本发明属于医药技术领域，涉及通式(i)所示的hpk1抑制剂化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体及其应用。
背景技术：
t细胞受体(tcr)介导的t细胞活化在胸腺t细胞发育、t细胞亚群分化以及效应t细胞功能发挥过程中均起着至关重要的作用。tcr能特异性识别抗原提呈细胞表面mhc提呈的抗原肽(peptide)，并将胞外抗原肽通过mhc(主要组织相容性复合物，majorhistocompatibilitycomplex)识别转化成可向细胞内部传递的信号。其中，抗原递呈细胞表面的mhc分子包括mhcii类和mhci类分子，可分别被cd4+和cd8+t细胞表面相应的辅助受体cd4和cd8分子特异性识别，随后可以引起下游信号通路的活化。tcr活化的典型胞内信号包括mapk(丝裂原活化蛋白激酶，mitogen-activatedproteinkinases)、pkc(蛋白激酶c，proteinkinasec)以及calcium(钙离子)等信号通路。这些信号的活化最终激活t细胞的特异性基因表达，引起细胞的增殖，并使得t细胞分化成效应t细胞。
hpk1，又称map4k1，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，作为map4k家族的成员之一。除此之外，其家族中还有5个成员，包括map3k2，map4k3，map4k4，map4k5，map4k6。hpk1可与许多接头蛋白结合，如slp-76家族，card11，his，hip-55，grb2家族，lat，crk家族等相互作用，活化造血干细胞的jnk/sapk信号途径，从而对tcr通路进行负向调节。map4k3又称为glk激酶，其生物学作用与hpk1的生物学作用正好相反。glk可以通过与下游接头蛋白结合，促进tcr通路的激活。因此我们需要筛选到对glk具有选择性的hpk1的抑制剂。
hpk1参与调控tcr的主要过程为(1)tcr与胞外的抗原通过mhc结合，从而激活tcr通路向下游接头蛋白分子传递信号；(2)接头蛋白酪氨酸激酶lck和zap70活化的slp76，继而磷酸化hpk1；(3)活化的hpk1会继而磷酸化受体蛋白slp-76；(4)slp-76的磷酸化反应为14-3-3(tcr通路抑制蛋白)受体蛋白提供多种蛋白结合位点，形成复合体；(5)slp-76磷酸化的复合体参与erk信号途径的下调，并接到slp76的泛素化降解过程，从而导致tcr信号通路和t细胞增殖下降。综上，hpk1可负向调节tcr信号途径，因此，hpk1可作为t细胞介导的免疫反应的新的调节机制，成为新的免疫抗肿瘤的研发热点。
由于在免疫方面的重要作用，hpk1抑制剂在恶性实体肿瘤或者血液癌(如急性髓性白血病、膀胱上皮癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、黑色素瘤)、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、银屑病关节炎)和炎症反应中均扮演重要的角色。
目前针对hpk1靶点尚未有药物上市，为了更好的满足巨大的临床需求，我们旨在开发出高选择性的，高活性的hpk1抑制剂，本发明将提供一种新型结构的选择性hpk1抑制剂，具有良好的理化性质和成药特性。
技术实现要素：
发明的一个目的是提供一类hpk1激酶抑制剂化合物，本发明化合物具有良好的激酶选择性和对hpk1的抑制活性，并具有良好的成药性，可用于治疗或者预防由hpk1介导的相关疾病。
本发明采用的技术方案如下：
通式(i)表示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体：
其中，x1、x2、x3、x4分别独立地选自cr4或n；
x5选自cr4或n；
x6选自cr4r5、nr6、o或s；
x7、x8、x9分别独立地选自cr4、cr4r5、n、nr6、o或s；
r4、r5在每次出现时，分别独立地选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-8烯基、c2-8炔基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
r6在每次出现时，分别独立地选自氢、羧基、氰基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-8烯基、c2-8炔基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
r1选自氢、-nrarb、-orc、-so2-nrarb、-nra-so2-rd、co-nrarb、-nra-co-rd、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基；
ra选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-8烯基、c2-8炔基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基羰基、c1-6烷基硫基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基；
rb选自氢或c1-6烷基；
rc选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-8烯基、c2-8炔基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基羰基、c1-6烷基硫基、-y1-q1，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基；
rd选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基；
