用于结直肠癌检测的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术及医学领域，尤其涉及一种用于结直肠癌检测的试剂盒及其应用。
背景技术：
：癌症已成为威胁人类健康的最大杀手，2018年中国癌症数据统计显示：2014年全国新发患癌人数为380.4万例，较2013年增加12万例，增幅为3.2％。另据wanqingchen在其发表的《cancerstatisticsinchina,2015》中预测，2015年，我国新增患癌人数将达到429.2万例，而新增癌症死亡病例将达到281.4万例。结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，早期并无显著症状，病人无明显异常改变，因此导致很多患者错过了最佳诊疗时间，而一旦确诊则已处于癌症中晚期。据2018年中国癌症数据统计显示，我国结直肠癌发病率分居男女所有癌症发病率的第四和第三。美国的结直肠癌发病率高于我国，但考虑到人口基数的因素，我国的结直肠癌患者的数量是无比庞大的，几乎占到了全世界范围的1/4。据who统计显示：美国结直肠癌早期发现率达到39％，患者的5年生存率则高达65％；但在我国，结直肠癌早期发现率仅为10％，而患者的5年生存率更是只有32％。这种发现率低、死亡率高，究其原因在于我们的预防意识弱，筛查技术发展缓慢，筛查人群覆盖率低等。因此，提升我国的结直肠癌早期筛查技术、普及民众自我预防意识、加大城乡筛查覆盖范围显得尤为迫切。dna甲基化是指在甲基转移酶的催化下，dna的cg两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-cg-3'序列。dna甲基化能引起染色质结构、dna构象、dna稳定性及dna与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。大量研究表明，抑癌基因启动子区域的甲基化与结直肠癌的发生呈现出密切的相关性，这为我们开发新的结直肠癌筛查技术提供了理论基础。fda已经于2014年批准产品cologuard用于结直肠癌筛查，但该产品主要面向北美地区的人群。cfda也已经批准血液中sept9的甲基化水平可用于结直肠癌的辅助诊断。目前已有血液sept9甲基化检测产品的上市，但其灵敏度还有待提高。临床上，结直肠癌诊断的金标准是肠镜检查加组织病理切片确诊。在进行肠镜检查之前，受检人需要禁食并进行肠道清理，同时该方法是侵入性的，具有感染及创伤风险。在我国，由于民众的癌症筛查意识不够高，且对肠镜检查存在较大的抵制心理，因此主动进行肠镜检查的多为明显出现肠道不适的人，这导致大多数的肠癌患者一旦确诊即已进入癌症中晚期，错过了最佳的治疗时间。其他类型的结直肠癌检测手段还包括粪便隐血检测、蛋白类标志物检测等，但受限于灵敏度，这些方法并不能高效准确的对结直肠癌进行筛查。粪便自肠道形成并经肝门排出体外，其中存在着大量的肠道组织脱落细胞。对粪便当中人源性核酸进行检测，根据相关基因是否存在甲基化，以此对受检者进行患癌风险评估，并通过金标准进行确诊。粪便样本检测的核酸直接来源于肠道，相较于血液检测而言性能更灵敏、反映更直观；相较于肠镜检查的复杂繁琐，粪便取样无创、方便，更加容易被受检者接受，因此有利于结直肠癌筛查的大范围展开。目前，我国针对结直肠癌相关基因甲基化检测的产品只有基于血浆样本的sept9甲基化检测，其特异性虽然很高，但是敏感性远不能达到临床所需。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于结直肠癌检测的试剂盒，具有高灵敏度、高特异性等优势。还提供了该试剂盒在见检测结直肠癌中的应用，以粪便样本作为检测样本，取样方便，能够有效提升进展期腺瘤及早期结直肠癌的发现率。一种用于结直肠癌检测的试剂盒，包括引物组合物、探针组合物；所述引物组合物包括用于检测sept9基因的引物对bs-s9-f和bs-s9-r、用于检测ndrg4基因的引物对bs-n4-f和bs-n4-r、用于检测sdc2基因的引物对bs-sdc2-f和bs-sdc2-r、用于检测actb基因的引物对bs-act-f和bs-act-r，所述bs-s9-f的dna序列如seqidno.1所示，所述bs-s9-r的dna序列如seqidno.2所示，所述bs-n4-f的dna序列如seqidno.3所示，所述bs-n4-r的dna序列如seqidno.4所示，所述bs-sdc2-f的dna序列如seqidno.5所示，所述bs-sdc2-r的dna序列如seqidno.6所示，所述bs-act-f的dna序列如seqidno.7所示，所述bs-act-r的dna序列如seqidno.8所示；所述探针组合物包括bs-s9-p、bs-n4-p、bs-sdc2-p和bs-act-p，所述bs-s9-p的dna序列如seqidno.9所示，所述bs-n4-p的dna序列如seqidno.10所示，所述bs-sdc2-p的dna序列如seqidno.11所示，所述bs-act-p的dna序列如seqidno.12所示。