一种基于嵌合体序列设计和分子信标的荧光检测金黄色葡萄球菌的方法与流程

本发明涉及一种基于嵌合体序列设计和分子信标的荧光检测金黄色葡萄球菌的方法，可以对环境中金黄色葡萄球菌含量进行高灵敏的测定，属于分析化学、食品安全和发酵分析及环境污染检测领域。

背景技术：

金黄色葡萄球菌被认为是对公众健康最重大的威胁之一，可引起各种感染，包括食物中毒，急性肺炎，骨髓炎，败血症，烫伤皮肤综合症等。此外，由于其多重抗性和毒力，增加了人们感染的风险，因此金黄色葡萄球菌的检测已成为各国关注的焦点。金黄色葡萄球菌检测的标准方法，如金黄色葡萄球菌国标检测方法（gb4789.10-2010），金黄色葡萄球菌petrifilmtm测试片法（sn/t1895-2007），baird-parker琼脂+rpf（兔血浆）快速培养法等均基于细菌增菌分离培养，转染平板，染色镜检，菌落计数，血浆凝血酶试验或肠毒素检测。这些过程通常需要2~4天才能获得结果，培养检测过程耗时过长。而后出现了其他不依赖培养的快速检测方法，包括酶联免疫吸附法，聚合酶链式反应（pcr法），实时多重pcr法，环介导的等温扩增等。然而，这些方法对操作者专业度要求高，成本高，准确度低，检测限高，并且需要对样品做预处理等，影响了检测的结果。

生物传感器因其具备良好的选择性，高稳定性，高特异性，高灵敏度等优点而受到广泛的关注。生物传感器包括分子识别部分和信号转换部分，分子识别部分识别靶标，而后将生物信号转换成电信号、荧光信号或其他信号。目前，已经开发了许多基于抗体的金黄色葡萄球菌传感器，包括表面等离子体共振，光学免疫法和电化学法。然而，基于抗体的生物传感器具有较高的生产成本，稳定性低以及抗体纯化和修饰困难的缺点，因此，适配体作为新型生物识别组件，被广泛应用于各种类生物传感器。适配体可以特异性结合各种目标，如金属离子，小分子，蛋白质甚至细胞。作为抗体的替代品，适配体无毒，稳定性高，在各种ph，温度和离子环境下适应性好，易于合成，具有抗变性和快速复性等特点，同时适配体还可以用不同的酶进行扩增或切割，使用各种方法修饰核酸序列以满足实验要求。

嵌合体序列最初是在聚合酶链反应期间无意产生的人工序列，dna聚合酶复制延伸过程中，由于不完全延伸，引发嵌合体序列的出现，其特征在于嵌合体序列来自两个（或可能更多）不同模板链，导致序列复制压力和基因组不稳定性。然而，嵌合体序列由于其结构特殊性，近年来被越来越多地用于适配体传感器中识别序列的构建，使其不仅仅具有捕获靶标的能力，同时根据嵌合序列另一部分的构成，兼具其它功能，如稳定嵌合体序列结构，增加酶切位点，释放光、电或化学信号等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于嵌合体序列设计和分子信标的荧光检测金黄色葡萄球菌的方法，其具有高灵敏、高特异性、测定准确等优点。

本发明的技术方案，本发明具体包括嵌合体序列的设计和结合金黄色葡萄球菌后嵌合体构象改变并打开分子信标释放荧光信号；nb.bpu10i切刻内切酶与bsmdna聚合酶双酶偶联体系的构建；置换金黄色葡萄球菌使其进入循环反应。

