一种MKi67基因表达检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及基因检测领域，具体涉及到一种mki67基因表达检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：临床上发现乳腺癌组织学类型和病理分期相同的患者，在临床表现、治疗反应性和预后等方面有相当大的差异，其原因在于乳腺癌存在不同的分子分型。以肿瘤细胞分子表达差异为基础的乳腺癌分子分型的提出对于解决肿瘤的异质性、分期的合理性、预后判断的准确性及乳腺癌的个体化治疗将提供重要的依据。luminala型乳腺癌病理ihc表达情况为：er/pr阳性，且pr高表达(≥20％)，her2阴性，ki-67低表达。luminala型是乳腺癌中预后最好的1个亚型，以早期患者居多，复发风险较低。治疗方面，luminala型对内分泌治疗敏感。luminalb型乳腺癌分为两种，病理ihc表达情况分别为：luminalb(her-2阴性)，er和(或)pr阳性，her-2阴性，ki-67高表达；luminalb(her-2阳性)，er和(或)pr阳性，her-2过表达或增殖ki-67任何水平。luminalb型多见于高龄乳腺癌患者，此亚型也属于内分泌治疗敏感的肿瘤，但由于her-2阳性，对他莫昔芬的疗效较luminala型差，对芳香化酶抑制剂的效果较好，部分患者可进行分子靶向治疗。肿瘤增殖活性是其侵袭能力的重要指标，而且与患者的化疗敏感性密切相关。ki-67的表达会影响乳腺癌的分子分型，是区分luminala型和luminalb型的关键指标，因此成为乳腺癌临床诊疗中的重要指标。目前常用的乳腺癌分型方法是利用免疫组织化学(ihc)这种在病理科进行的半定量的方法，用抗体对肿瘤组织中er、pr、her-2以及ki-67这四种蛋白进行检测。但根据美国临床肿瘤学会(asco)和美国病理医生协会(cap)的联合研究，由于受免疫组织化学技术本身所限，每五个乳腺癌患者就有一个可能由于ihc检测不准确而接受了错误的治疗方案：且目前使用的ki67免疫组织化学(ihc)检测无法进行有效的实验室质量控制，即使在全世界最好的几个病理实验室之间也存在着相当大的不一致性，使得免疫组化ki-67检测的准确性和临床参考意义大打折扣。技术实现要素：本发明提供了检测mki67基因表达的引物、探针。该引物、探针能够检测mki67基因表达水平，灵敏度高，特异性强。本发明还提供了一种mki67基因表达检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测mki67基因表达水平。本发明还提供了使用上述试剂盒检测mki67基因表达的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，检测结果真实可靠且易于推广等优点。本发明包括如下内容：一种mki67基因表达检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括引物与探针；所述的针对mki67基因mrna引物组为如下引物组中的至少一组：：mki67-fo：agccagcacgtcgtgtctc；mki67-re：taggccttggaatcttgagctt；所述的相对应的探针为：mki67-pr：fam-ctagcttctcttctgaccctg-mgb。优选地，所述的mki67基因表达检测试剂盒还包括针对内参calm2基因和b2m基因mrna检测的引物与相对应的探针：所述的引物为：calm2-fo：ataaggatggcaatggctatattagt；calm2-re：ttccctgatcatttcatcaacttc；b2m-fo：acagcccaagatagttaagtggg；b2m-re：aagcagaatttggaattcatcca；所述的检测探针如下：calm2-pr:hex-cttcgccatgtgatgaca-mgb；b2m-pr:cy5-atgtaagcagcatcatgga–mgb。优选地，所述的mki67基因表达检测试剂盒包括针对mki67基因mrna引物组：mki67-fo：agccagcacgtcgtgtctc；mki67-re：taggccttggaatcttgagctt；所述的相对应的探针为：mki67-pr：fam-ctagcttctcttctgaccctg-mgb。一种mki67基因表达检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括针对mki67基因mrna和内参calm2基因和b2m基因mrna检测的引物以及探针，所述的检测引物如下：mki67-fo：agccagcacgtcgtgtctc；mki67-re：taggccttggaatcttgagctt；calm2-fo：ataaggatggcaatggctatattagt；calm2-re：ttccctgatcatttcatcaacttc；b2m-fo：acagcccaagatagttaagtggg；b2m-re：aagcagaatttggaattcatcca；所述的检测探针如下：mki67-pr：fam-ctagcttctcttctgaccctg-mgb；calm2-pr:hex-cttcgccatgtgatgaca-mgb；b2m-pr:cy5-atgtaagcagcatcatgga–mgb。优选地，所述的mki67基因表达检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括mki67探针引物混合液、酶混合液、阴性对照品、阳性对照品；所述的mki67引物探针混合液中0.2-1um引物、0.2-1um探针；所述的酶混合液包括逆转录酶、dna聚合酶、0.25mmdntp、3mmmgcl2、pcrbuffer；所述的阴性对照品为灭菌超纯水；所述的阳性对照品为体外转录的mki67基因、calm2基因和b2m基因片段rna混合液。