上述的试剂盒，优选的，所述试剂盒还包括封闭序列组合物，所述封闭序列组合物包括bs-s9-c、bs-n4-c和bs-sdc2-c，所述bs-s9-c的dna序列如seqidno.13所示；所述bs-n4-c的dna序列如seqidno.14所示；所述bs-sdc2-c的dna序列如seqidno.15所示。上述的试剂盒，优选的，所述封闭序列组合物中各封闭序列的浓度均为0.1μm。上述的试剂盒，优选的，所述引物组合物中各引物的浓度均为0.2μm。上述的试剂盒，优选的，所述探针组合物中各探针的浓度均为0.15μm。上述的试剂盒，优选的，所述探针组合物中，所述bs-s9-p采用fam和bhq1标记；和/或，所述bs-n4-p采用rox和bhq2标记；和/或，所述bs-sdc2-p采用cy5和bhq2标记；和/或，所述bs-act-p采用hex和bhq1标记。上述的试剂盒，优选的，所述封闭序列组合物中，所述bs-s9-c、所述bs-n4-c和所述bs-sdc2-c均进行磷酸化修饰。上述的试剂盒，优选的，所述试剂盒还包括2x360mastermix、甘油、四甲基氯化铵(tmac)及去离子水。上述的试剂盒，优选的，所述四甲基氯化铵的浓度为10～40mm。上述的试剂盒，优选的，所述甘油的体积浓度为8％～20％。做为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的试剂盒在检测结直肠癌中的应用。上述的应用，优选的，所述应用方法包括以下步骤：(1)将粪便样本溶解于粪便样本保护液中，进行粪便dna提取；(2)将提取的所述粪便dna进行重亚硫酸盐转化得到甲基化处理的粪便dna；(3)将所述甲基化处理的粪便dna用试剂盒进行荧光定量pcr检测，以sept9、ndrg4、sdc2、actb的扩增ct值，按照逻辑回归公式计算p值，所述逻辑回归公式为：p＝escore/(1+escore)，score＝w1×ct1+w2×ct2+w3×ct3+w4×ct4+b；其中，p为结直肠癌风险指数，e为自然常数，w1为-0.14867，w2为-0.12201，w3为-0.21562，w4为0.20329，b为13.68188；ct1为sept9扩增ct值，ct2为ndrg4扩增ct值，ct3为sdc2扩增ct值，ct4为actb扩增ct值；当p值大于或等于0.362时，判断为阳性；小于0.362时，判断为阴性。上述的应用，优选的，所述荧光定量pcr检测的反应程序为：50℃2min；95℃预变性10min；然后以95℃变性15s，60℃退火30s为一个循环，进行45次；最后在20℃保持2min。上述的应用，优选的，所述粪便样本保护液的成分包括：0.25m～0.8m的tris-hcl、1.0m～4.0m的异硫氰酸胍、5mm～20mm的edta、0.1m/v％～0.5m/v％的十二烷基硫酸钠(sds)、0.5v/v％～3v/v％的曲拉通x-100、0.5v/v％～3v/v％的吐温20、3v/v％～10v/v％的甘油。进一步的，所述粪便样本保护液的成分包括：0.5m的tris-hcl、1.5m的异硫氰酸胍、10mm的edta、0.2m/v％的十二烷基硫酸钠(sds)、1v/v％的曲拉通x-100、1v/v％的吐温20、5v/v％的甘油。本发明的检测原理：核酸序列中未甲基化的胞嘧啶(c)经亚硫酸氢盐处理后，被转化为尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶则不会被转化，针对甲基化基因转化后的序列进行引物探针的设计，该引物探针只能扩增甲基化基因转化后的核酸，而非甲基化基因转化后的核酸则不会被扩增。为了进一步避免非特异扩增造成的假阳性结果，本发明加入了与非甲基化基因转化后序列互补配对的3’末端磷酸化修饰的寡核苷酸序列，该序列能阻断扩增引物与非甲基化核酸转化序列的结合，从而起到提升检测特异性的作用。与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提供了一种用于结直肠癌检测的试剂盒，本申请采用sept9、ndrg4、sdc2联合检测，采用actb管家基因作为内标，以此监控样本中的人源性核酸含量；管家基因扩增片段是一段非甲基化序列，采用该扩增片段做内标，可以充分监测检测时所加入的样本所含人源性核酸的总量，可以防止检测结果出现假阳性或假阴性。sept9、ndrg4、sdc2三个基因的甲基化为结直肠癌患者中最为常见的基因甲基化，但三者并不一定同时甲基化，因此采用联合检测的方式可以有效提升阳性检出率，降低假阴性，提升检测的灵敏度。本申请的试剂盒，灵敏度高、特异性高，能够有效提升进展期腺瘤及早期结直肠癌的发现率，从而阻止结直肠癌的发生或根治结直肠癌，提升病人的5年生存率。(2)本发明提供了一种用于结直肠癌检测的试剂盒，提供了对非甲基化序列进行屏蔽的封闭序列，可以提升检测试剂的特异性。