5ml培养基，随后将培养皿置于37℃、5％co2培养箱中静置培养。并使用倒置显微镜每天观察细胞生长情况。培养1周后首次换液，此后3～4天换液1次。待细胞长至培养皿的80％～90％后传代培养。所述培养基中含dmem/f12、10％fbs、100u/ml青霉素、100mg/l链霉素。实施例1.1本实施例涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，具体步骤如下：a、预诱导分化：将脐带间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待脐带间充质干细胞贴壁后，于氧浓度为4％的环境下用含有黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天。其中，黄酮类诱导物为黄酮化合物，具体为结构式(ⅰ)的黄酮化合物。且在预诱导培养过程中，保持黄酮类诱导物的浓度为10ng/ml。所述预诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、20u/ml的碱性成纤维细胞生长因子及20ng/ml的表皮细胞生长因子。b、诱导分化：将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有50ng/ml胶质细胞源性神经营养因子和10ng/ml音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天，即可得到多巴胺能神经元。所述诱导培养液中还包含有间充质干细胞无血清基础培养基、碱性成纤维生长因子、维生素c、维生素b1及l-谷氨酰胺。实施例1.2本实施例涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，具体步骤如下：a、预诱导分化：将脐带间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待脐带间充质干细胞贴壁后，于氧浓度为4％的环境下用含有黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天。其中，黄酮类诱导物为黄酮化合物，具体为结构式(ⅱ)的黄酮化合物。且在预诱导培养过程中，保持黄酮类诱导物的浓度为10ng/ml。所述预诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、20u/ml的碱性成纤维细胞生长因子及20ng/ml的表皮细胞生长因子。b、诱导分化：将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有50ng/ml胶质细胞源性神经营养因子和10ng/ml音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天，即可得到多巴胺能神经元。所述诱导培养液中还包含有间充质干细胞无血清基础培养基、碱性成纤维生长因子、维生素c、维生素b1及l-谷氨酰胺。实施例1.3本实施例涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，具体步骤如下：a、预诱导分化：将脐带间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待脐带间充质干细胞贴壁后，于氧浓度为4％的环境下用含有黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天。其中，黄酮类诱导物为黄酮化合物，具体为结构式(ⅲ)的黄酮化合物。且在预诱导培养过程中，保持黄酮类诱导物的浓度为10ng/ml。所述预诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、20u/ml的碱性成纤维细胞生长因子及20ng/ml的表皮细胞生长因子。b、诱导分化：将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有50ng/ml胶质细胞源性神经营养因子和10ng/ml音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天，即可得到多巴胺能神经元。所述诱导培养液中还包含有间充质干细胞无血清基础培养基、碱性成纤维生长因子、维生素c、维生素b1及l-谷氨酰胺。实施例1.4本实施例涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，具体步骤如下：a、预诱导分化：将脐带间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待脐带间充质干细胞贴壁后，于氧浓度为4％的环境下用含有黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天。其中，黄酮类诱导物为黄酮化合物，具体为结构式(ⅳ)的黄酮化合物。且在预诱导培养过程中，保持黄酮类诱导物的浓度为10ng/ml。所述预诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、20u/ml的碱性成纤维细胞生长因子及20ng/ml的表皮细胞生长因子。b、诱导分化：将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有50ng/ml胶质细胞源性神经营养因子和10ng/ml音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天，即可得到多巴胺能神经元。所述诱导培养液中还包含有间充质干细胞无血清基础培养基、碱性成纤维生长因子、维生素c、维生素b1及l-谷氨酰胺。实施例1.5本实施例涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，具体步骤如下：a、预诱导分化：将脐带间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待脐带间充质干细胞贴壁后，于氧浓度为8％的环境下用含有黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天。