r2选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-8烯基、c2-8炔基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基羰基、c1-6烷基硫基、-y2-q2，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基；
y1和y2分别独立地选自键、-(ch2)n、-c(o)-、-so2-或-nh-c(o)-；
q1、q2分别独立地选自任选被取代基取代的3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-8烯基、c2-8炔基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基羰基、c1-6烷基硫基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基；
n为1-4；
r3选自氢或c1-6烷基。
条件是，当x1、x2、x3、x4分别为cr4，
x5选自n，
x6选自nr6，
x7、x8、x9其中一个为s，另外两个分别为cr4，
r1为-nrarb，ra和rb分别独立地为氢时，
r2为-y2-q2，y2为键，q2为
在另一优选例中，式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，
其中，其中，x1、x2、x3、x4分别独立地选自cr4或n；
x5选自n；
x6选自cr4r5、nr6、o或s；
x7、x8、x9分别独立地选自cr4、cr4r5、n、nr6、o或s；
r4、r5、r6在每次出现时，r4、r5、r6分别独立地选自氢、卤素、氰基、c1-6烷基；
r1选自氢、-nrarb、-nra-co-rd、-nra-so2-rd、c1-6烷基、-orc；
ra选自氢、c1-6烷基、氰基；
rb、rc、rd分别独立地选自氢、c1-6烷基；
r2选自氢、c1-6烷基或-y2-q2；
y2为键；
q2选自任选被c1-6烷基或3-12元环烷基取代的3-12元杂环基；
r3选自氢或c1-6烷基；
条件是，当x1、x2、x3、x4分别为cr4，
x5选自n，
x6选自nr6，
x7、x8、x9其中一个为s，另外两个分别独立地为cr4，
r1为-nrarb，ra和rb分别独立地为氢时，
r2为-y2-q2，y2为键，q2为
在另一优选例中，式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，具有通式(ii)所示结构，
其中，x1、x2、x3、x4分别独立地选自cr4或n，且x1、x2、x3、x4中至少一个为n；
x6选自cr4r5、nr6、o或s；
x7、x8、x9分别独立地选自cr4、cr4r5、n、nr6、o或s；
r4、r5在每次出现时，分别独立地选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基，所述取代基选自：羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基；
r6在每次出现时，分别独立地选自氢、羧基、氰基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
r1选自-nrarb、–orc、-nra-so2-rd、-nra-co-rd、c1-6烷基；
ra选自氢、氰基，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基羰基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
rb选自氢；
rc选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、-y1-q1，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
rd选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
y1选自键或-(ch2)n-；
q1选自任选被取代基取代的3-12元环烷基、3-8元杂环基、5-6元杂芳基、苯基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基硫基、3-8元环烷基、芳基、4-6元杂环基、5-10元杂芳基；
r2选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、-y2-q2，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
y2选自键或-(ch2)n-，
q2选自任选被取代基取代的3-12元杂环基、5-10元杂芳基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基硫基、3-8元环烷基、芳基、4-6元杂环基、5-10元杂芳基；
n为1-4；
r3选自氢或c1-6烷基。
在另一实施例中，q2为任选被取代基取代的4-8元单杂环基、6-12元桥杂环基、6-12元螺杂环基、6-12元并杂环基、5-6元杂芳基、9-10元并杂芳基，更进一步优选为任选被取代基取代的4-8元饱和含氮单杂环基、7-10元饱和含氮桥杂环基、7-10元饱和含氮螺杂环基、7-10元饱和含氮并杂环基，取代基的定义如上所述。
在另一实施例中，x7为s，x8为cr4，x9为cr4或n；
在另一实施例中，x7为cr4，x8为s，x9为cr4；
在另一实施例中，x7为cr4，x8为cr4，x9为s。
在另一优选例中，式(ii)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，
其中，x1、x2、x3、x4分别独立地选自cr4或n，且x1、x2、x3、x4中至少一个为n；
x6选自cr4r5、nr6、o或s；
x7、x8、x9分别独立地选自cr4、cr4r5、n、nr6、o或s；
r4、r5、r6在每次出现时，r4、r5、r6分别独立地选自氢、c1-6烷基；
r1选自-nrarb、-orc、c1-6烷基；
ra、rb、rc分别独立的选自选自氢或c1-6烷基；