(3)本发明提供了一种用于结直肠癌检测的试剂盒，针对转化过程中，未甲基化的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，导致扩增区域的鸟嘌呤(g)和胞嘧啶(c)的比例大大降低，导致扩增效率的降低，本发明在反应体系中加入四甲基氯化铵(tmac)、丙三醇(甘油)，用以提升特异性扩增效率。(4)本发明提供了一种用于结直肠癌检测的试剂盒，检测体系为4联检检测试剂，采用的是实时荧光定量pcr技术，四个检测基因采用不同的荧光标记，便于区别，提高检测的准确率。(5)本发明提供了一种用于结直肠癌检测的试剂盒在检测结直肠癌中的应用，以粪便样本作为检测样本，用于结直肠癌辅助诊断或筛查，取样方便、属于无创检测，能够提升受检者的接受程度，有利于扩大结直肠癌筛查的覆盖人群，降低中国结直肠癌的发生率，为全民健康提供保障。附图说明为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。图1为实施例1的试剂盒的原理示意图。图2为实施例2中模型roc曲线分析结果图。图3为实施例3中样本检测内标曲线示意图。图4是实施例3中阳性样本检测曲线示意图。图5为实施例4中未加封闭序列时野生型扩增曲线。图6为实施例4中加入封闭序列及添加剂时野生型扩增曲线。图7为实施例5中内标actb检测曲线，dna含量为10ng/反应。图8为实施例5中sept9灵敏度检测曲线(10ng/反应，含1％sept9甲基化)。图9为实施例5中ndrg4灵敏度检测曲线(10ng/反应，含1％ndrg4甲基化)。图10为实施例5中sdc2灵敏度检测曲线(10ng/反应，含1％sdc2甲基化)。具体实施方式以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。实施例1：一种本发明的用于结直肠癌检测的试剂盒，包括引物组合物、探针组合物和封闭序列组合物、2x360mastermix、四甲基氯化铵(tmac)、甘油和去离子水。其中引物组合物的组分列于表1中。表1：实施例1的引物组合物bs-s9-f5’-tttgtattgtaggagcgcgggc-3’(seqidno.1)bs-s9-r5’-caacgacgaaaaaacgcccccg-3’(seqidno.2)bs-n4-f5’-gtttcgcgtcgcggttttcgttc-3’(seqidno.3)bs-n4-r5’-cgtaacttccgccttctacgcg-3’(seqidno.4)bs-sdc2-f5’-agaaattaataagtgagagggcgtcgc-3’(seqidno.5)bs-sdc2-r5’-aacgctcgcttcctcctcctacg-3’(seqidno.6)bs-act-f5’-gaaagggtgtagttttgggaggttag-3’(seqidno.7)bs-act-r5’-cccaaaaccaaccacaaaaaaat-3’(seqidno.8)表1中，引物对bs-s9-f和bs-s9-r用于扩增sept9基因；引物对bs-n4-f和bs-n4-r用于扩增ndrg4基因；引物对bs-sdc2-f和bs-sdc2-r用于扩增sdc2基因，引物对bs-act-f和bs-act-r用于扩增actb基因。探针组合物的组分列于表2中。表2：实施例1的探针组合物表2中，bs-s9-p探针用于识别sept9基因，bs-n4-p用于识别ndrg4基因；bs-sdc2-p用于识别sdc2基因，bs-act-p用于识别actb基因。封闭序列组合物的组分列于表3中。表3：实施例1的封闭序列组合物bs-s9-c5’-tttgtattgtaggagtgtgggt-3’磷酸化修饰(seqidno.13)bs-n4-c5’-gttttgtgttgtggtttttgttc-3’磷酸化修饰(seqidno.14)bs-sdc2-c5’-agaaattaataagtgagagggcgtcgc-3’磷酸化修饰(seqidno.15)表3中，bs-s9-c用于封闭sept9基因，bs-n4-c用于封闭ndrg4基因；bs-sdc2-c用于封闭sdc2基因。图1是实施例1的试剂盒的运作原理：当目的基因未甲基化时，封闭序列优于引物与其转化后的序列结合，从而阻断引物与野生型转化序列的结合。当目的基因存在甲基化，引物和探针与其转化后的序列结合，pcr过程中，在dna聚合酶5’到3’端外切酶活性的作用下，探针5’端的荧光报告基团(fam、rox、cy5、hex)与3’端淬灭基团(bhq1、bhq2)分离，产生荧光信号；若样本中目的基因不存在甲基化，则引物和探针无法与模板结合，不存在扩增反应，因此不会产生荧光信号。实施例2：一种实施例1的试剂盒在检测结直肠癌中的应用，其应用方法包括以下步骤：采样：采集5～8g粪便样本至于15ml的粪便样本保护液中，粪便样本保护液的成分列于表4中。表4：粪便样本保护液成分表组分浓度tris-hcl0.5m异硫氰酸胍1.5medta10mm十二烷基硫酸钠sds0.2％(m/v)曲拉通x-1001％(v/v)吐温201％(v/v)甘油5％(v/v)(2)提取：采用人和未来生物科技(长沙)有限公司的金麦格粪便基因组提取试剂盒(磁珠法)进行提取，具体步骤如下：2.1、将粪便样本(约20ml)充分振荡混匀至匀浆状态，3000g离心15min，转移10ml上清至另一50ml离心管中，剩余样本保存备用。