其中，黄酮类诱导物为黄酮化合物，具体为结构式(ⅳ)的黄酮化合物。且在预诱导培养过程中，保持黄酮类诱导物的浓度为10ng/ml。所述预诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、20u/ml的碱性成纤维细胞生长因子及20ng/ml的表皮细胞生长因子。b、诱导分化：将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有50ng/ml胶质细胞源性神经营养因子和10ng/ml音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天，即可得到多巴胺能神经元。所述诱导培养液中还包含有间充质干细胞无血清基础培养基、碱性成纤维生长因子、维生素c、维生素b1及l-谷氨酰胺。对比例一本对比例涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，具体步骤如下：a、预诱导分化：将脐带间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待脐带间充质干细胞贴壁后，于正常氧环境下用含有黄酮类诱导物的预诱导培养液培养2～3天。其中，黄酮类诱导物为黄酮化合物，具体为结构式(ⅳ)的黄酮化合物。且在预诱导培养过程中，保持黄酮类诱导物的浓度为10ng/ml。所述预诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、20u/ml的碱性成纤维细胞生长因子及20ng/ml的表皮细胞生长因子。b、诱导分化：将经预诱导分化处理后得到的细胞于正常氧环境下继续在添加有50ng/ml胶质细胞源性神经营养因子和10ng/ml音速波状蛋白的诱导培养液中进行诱导培养3～4天，即可得到多巴胺能神经元。所述诱导培养液中还包含有间充质干细胞无血清基础培养基、碱性成纤维生长因子、维生素c、维生素b1及l-谷氨酰胺。对比例二本对比例涉及一种脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，具体步骤如下：将脐带间充质干细胞按1～5×104个/ml的细胞密度接种，待脐带间充质干细胞贴壁后，于正常氧环境下用含有黄酮类诱导物的诱导培养液培养5～10天。其中，黄酮类诱导物为黄酮化合物，具体为结构式(ⅳ)的黄酮化合物。且在诱导培养过程中，保持黄酮类诱导物的浓度为10ng/ml。所述诱导培养液中包含有间充质干细胞无血清基础培养基、20u/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的表皮细胞生长因子、50ng/ml胶质细胞源性神经营养因子、10ng/ml音速波状蛋白以及维生素c、维生素b1、l-谷氨酰胺。采用免疫荧光化学染色法、流式细胞分析和电生理检测对实施例及对比例一、二所得的细胞进行分析，结果表明上述诱导培养均产生了多巴胺能神经元，且各种方法获得的多巴胺能神经元的分化比例(即诱导细胞中多巴胺能神经元的比例)、细胞突出数目、细胞突出长度的结果如表1所示。表1细胞诱导分化率、细胞突出数目及细胞突出长度的结果组别分化率细胞突出数目细胞突出长度(μm/cell)实施例1.190.35％8.3±0.64189.2±2.94实施例1.291.48％8.8±0.83191.1±2.13实施例1.392.66％9.2±0.69193.5±1.97实施例1.493.52％9.5±1.07195.9±2.16实施例1.591.88％8.9±0.97192.7±1.85对比例一88.69％5.9±0.91169.4±2.22对比例二72.84％4.6±1.12157.3±2.51经各种方法诱导后获得的细胞形态均发生了明显变化：胞体回缩呈多边形，并向四周伸出大量突起，类似成熟神经元。但对比例一、二相对实施例1.1～1.6，不仅分化比例较低、细胞突出数目较少，且细胞突出长度也较短。而于实施例1.1～1.5中，在其他诱导条件相同的情况下，采用结构式(ⅳ)的黄酮化合物进行诱导具有较好的诱导分化率，且细胞上平均突出较多，突出的长度也较长；同时，根据实施例1.4与实施例1.5对比可发现，在同样采用结构式(ⅳ)的黄酮化合物诱导的情况下，预诱导步骤中氧浓度的不同对诱导也会产生影响，即在4％氧浓度环境下的诱导分化率、细胞突出数目均较在8％氧浓度环境下高，而细胞突出长度则较长。随后，同样应用免疫组化染色法对各种方法获得的多巴胺能神经元进行多巴胺能神经元样细胞特异性标志物如多巴胺能神经元发育早期的标记物酪氨酸羟化酶(th)，发育晚期的标记物多巴胺转运蛋白(dat)以及只有功能性突触才会表达的突触后致密蛋白95(psd-95)进行染色，以观察各种特异性标志物的阳性率。表2诱导后细胞多巴胺能神经元特异性标志物的阳性率由表2可看出，经实施例1.1～1.6所述的各方法诱导后获得的神经细胞的dat、th及psd-95阳性率均显著高于对比例一、二，且于实施例1.1～1.5中，在其他诱导条件相同的情况下，采用结构式(ⅳ)的黄酮化合物进行诱导后具有较好的dat、th及psd-95阳性率；同时根据实施例1.4与实施例1.5对比可发现，在同样采用结构式(ⅳ)的黄酮化合物诱导的情况下，预诱导步骤环境中的氧浓度不同也会对诱导后多巴胺能神经元特异性标志物的阳性率产生影响。综上所述，本发明所述的脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，黄酮化合物的加入与低氧环境的配合可明显诱导脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化，且诱导后得到的细胞高表达th、dat以及psd-95等多巴胺能神经元特异性标志物，说明在低氧环境下使用黄酮化合物可以诱导脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元方向定向分化，因而本发明所述的方法可用于制备治疗神经损伤如帕金森病等的原料，具有较好的临床应用前景。当前第1页1 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