r2选自氢、c1-6烷基或-y2-q2；
y2为键，
q2选自任选被c1-6烷基、3-8元环烷基取代的3-12元杂环基；
r3选自氢或c1-6烷基。
在另一优选例中，式(ii)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，具有通式(iii)所示结构，
其中，x1、x2、x3、x4分别独立地选自cr4或n，且x1、x2、x3、x4中至少一个为n；
x9分别独立地选自cr4或n；
r4在每次出现时，分别独立地选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
r1选自-nrarb、-orc、-nra-so2-rd、-nra-co-rd、c1-6烷基；
ra选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
rb选自氢；
rc选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基、-y1-q1，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
rd选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
y1选自键或-(ch2)n；
q1选自任选被取代基取代的3-8元环烷基、3-8元杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
r2选自-y2-q2；
y2选自键或者-(ch2)n-，
q2选自任选被取代基取代的4-8元单杂环基、6-12元螺杂环基、6-12元桥杂环基、6-12元并杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、3-6元环烷基；
n为1-4。
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和单杂环基，7-10元饱和螺杂环基、7-10元饱和桥杂环基；
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和含氮单杂环基，7-10元饱和含氮螺杂环基、7-10元饱和含氮桥杂环基。
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的哌嗪基、吗啉基、哌啶基，取代基的定义如上所述。
在另一优选例中，式(iii)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，
其中，x1、x2、x3、x4分别独立地选自cr4或n，且x1、x2、x3、x4中至少一个为n；
x9分别独立地选自cr4或n；
r4在每次出现时，独立地选自氢、c1-6烷基；
r1选自-nrarb、-orc、c1-6烷基；
ra、rb、rc分别独立的选自氢或c1-6烷基；
r2选自-y2-q2；
y2选自键；
q2选自任选被取代基取代的4-8元单杂环基、6-12元螺杂环基、6-12元桥杂环基，所述取代基选自c1-6烷基、3-6元环烷基。
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和单杂环基，7-10元饱和螺杂环基、7-10元饱和桥杂环基；
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和含氮单杂环基，7-10元饱和含氮螺杂环基、7-10元饱和含氮桥杂环基。
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的哌嗪基、吗啉基、哌啶基，取代基的定义如上所述。
在另一优选例中，式(iii)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，
其中，
x1、x2、x3分别为cr4，x4为n；
x9分别独立地选自cr4或n；
r4在每次出现时，分别独立地选自氢、c1-6烷基；
r1选自-nrarb、orc、c1-6烷基；
ra、rb、rc分别独立地选自氢、c1-6烷基；
r2选自氢、c1-6烷基或-y2-q2；
y2选自键，
q2选自任选被取代基取代的吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、哌啶基、氮杂庚烷基、
在另一优选例中，式(iii)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，
其中，
x1、x2、x3分别为cr4，x4为n；
x9分别独立地选自cr4或n；
r4在每次出现时，分别独立地选自氢、c1-6烷基；
r1选自-nrarb、-orc、c1-6烷基；
ra、rb、rc分别独立的选自氢或c1-6烷基；
r2选自氢、c1-6烷基或-y2-q2；
y2选自键，
q2选自任选被取代基取代的吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、哌啶基、氮杂庚烷基、
在另一优选例中，式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，具有通式(iv)所示结构，
其中，x1、x2、x3、x4分别独立地选自cr4或n，且x1、x2、x3、x4中至少一个为n；
r4在每次出现时，分别独立地选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
r1选自-nrarb、–orc、-nra-so2-rd、-nra-co-rd、c1-6烷基；
ra选自氢、氰基，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
rb选自氢；
rc选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基、-y1-q1，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