2.2、在离心管中加入10mllysisbuffer，颠倒混匀，55℃水浴孵育20min。2.3、加入30μlacrylcarrier，240μl蛋白酶k，60μl磁珠，在垂直混匀仪中混匀30min。2.4、3000g离心3min，将上清倒入废液缸，余留约1.8ml上清。2.5、将剩余溶液及磁珠充分混匀后，转移至另一2ml离心管中，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清。2.6、加入800μlwashbuffer1，充分振荡混匀，静置1min，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清。2.7、加入500μlwashbuffer2，充分振荡混匀，静置1min，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清。2.8、重复步骤2.7，吸弃残液。2.9、加入800μlwashbuffer3，静置1min后吸弃上清。2.10、加入60μlelutionbuffer，55℃水浴15min。2.11、高速瞬时离心，置于磁力架上吸附至溶液澄清，吸取上清至新的离心管中，所得即为提取的dna。(3)转化：采用zymo公司的转化试剂盒ez-96dnamethylation-goldmagprep(货号：d5042)对提取的粪便dna进行重亚硫酸盐转化及纯化。转化处理是使未甲基化的c转化为u，从而使得甲基化序列与未甲基化序列在转化后得以存在序列上的差异，从而进行检测，二者在未进行转化处理的时候其序列是相同的。sept9野生型转化前序列(seqidno.16)：ttcattcagctgagccagggggcctaggggctcctccggcggctagctctgcactgcaggagcgcgggcgcggcgccccagccagcgcgcagggcccgggccccgccgggggcgcttcctcgccgctgccctccgcgcgacccgctgcccaccagccatcatgtcggaccccgcggtcaacgcgcagctggatgggatcatttcggacttcgaaggtgggtgctgggctggctgctgcggccgcggacgtgctggagaggaccctgcgggtgggcctggcgcgggacgggggtgcgctgaggggagacgggagtgcgctgaggggagacgggac。sept9甲基化基因转化后序列(seqidno.17)：tttatttagttgagttagggggtttaggggttttttcggcggttagttttgtattgtaggagcgcgggcgcggcgttttagttagcgcgtagggttcgggtttcgtcgggggcgttttttcgtcgttgtttttcgcgcgattcgttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaacgcgtagttggatgggattatttcggatttcgaaggtgggtgttgggttggttgttgcggtcgcggacgtgttggagaggattttgcgggtgggtttggcgcgggacgggggtgcgttgaggggagacgggagtgcgttgaggggagacgggat。ndrg4甲基化基因转化前序列(seqidno.18)：gggcctcgcagcgcacccagcacagtccgcgcggcggagcgggtgagaagtcggcgggggcgcggatcgaccggggtgtcccccaggctccgcgtcgcggtccccgctcgccctcccgcccgcccaccgggcaccccagccgcgcagaaggcggaagccacgcgcgagggaccgcggtccgtccgggactagccccaggcccggcaccgccccgcgggccgagcg。ndrg4甲基化基因转化后序列(seqidno.19)：gggtttcgtagcgtatttagtatagttcgcgcggcggagcgggcgagaagtcggcgggggcgcggatcgatcggggtgttttttaggtttcgcgtcgcggttttcgttcgttttttcgttcgtttatcgggtattttagtcgcgtagaaggcggaagttacgcgcgagggatcgcggttcgttcgggattagttttaggttcggtatcgtttcgcgggtcgagcg。