一种检测mki67基因表达的方法，所述的检测方法包括使用mki67基因表达的引物、探针或检测mki67基因表达的试剂盒检测mki67基因表达的步骤；所述检测方法采用多重荧光定量pcr技术进行mki67基因表达的检测，具体步骤如下：步骤一、提取待检的肿瘤样本rna，作为检测模板；步骤二、体系配制根据待检测样本数(含1个阳性对照和1个阴性对照)，计算并配制反应混合液，将配制好的检测反应液分别分装到八联pcr反应管；步骤三、分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应pcr反应管中；步骤四、进行多重荧光定量pcr检测，多重pcr扩增程序为：50℃10分钟；94℃10分钟；94℃30秒，60℃30秒收集荧光信号，50个循环；步骤五、检测数据分析mki67基因定量结果以40-δδcq公式进行处理，获得代表每个患者样本mki67基因表达水平的分值。与现有技术相比，本发明有以下优点：(1)灵敏度高：可以在100000拷贝野生型基因组dna背景下准确检出0.01％放入突变dna；(2)特异性高：能耐受100000拷贝的野生型基因组dna，而不出现非特异性扩增；(3)使用多重荧光定量pcr技术进行检测，检测过程均为闭关反应，且添加防污染系统和内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行突变检测，确保结果真实可信；(4)操作简单快速，并且结果判读简单客观，便于分析，适用于大规模推广应用。本发明的具体组分见下表：与现有技术相比，本发明有以下优点：1、所需样本量少，使用多重荧光pcr技术进行检测，含有内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行检测，确保结果真实可信；2、较ihc更加敏感可靠，可以连续定量检测rna，实现自动化、人为误差较小，且操作简便、经济省时、可批量操作，结果判读简单客观，便于分析，比ihc方法更具优越性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明实施例3中阳性对照品检测图；图2为本发明实施例3中肿瘤ffpe组织rna样本mki67基因表达水平检测图；图3为本发明实施例3中肿瘤ffpe组织免疫组化图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明，以下实施例中如无特殊说明，所使用原料来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。实施例1一种检测mki67基因表达的试剂盒根据目标基因序列设计特异性引物，设计的引物和探针可以按照现有方法进行人工合成。具体引物如下所示：mki67-fo：agccagcacgtcgtgtctcmki67-re：taggccttggaatcttgagcttcalm2-fo：ataaggatggcaatggctatattagtcalm2-re：ttccctgatcatttcatcaacttcb2m-fo：acagcccaagatagttaagtgggb2m-re：aagcagaatttggaattcatccamki67-pr：fam-ctagcttctcttctgaccctg-mgbcalm2-pr:hex-cttcgccatgtgatgaca-mgbb2m-pr:cy5-atgtaagcagcatcatgga-mgb本发明提供的一种mki67基因表达检测试剂盒包含以下四组分，分别为：mki67引物混合液：包含用于检测mki67、calm2和b2m基因表达的特异性引物和探针。引物和探针为如上所述序列。酶混合液包括逆转录酶、dna聚合酶、pcrbuffer、mgcl2和dntps。阳性对照品为体外转录的mki67基因、calm2基因和b2m基因片段rna混合液；阴性对照品为灭菌超纯水。实施例2mki67基因表达检测方法采用本发明实施例1的试剂盒检测mki67基因表达，包括以下步骤：(1)待测样本处理和模板提取；取石蜡包埋肿瘤组织按照提取试剂盒说明书提取rna。提取的rna稀释到20ng/μl后作为pcr扩增模板。(2)体系配制将试剂盒中所有组分冰上融化，根据待检测样本数，计算并配制pcr反应混合液(见表2)。表2pcr反应液配制公式将pcr反应工作液按20μl/孔加入到pcr反应管，将待检样本rna、阳性对照品和阴性对照品分别以5μl/孔加入到对应pcr反应管中，进行pcr扩增。(3)pcr扩增pcr扩增程序见表3表3pcr扩增程序(4)结果判定阈值设定：根据不同机型设定阈值。ct值确定：选择std反应管，ntc和样品反应管一并划定阈值，得到mki67和内参cq值。阴性无模板空白对照(ntc)应无扩增曲线升起；mki67基因定量结果以40-δδcq公式进行处理，获得代表每个患者样本mki67基因表达水平的分值δδcq＝δcq样本-δcq阳性对照品δcq样本＝cq样本her2-cq样本calm2+b2m平均值δcq阳性对照＝cq阳性对照mki67-cq阳性对照calm2+b2m平均值40-δδcq≥41阳性，mki67基因表达阳性40-δδcq＜41阴性，mki67基因表达阴性实施例3检测方法的实际应用采用本发明试剂盒和检测方法检测肿瘤患者mki67基因表达，方法如下：(1)待检样本的处理一例肿瘤ffpe组织采用rna提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取样本rna。将rna浓度分别稀释至20ng/μl备用。(2)体系配制将试剂盒中所有组分冰上融化，根据待检测样本数，计算并配制pcr反应混合液(见表4)。表4pcr反应液配制表序号组分加入量(μl)1mki67引物混合液5.5×32pcr预混液12.5×33无核酸酶纯水2×3将pcr反应工作液按20μl/孔加入到pcr反应管，将待检的肿瘤ffpe组织rna、阳性对照品和阴性对照品分别以5μl/孔加入到对应pcr反应管中，进行pcr扩增。(3)pcr扩增pcr扩增程序见表5表5pcr扩增程序(4)结果分析阳性对照品及肿瘤ffpe组织样本检测结果见图1-2，具体检测cq见表6。根据公式计算40-δδcq＝40-(δcq样本-δcq阳性对照品)＝40-(-8.48)＝48.48＞41根据40-δδcq值判定该样本为mki67阳性，结果与免疫组化结果符合。表6检测cq值此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其原料试剂名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属
技术领域：
的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。当前第1页12