rd选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
y1选自键或-(ch2)n-；
q1选自任选被取代基取代的3-8元环烷基、3-8元杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
r2选自-y2-q2；
y2选自键或者-(ch2)n-，
q2选自任选被取代基取代的4-8元单杂环基、6-12元螺杂环基、6-12元桥杂环基、6-12元并杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、3-6元环烷基；
n为1-4。
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和单杂环基，7-10元饱和螺杂环基、7-10元饱和桥杂环基；
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和含氮单杂环基，7-10元饱和含氮螺杂环基、7-10元饱和含氮桥杂环基。
在另一实施例中，q2为任选被取代基取代的哌嗪基、吗啉基、哌啶基，取代基的定义如上所述。
在另一优选例中，式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，具有通式(v)所示结构，
其中，x1、x2、x3、x4分别独立地选自cr4或n，且x1、x2、x3、x4中至少一个为n；
r4在每次出现时，分别独立地选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
r1选自-nrarb、–orc、-nra-so2-rd、-nra-co-rd、c1-6烷基；
ra选自氢、氰基，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
rb选自氢；
rc选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基、-y1-q1，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
rd选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
y1选自键或-(ch2)n-；
q1选自任选被取代基取代的3-8元环烷基、3-8元杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
r2选自-y2-q2；
y2选自键或者-(ch2)n-，
q2选自任选被取代基取代的4-8元单杂环基、6-12元螺杂环基、6-12元桥杂环基、6-12元并杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、3-6元环烷基；
n为1-4。
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和单杂环基，7-10元饱和螺杂环基、7-10元饱和桥杂环基；
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和含氮单杂环基，7-10元饱和含氮螺杂环基、7-10元饱和含氮桥杂环基；
在另一实施例中，q2为任选被取代基取代的哌嗪基、吗啉基、哌啶基，取代基的定义如上所述。
在另一优选例中，式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，具有通式(vi)所示结构，
其中，x1、x2、x3分别独立地选自cr4或n；
x6选自cr4r5、nr6、o或s；
x7、x9分别独立地选自cr4、cr4r5、n、nr6、o或s；
r4、r5在每次出现时，分别独立地选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-8烯基、c2-8炔基、3-8元环烷基、3-8元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基，所述取代基选自：羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
r6在每次出现时，选自氢、羧基、氰基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-8烯基、c2-8炔基、3-12元环烷基、3-12元环烯基、芳基、3-12元杂环基、5-10元杂芳基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
r1选自氢、-nrarb、–orc、-nra-so2-rd、-nra-co-rd、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基；
ra选自氢、氰基，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基羰基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
rb选自氢；
rc选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、-y1-q1，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
rd选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
y1选自键或-(ch2)n-；
q1选自任选被取代基取代的3-8元环烷基、3-8元杂环基、5-6元杂芳基、苯基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基硫基、3-8元环烷基、芳基、4-6元杂环基、5-10元杂芳基；
r2选自氢、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子，或任选被取代基取代的c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、-y2-q2，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基；