sdc2甲基化基因转化前序列(seqidno.20)：tccgcggaggagcaaaaccacagcagagcaagaagagcttcagagagcagccttcccggagcaccaactccgtgtcgggagtgcagaaaccaacaagtgagagggcgccgcgttcccggggcgcagctgcgggcggcgggagcaggcgcaggaggaggaagcgagcgcccccgagccccgagcccgagtccccgagcctgagccgcaatcgctgcggtactctgctccggattcgtgtgcgcgggctgcgccgagcgctgggcaggaggcttcgttttgccctggttgcaagcagcggctgggagcagccggtccctggggaatatgcggcgc。sdc2甲基化基因转化后序列(seqidno.21)：ttcgcggaggagtaaaattatagtagagtaagaagagttttagagagtagttttttcggagtattaatttcgtgtcgggagtgtagaaattaataagtgagagggcgtcgcgttttcggggcgtagttgcgggcggcgggagtaggcgtaggaggaggaagcgagcgttttcgagtttcgagttcgagttttcgagtttgagtcgtaatcgttgcggtattttgtttcggattcgtgtgcgcgggttgcgtcgagcgttgggtaggaggtttcgttttgttttggttgtaagtagcggttgggagtagtcggtttttggggaatatgcggcgt。(4)检测：取5μl经步骤(3)转化后的核酸进行荧光定量pcr检测，检测体系总体积为30μl，具体如下成分列于下表5中。表5：检测体系的组分及用量表组分用量2x360mastermix15μl各引物0.2μm各探针0.15μm四甲基氯化铵20mm甘油10％(v/v)各封闭序列0.1μm去离子水4.2μl模板5μl扩增程序为：50℃预变性2min；95℃变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，荧光采集(从第一个循环开始采集荧光)，循环45次；20℃，2min。(5)结果分析：以肠镜检测大致正常为阴性，肠镜检出息肉并通过病理检测验证为腺瘤或癌症为阳性，作为检测的金标准对照。挑选100例粪便样本，其中阳性样本50例，阴性样本50例。以sept9、ndrg4、sdc2、actb的扩增ct值为输入进行逻辑回归拟合。所用逻辑回归公式如下：p＝escore/(1+escore)，score＝w1×ct1+w2×ct2+w3×ct3+w4×ct4+b。其中，p为结直肠癌风险指数，e为自然常数，w1，w2，w3，w4，b为常数，ct1为sept9扩增ct值，ct2为ndrg4扩增ct值，ct3为sdc2扩增ct值，ct4为actb扩增ct值。通过100例临床样本确定其中的w1，w2，w3，w4，b的具体数值，并通过roc曲线分析选择整体符合率最高的p值作为判断是否存在结直肠癌风险的阈值，得到预测模型。下表6是100例临床样本确定后，w1，w2，w3，w4，b、p的具体数值。表6：w1，w2，w3，w4，b、p的具体数值表w1w2w3w4b-0.14867-0.12201-0.215620.2032913.68188图2为模型roc曲线分析结果。从图2中可知：当p值选择为0.362时，能得到最高的准确率，其中，灵敏度为0.962，特异性为0.732，所以设定阈值为0.362。当样本检测计算达到的p值大于或等于0.362时，判断为阳性；小于0.362时，判断为阴性。实施例3：考察实施例2的方法的灵敏度、特异性和准确率。以实施例2的预测模型为基础，在90例新增检测样本中进行预测，并与实际值进行比对，得到样本混淆矩阵。下表7为样本矩阵。表7：样本矩阵表根据表7的预测值与实际值计算本申请的预测模型的灵敏度、特异性和准确率。其中，灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)×100％；特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)×100％；准确率＝(真阳性+真阴性)/检测总数×100％。从表7的结果可知，实施例2的预测模型，灵敏度为0.8857；特异性为0.8909；准确率为0.8889；kappa为0.7686。图3是样本检测内标曲线示意图；图4是阳性样本检测曲线示意图。实施例4：特异性检测由于野生型核酸与甲基化核酸转化后，依然具有极高的相似程度，引物探针仍旧能够结合野生型的模板，可能造成非特异扩增。本实施例考察未添加封闭序列和添加了封闭序列的两种试剂盒，其特异性结果。图5为未加封闭序列时野生型扩增曲线；图6为加入封闭序列及添加剂时野生型扩增曲线。从图5中可以看出：当未添加封闭序列时，扩增纯野生型序列会存在微弱的非特异扩增。从图6中可以看出：加入封闭序列及添加剂后，非特异扩增得以消除，并且不影响本发明的最低检测限。实施例5：灵敏度检测按照实施例2的方法，在转化前，取野生型组织样本dna(阴性)，与crc细胞系dna(阳性)，分别稀释到2.5ng/μl。将稀释后的野生型组织样本dna与crc细胞系dna按照体积比为99︰1的比例混合得到混合溶液。