水稻每穗粒数基因NOG1的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于水稻分子育种领域，具体涉及一种水稻每穗粒数基因nog1的分子标记、引物组合、试剂盒以及检测方法。

背景技术：

水稻是重要的粮食作物，为全球一半的人口提供口粮。随着世界人口的增长，水稻作为主要粮食作物面临着提高产量的迫切需要。预计到2030年，水稻产量需要提高40％以上才能满足人类的需要。水稻的产量主要取决于穗数、每穗粒数和粒重。因此，每穗粒数是水稻最重要的农艺性状之一，直接决定水稻单产，故增加每穗粒数是水稻增产的重要途径。每穗粒数是数量性状，受多个数量性状基因座(quantitativetraitloci,qtl)控制。传统的育种方法主要是通过对水稻的穗型、粒数进行目测选择，以获得具有优良的每穗粒数性状的水稻单株进行杂交选育育种，具有很大的盲目性，效率低，成本高。

分子标记辅助选择(marker-assistedselection,mas)，是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。相对于传统的育种方法的盲目性、效率低和准确度低等缺点，采用mas技术的分子育种则具有高效、快速和准确度高的优势。在水稻育种领域，已经有相关文献公开利用与目的基因紧密连锁或共分离的分子标记进行辅助选择，高效选择水稻每穗粒数的增效基因，可以极大的促进水稻每穗粒数的增效基因在高产水稻育种中的应用。如中国专利文献cn103468674a公开的一种水稻每穗粒数增效基因gn1a的分子标记，该标记可准确、快速地选择每穗粒数性状较好的个体，通过与常规育种相结合，能够在减少成本的情况下大大提高育种效率，同时，对于育种辅助选择的准确性高。

中国农大孙传清和谭禄宾团队于2017年公开了水稻穗粒数相关基因numberofgrains1(nog1)的克隆，过表达nog1可增加水稻穗粒数，该基因对穗数、开花期、结实率、粒重等其它产量相关性状没有影响，颇具应用前景。研究表明，nog1编码烯酰-coa水合酶/异构酶蛋白(enoyl-coahydratase/isomerase)，参与调节茉莉酸水平及脂肪酸的β-氧化，其启动子区域的12bp的插入可以增加ngo1基因的表达量进而增加穗粒数。如在穗粒数较多的桂朝2号等水稻栽培品种中，nog1基因启动子区域中包含两个拷贝的12bp片段，而在穗粒数较少的野生稻中，nog1启动子区域只含有一个拷贝的12bp片段。然而，到目前为止，还没有其他人提供nog1的功能分子标记，以准确、高效鉴定出有利的nog1等位基因以及该基因的标记辅助选择育种。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题在于提出一种水稻每穗粒数基因nog1的分子标记、引物组合、试剂盒以及检测方法。

为此，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种水稻每穗粒数基因nog1的分子标记，通过核苷酸序列如seqidno：1-2所示的引物扩增水稻每穗粒数基因nog1得到或如seqidno：3所示的核苷酸序列。所述的水稻每穗粒数基因nog1的分子标记在水稻辅助选择育种和水稻nog1位点的等位基因分子鉴定的用途。

本发明提供了一种用于检测水稻每穗粒数基因nog1的引物组合，包括核苷酸序列如seqidno：1-2所示的引物。

所述的用于检测水稻每穗粒数基因nog1的引物组合在水稻辅助选择育种和水稻nog1位点的等位基因分子鉴定的用途。

本发明提供了一种用于检测水稻每穗粒数基因nog1的试剂盒，包括核苷酸序列如seqidno：1-2所示的引物。

所述的试剂盒，包括如下pcr反应体系，以10μl为计：

模板dna，1.0μl；

10×pcrbuffer，1.0μl；

mgcl2，浓度为25mm，1.0μl；

dntp，浓度为2mm，1.0μl；

引物组合，浓度为0.3μm，1.0μl；

taq酶，浓度为0.2u；

加ddh2o补至10μl。

所述的用于检测水稻每穗粒数基因nog1的试剂盒在水稻辅助选择育种和水稻nog1位点的等位基因分子鉴定的用途。

本发明提供了一种检测水稻每穗粒数基因nog1的方法，包括如下步骤：

s1、提取待测水稻总dna；

s2、以提取的水稻总dna为模板，利用权利要求1所述的分子标记、权利要求3所述的引物组合或权利要求5-6任一项所述的试剂盒进行pcr扩增；

s3、电泳检测扩增产物，若出现112bp的条带，表示待测水稻含nog1的有利等位基因；如果出现100bp的条带，表示待测水稻不含nog1的有利等位基因。

所述的含nog1的有利等位基因即含有两个拷贝的12bp的nog1基因。

所述的方法，pcr扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，扩增32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供的一种水稻每穗粒数基因nog1的分子标记，通过核苷酸序列如seqidno：1-2所示的引物扩增水稻每穗粒数基因nog1得到或如seqidno：3所示的核苷酸序列；上述的分子标记是针对nog1基因的功能变异序列设计的，为基因功能标记，故不存在遗传交换，不需要作表型鉴定，利用上述分子标记，可以准确、高效鉴定出水稻中nog1位点的有利等位基因，可广泛应用于水稻辅助选择育种和水稻nog1位点的等位基因分子鉴定；

所述分子标记为共显性标记，可鉴别nog1基因座位的杂合体和纯合体，实验重复性好，结果可靠；

利用本发明的分子标记进行辅助选择育种，不仅节约成本，而且能够准确、高效地将nog1的有利等位基因转育到目标品种中去，有效提高水稻产量水平。

2、本发明提供的用于检测水稻每穗粒数基因nog1的引物组合，所述引物组合可以扩增水稻中nog1位点含有功能变异序列的片段，通过电泳检测即可鉴定水稻中nog1位点是否携带有利等位基因，快速、高效、准确度高。