步骤如下：首先将嵌合体序列高温变性，复性后在适宜温度下形成茎环结构。在金黄色葡萄球菌存在的情况下，嵌合体序列中适配体部分与金黄色葡萄球菌结合，改变了嵌合体的二级结构，露出末端序列。然后加入分子信标，末端序列诱导分子信标打开形成互补双链并释放荧光信号。为了进一步扩增荧光信号，将nb.bpu10i切刻内切酶和bsmdna聚合酶加入到反应体系，nb.bpu10i切刻内切酶切割双链中分子信标序列包含猝灭基团的部分，bsmdna聚合酶通过强链置换反应合成完全互补的双链，并从嵌合体中置换下金黄色葡萄球菌，实现靶标的循环利用。释放的金黄色葡萄球菌与溶液中的游离嵌合体结合，进入下一轮反应。通过循环反应增加了打开的分子信标的数量，从而增强了荧光信号，提高了生物传感器的灵敏度（图1）。最后，建立荧光信号强度与金黄色葡萄球菌数量间的线性关系，利用该标准曲线计算样品中的金黄色葡萄球菌含量。

具体步骤如下：

（1）靶标识别：嵌合体序列如seqidno.1所示，嵌合体整合了特异性识别金黄色葡萄球菌的适配体序列、与分子信标互补的末端及两个末端自身互补的序列，将其在95℃高温变性后放置于37℃复性。含有金黄色葡萄球菌的样品在3000r·min^-1离心5min，使用pbs缓冲液清洗沉淀3次后重悬于pbs缓冲液中。将0.5μmol·l^-1嵌合体与100μl含有不同浓度金黄色葡萄球菌的pbs缓冲液混匀，在37℃摇床中，220r·min^-1孵育45min；

（2）分子信标打开：取10μl步骤（1）中的混合液，加入10μl分子信标和5μlpbs缓冲液，于37℃水浴孵育100min，所述分子信标序列如seqidno.2所示；

（3）链置换扩增体系：取3μl上述步骤（2）所得溶液加入6unb.bpu10i切刻内切酶，4.5ubsmdna聚合酶以及250μmol·l^-1游离的脱氧核糖核苷三磷酸，10mmol·l^-1tris-hcl，10mmol·l^-1mgcl2，100mmol·l^-1kcl，0.1mg·ml^-1bsa，混匀后在37℃孵育80min，将金黄色葡萄球菌从适配体上置换下来进入下一轮循环，进行多轮链置换扩增，产生大量被切割的分子信标；

（4）荧光信号检测和标准曲线绘制：在步骤（3）反应溶液中加入170μlpbs缓冲液并加入到96孔酶标板，使用多功能酶标仪读取空白以及含有金黄色葡萄球菌溶液的荧光信号变化，采用的激发波长为497nm，测定发射波长为520nm下的荧光信号。通过摇瓶培养金黄色葡萄球菌溶液，逐倍稀释，根据测定荧光值与金黄色葡萄球菌的浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线。

（5）实际样品检测：将含有金黄色葡萄球菌的水样以步骤（1）~（4）所述操作，测定出相应的荧光值，从标准曲线中计算出相应的金黄色葡萄球菌菌浓度。

所述嵌合体序列seqidno.1具体为：

5’-cacaccgcagcagtgggaacgtttcagccatgcaagcatcacgcccgtccttagcccactg-3’。

所述分子信标序列seqidno.2具体为：

5’-fam-acaccgcatcagtgggctaaggtgt-dabcyl-3’。

步骤（1）所述不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液具体为8×10²~8×10⁶cfu·ml^-1。

步骤（2）所述分子信标为5’端修饰fam荧光素，3’端修饰dabcyl的dna序列，购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

本发明的有益效果：本发明通过适配体捕获金黄色葡萄球菌改变嵌合体构象，打开分子信标释放荧光信号，与此同时，通过链置换扩增术将金黄色葡萄球菌从适配体上置换下来进入循环反应，放大了荧光信号，使该传感器检测范围扩大，提高检测灵敏度。该方法相比于检测金黄色葡萄球菌的传统方法，特异性强，灵敏度高。

附图说明

图1基于嵌合体序列设计和分子信标的荧光检测金黄色葡萄球菌的原理图。

图2金黄色葡萄球菌荧光检测标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明的应用原理作进一步的描述。

以下实施例中所述嵌合体购于生工生物工程（上海）股份有限公司，分子信标购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