然后取50ng混合溶液按照实施例2的方法进行转化，25μl洗脱，再取5μl(即相当于10ng转化前的dna)进行荧光定量pcr检测。检测结果参见图7至图10。图7为内标actb检测曲线图，图8至图10分别为sept9，ndrg4，sdc2的灵敏度扩增曲线图。由图可知，在dna检测含量为10ng/反应，目标基因甲基化比例为1％的情况下，本发明所提供的试剂均能很好的对目标基因进行检出，因此本发明提供的检测试剂其灵敏度可低达10ng/反应中含1％的目标基因甲基化，亦即2ng/μl的核酸样本中含1％目标基因甲基化。实施例6：基因筛选研究选入kras，bmp3，sept9，sdc2，ndrg4共5个基因作为候选结直肠癌筛查标志物，按照实施例2的方法进行检测。在100例临床样本的研究中，采用荧光定量pcr对所有基因进行检测，得到各基因检测的ct值。采用lasso回归进行特征值挑选，结果参见表8。表8：不同结直肠癌筛查标志物考察表基因系数(coefficient)kras0sept9-0.30444915bmp30ndrg4-0.12050771sdc2-0.07247555actb0.14267033从表8中可知，kras和bmp3对模型贡献度为0，所以舍弃kras和bmp3两个标志物。实施例7：标志物组合研究将不同标志物进行组合，考察不同组合的模型以及roc曲线，计算得到相应的auc值，确定最佳的标志物组合。具体组合及考察结果参见下表9。表9：不同标志物组合的模型auc值组合auckras+bmp3+ndrg4+sept9+sdc20.912bmp3+ndrg4+sept9+sdc20.862ndrg4+setp9+sdc20.909setp9+sdc20.701ndrg4+setp90.735从表9中可知：以kras+bmp3+ndrg4+sept9+sdc2组合的模型以及以ndrg4+setp9+sdc2组合的模型，其检测准确率最高，出于简化模型和保证检测准确率的平衡，确定sept9、ndrg4、sdc2联合检测。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。序列表<110>人和未来生物科技（长沙）有限公司<120>用于结直肠癌检测的试剂盒及其应用<160>21<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tttgtattgtaggagcgcgggc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2caacgacgaaaaaacgcccccg22<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtttcgcgtcgcggttttcgttc23<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgtaacttccgccttctacgcg22<210>5<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agaaattaataagtgagagggcgtcgc27<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aacgctcgcttcctcctcctacg23<210>7<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaaagggtgtagttttgggaggttag26<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cccaaaaccaaccacaaaaaaat23<210>9<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cgttttagttagcgcgtagggttcggg27<210>10<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gttttttcgttcgtttatcgggtattttagtcg33<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ttttcggggcgtagttgcgggcgg24<210>12<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cctcttctaataaccacctccctccttcctaac33<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tttgtattgtaggagtgtgggt22<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14gttttgtgttgtggtttttgttc23<210>15<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