3、本发明提供的用于检测水稻每穗粒数基因nog1的试剂盒，所述试剂盒可以扩增水稻中nog1位点含有功能变异序列的片段，通过电泳检测即可鉴定水稻中nog1位点是否携带有利等位基因，快速、高效、准确度高。

4、本发明提供的检测水稻每穗粒数基因nog1的方法，利用上述的引物组合或试剂盒可扩增水稻中nog1位点的含有功能变异序列的片段，通过电泳检测即可鉴定出水稻nog1位点是否携带有利等位基因，快速、高效、准确度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例3中对32个水稻材料的基因型检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的试剂、材料或仪器均为市售产品。

下述实施例中涉及的引物为南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

凝胶电泳仪，琼脂糖水平电泳仪(dycp-32c)，北京六一生物科技有限公司。

表1中的水稻品种收集自江西省农业科学院水稻研究所种质资源库。

实施例1

根据桂朝2号和日本晴两水稻的每穗粒数基因nog1基因在启动子12bp的序列差异，设计了如下分子标记的引物组合nog1-m1，正、反引物序列分别如seqidno：1和seqidno：2所示，具体的序列如下：

正向引物(5′-3′)f：agagagcacccaagagtt；

反向引物(5′-3′)r：tgagtagttaggatggcaac。

所述的水稻每穗粒数基因nog1的分子标记，通过上述的核苷酸序列如seqidno：1-2所示的引物扩增水稻每穗粒数基因nog1得到。扩增桂朝2号得到的水稻每穗粒数基因nog1的分子标记的序列如seqidno：3所示，具体的序列如下：

agagagcacccaagagttaatcagatattggcaacagggaaaaaaagggaaccaaattaactgttggtaacctcggcaaagttgccatcaaagttgccatcctaactactca。上述划横线处为桂朝2号nog1基因启动子区域中包含的第一个12bp片段，第二个拷贝紧随其后。

上述的分子标记以及引物组合可以广泛地鉴别出不同品种的水稻是否含有nog1的有利等位基因。

实施例2

本实施例提供的用于检测水稻每穗粒数基因nog1的试剂盒，包括核苷酸序列如seqidno：1-2所示的引物。

进一步的，还包括如下pcr反应体系，以10μl为计：

模板dna，1.0μl；

10×pcrbuffer，1.0μl；

mgcl2，浓度为25mm，1.0μl；

dntp，浓度为2mm，1.0μl；

引物组合，浓度为0.3μm，1.0μl；

taq酶，浓度为0.2u；

加ddh2o补至10μl。

实施例3

本实施例提供了一种检测水稻每穗粒数基因nog1的方法，包括如下步骤：

s1、提取待测水稻总dna，包括如下步骤：

1)供试材料见下表1：

表1供检测nog1的32份水稻材料

2)dna提取

在苗期取水稻叶片，基因组dna的提取参照scott等(1988)的ctab法改进，具体如下：

1、取约0.1g叶片，置于2.0ml离心管中，加入1粒钢珠及500μl2×ctabdna提取液(即取20gctab，12.1g的tris-base，7.44g的edta-na，81.9g的nacl，溶解于1l蒸馏水中，即得)，使用组织研磨仪打碎叶片，65℃温浴30min，期间振动混匀数次；

2、从水浴中取出离心管，加入约500μl氯仿(chcl3)，充分震荡混匀，在10000rpm下离心5min；

3、转移上清液至一新的1.5ml的离心管中，加入上清体积2倍的无水乙醇，将离心管轻微混匀后于-20℃冰箱中放置半小时后，10000rpm离心5min；

4、弃上清液，倒置于干净的吸水纸上自然晾干；

5、晾干后的dna加双蒸水溶解，调节最终浓度为100～1000ng/μl，置于－20℃冰箱内保存备用。

s2、以提取的水稻总dna为模板，利用实施例2的试剂盒进行pcr扩增；

pcr反应体系如下：

模板dna，1.0μl；

10×pcrbuffer，1.0μl；

mgcl2，浓度为25mm，1.0μl；

dntp，浓度为2mm，1.0μl；

引物组合，浓度为0.3μm，1.0μl；

taq酶，浓度为0.2u；

加ddh2o补至10μl。

pcr扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，扩增32个循环；72℃延伸5min，16℃保存。

s3、电泳检测扩增产物，pcr反应产物在3.5％琼脂糖凝胶中电泳，经gel-red染色后在凝胶成像仪上拍照。检测的结果如图1所示，m为dnamarker，1～32水稻材料信息见表1，由图中可看出，桂朝2号等15个品种(1-15)扩增出预期的112bp的片段，日本晴等15个品种(16-30)扩增出100bp的片段，在2份籼粳交f1(31-32)中扩增出含有双亲条带的杂合带型，电泳谱带清晰、特异，表明利用本发明的分子标记可以鉴别出水稻中nog1位点是否含有有利等位基因，并且可以很好地区分nog1基因座上的两种等位基因型，可用于水稻穗粒数基因nog1的标记辅助选择育种。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

sequencelisting

<110>江西省超级水稻研究发展中心

<120>水稻每穗粒数基因nog1的分子标记及其应用

<130>nha201800302

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<170>patentinversion3.3

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<213>人工合成（nog1-m1-f）

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tgagtagttaggatggcaac20

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<212>dna

<213>人工合成（artificialsynthesis）

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ctgttggtaacctcggcaaagttgccatcaaagttgccatcctaactactca112