本发明实施例中所用的嵌合体及分子信标的核酸序列如表1所示。

表1

实施例1金黄色葡萄球菌浓度标准曲线的绘制

将含有金黄色葡萄球菌的样品在3000r·min^-1离心5min，使用pbs缓冲液清洗沉淀3次后重悬于pbs缓冲液中。将0.5μmol·l^-1嵌合体序列在95℃高温变性5min后缓慢冷却至37℃孵育45min，与100μl含有不同浓度金黄色葡萄球菌的pbs缓冲液混匀，在37℃摇床中，220r·min^-1孵育45min。取10μl上述混合液，加入10μl分子信标和5μlpbs缓冲液，于37℃水浴孵育100min。取3μl孵育后的溶液中加入30μl酶切体系，含有6unb.bpu10i切刻内切酶，4.5ubsmdna聚合酶以及250μmol·l^-1游离的脱氧核糖核苷三磷酸，10mmol·l^-1tris-hcl，10mmol·l^-1mgcl2，100mmol·l^-1kcl，0.1mg·ml^-1bsa，混匀后在37℃孵育80min，将金黄色葡萄球菌从适配体上置换下来进入下一轮循环。最后，将酶切反应溶液中加入170μlpbs缓冲液置96孔酶标板，使用多功能酶标仪读取空白以及含有金黄色葡萄球菌溶液的荧光信号变化，采用的激发波长为497nm，测定发射波长为520nm下的荧光信号。通过摇瓶培养金黄色葡萄球菌溶液，逐倍稀释，根据传感器荧光值与金黄色葡萄球菌的浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线。

如图2所示，荧光强度随着金黄色葡萄球菌浓度的增加而增加，其线性回归方程是y=981.2*logc+4630.4，r²为0.9935，其中y表示荧光强度，c表示金黄色葡萄球菌浓度（cfu·ml^-1），该方法的检测限为38.75cfu·ml^-1。

实施例2实际水样中金黄色葡萄球菌含量的测定

为了进一步验证该方法在测定实际样品中金黄色葡萄球菌含量时的准确性，选用了无预处理的太湖水和自来水。

将培养的金黄色葡萄球菌以3000r·min^-1离心5min，并用pbs缓冲液洗涤3次以除去培养基。然后将沉淀物以8×10²cfu·ml^-1和8×10⁴cfu·ml^-1的浓度溶解在100μl水样中。将0.5μmol·l^-1嵌合体在95℃高温变性5min后缓慢冷却至37℃孵育45min，与100μl含有不同浓度金黄色葡萄球菌的pbs缓冲液混匀，在37℃摇床中，220r·min^-1孵育45min。取10μl上述混合液，加入10μl分子信标和5μlpbs缓冲液，于37℃水浴孵育100min。取3μl孵育后的溶液中加入30μl酶切体系，含有6unb.bpu10i切刻内切酶，4.5ubsmdna聚合酶以及250μmol·l^-1游离的脱氧核糖核苷三磷酸，10mmol·l^-1tris-hcl，10mmol·l^-1mgcl2，100mmol·l^-1kcl，0.1mg·ml^-1bsa，混匀后在37℃孵育80min，将金黄色葡萄球菌从适配体上置换下来进入下一轮循环。最后，将酶切反应溶液中加入170μlpbs缓冲液置96孔酶标板，测定荧光强度，代入标准曲线可计算出金黄色葡萄球菌浓度。

具体样品和检测结果如表2所示。

表2

注：样品1和样品2为太湖水样品；样品3和样品4为自来水样品。

序列表

<110>江南大学

<120>一种基于嵌合体序列设计和分子信标的荧光检测金黄色葡萄球菌的方法

<141>2018-10-29

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>seqidno.1

<211>61

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>seqidno.1

cacaccgcagcagtgggaacgtttcagccatgcaagcatcacgcccgtccttagcccact60

g61

<210>seqidno.2

<211>25

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>seqidno.2

acaccgcatcagtgggctaaggtgt25