15agaaattaataagtgagagggcgtcgc27<210>16<211>334<212>dna<213>人(human)<400>16ttcattcagctgagccagggggcctaggggctcctccggcggctagctctgcactgcagg60agcgcgggcgcggcgccccagccagcgcgcagggcccgggccccgccgggggcgcttcct120cgccgctgccctccgcgcgacccgctgcccaccagccatcatgtcggaccccgcggtcaa180cgcgcagctggatgggatcatttcggacttcgaaggtgggtgctgggctggctgctgcgg240ccgcggacgtgctggagaggaccctgcgggtgggcctggcgcgggacgggggtgcgctga300ggggagacgggagtgcgctgaggggagacgggac334<210>17<211>334<212>dna<213>人(human)<400>17tttatttagttgagttagggggtttaggggttttttcggcggttagttttgtattgtagg60agcgcgggcgcggcgttttagttagcgcgtagggttcgggtttcgtcgggggcgtttttt120cgtcgttgtttttcgcgcgattcgttgtttattagttattatgtcggatttcgcggttaa180cgcgtagttggatgggattatttcggatttcgaaggtgggtgttgggttggttgttgcgg240tcgcggacgtgttggagaggattttgcgggtgggtttggcgcgggacgggggtgcgttga300ggggagacgggagtgcgttgaggggagacgggat334<210>18<211>225<212>dna<213>人(human)<400>18gggcctcgcagcgcacccagcacagtccgcgcggcggagcgggtgagaagtcggcggggg60cgcggatcgaccggggtgtcccccaggctccgcgtcgcggtccccgctcgccctcccgcc120cgcccaccgggcaccccagccgcgcagaaggcggaagccacgcgcgagggaccgcggtcc180gtccgggactagccccaggcccggcaccgccccgcgggccgagcg225<210>19<211>225<212>dna<213>人(human)<400>19gggtttcgtagcgtatttagtatagttcgcgcggcggagcgggcgagaagtcggcggggg60cgcggatcgatcggggtgttttttaggtttcgcgtcgcggttttcgttcgttttttcgtt120cgtttatcgggtattttagtcgcgtagaaggcggaagttacgcgcgagggatcgcggttc180gttcgggattagttttaggttcggtatcgtttcgcgggtcgagcg225<210>20<211>333<212>dna<213>人(human)<400>20tccgcggaggagcaaaaccacagcagagcaagaagagcttcagagagcagccttcccgga60gcaccaactccgtgtcgggagtgcagaaaccaacaagtgagagggcgccgcgttcccggg120gcgcagctgcgggcggcgggagcaggcgcaggaggaggaagcgagcgcccccgagccccg180agcccgagtccccgagcctgagccgcaatcgctgcggtactctgctccggattcgtgtgc240gcgggctgcgccgagcgctgggcaggaggcttcgttttgccctggttgcaagcagcggct300gggagcagccggtccctggggaatatgcggcgc333<210>21<211>333<212>dna<213>人(human)<400>21ttcgcggaggagtaaaattatagtagagtaagaagagttttagagagtagttttttcgga60gtattaatttcgtgtcgggagtgtagaaattaataagtgagagggcgtcgcgttttcggg120gcgtagttgcgggcggcgggagtaggcgtaggaggaggaagcgagcgttttcgagtttcg180agttcgagttttcgagtttgagtcgtaatcgttgcggtattttgtttcggattcgtgtgc240gcgggttgcgtcgagcgttgggtaggaggtttcgttttgttttggttgtaagtagcggtt300gggagtagtcggtttttggggaatatgcggcgt333当前第1页12