y2选自键或-(ch2)n-，
q2选自任选被取代基取代的3-12元杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基、c1-6烷氧c1-6烷氧基、c1-6烷基氨基、(c1-6烷基)2氨基、c1-6烷基羰基氨基、c1-6烷基磺酰氨基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c1-6烷基磺酰基、c1-6烷基硫基、3-8元环烷基、芳基、4-6元杂环基、5-10元杂芳基；
n为1-4。
在另一实施例中，q2为任选被取代基取代的4-8元单杂环基、6-12元桥杂环基、6-12元螺杂环基、6-12元并杂环基、5-6元杂芳基、9-10元并杂芳基，更进一步优选为任选被取代基取代的4-8元饱和含氮单杂环基、7-10元饱和含氮桥杂环基、7-10元饱和含氮螺杂环基、7-10元饱和含氮并杂环基，取代基的定义如上所述。
在另一优选例中，式(vi)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，具有通式(vii)所示结构，
其中，x1、x2、x3分别独立地选自cr4或n；
x6选自nr6；
r6在每次出现时，分别独立地选自氢、氰基、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
r1选自-nrarb、–orc、-nra-so2-rd或-nra-co-rd；
ra选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
rb选自氢；
rc选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基、-y1-q1，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
rd选自氢，或任选被取代基取代的c1-6烷基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基；y1选自键或-(ch2)n-；
q1选自任选被取代基取代的3-8元环烷基、3-8元杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
r2选自-y2-q2；
y2选自键，
q2选自任选被取代基取代的4-8元单杂环基、6-12元螺杂环基、6-12元桥杂环基、6-12元并杂环基，所述取代基选自羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、c1-6烷基、c1-6烷氧基；
n为1-4。
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和单杂环基，7-10元饱和螺杂环基、7-10元饱和桥杂环基；
在另一实施例中，q2选自任选被取代基取代的4-8元饱和含氮单杂环基，7-10元饱和含氮螺杂环基、7-10元饱和含氮桥杂环基；
在另一实施例中，q2为任选被取代基取代的哌嗪基、吗啉基、哌啶基，取代基的定义如上所述。
在另一优选例中，式(vii)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，
其中，x1、x2、x3分别独立地选自cr4或n；
x6选自nr6；
r6在每次出现时，分别独立地选自氢、c1-6烷基；
r1选自-nrarb、–orc、c1-6烷基；
ra、rb、rc分别独立的选自选自氢或c1-6烷基；
r2选自氢、c1-6烷基、-y2-q2；
y2选自键；
q2选自任选被取代基取代的吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、哌啶基、氮杂庚烷基、
在另一优选例中，式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，
其中，x1、x2、x3、x4分别为cr4；
x5选自n；
x6选自nr6；
x7、x8、x9其中一个为s，另外两个分别为cr4；
r4、r6在每次出现时，分别独立地选自氢、c1-6烷基；
r1选自氢、-nra-so2-rd、-co-nrarb、-nra-co-rd、c1-6烷基；
ra、rb、rc、rd分别独立的选自选自氢或c1-6烷基；
r2选自氢、c1-6烷基、-y2-q2；
y2选自键；
q2选自任选被c1-6烷基取代的3-12元杂环基，
优选地，选自任选被c1-6烷基取代的4-8元单杂环基，
更优选地，q2选自如下基团：
r3选自氢或c1-6烷基；
条件是，当x1、x2、x3、x4分别为cr4，
x5选自n，
x6选自nr6，
x7、x8、x9其中一个为s，另外两个分别为cr4，
r1为-nrarb，ra和rb分别独立地为氢时，
r2为-y2-q2，y2为键，q2为
式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体，所述化合物为：
表1
本发明还要求保护本发明任一化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体的药物组合物，可以任选含有一种或多种药用载体，制成药学上可接受的任一药物制剂。
在本发明的一种具体实施方式中，前述的药物组合物可以进一步包含一种或多种第二治疗活性剂。所述的第二治疗活性剂为抗代谢物、生长因子抑制剂、有丝分类抑制剂、抗肿瘤激素类、烷化剂类、金属类、拓扑异构酶抑制剂、激素药、免疫调节剂、肿瘤抑制基因、癌疫苗、免疫检查点或肿瘤免疫治疗相关的抗体或小分子药物。
本发明还要求保护本发明任一化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体的药物制剂，其特征在于包含一种或多种药用载体。
本发明所述的药用载体可以是一种或多种适合于人使用的固体或液体填料或凝胶物质。所述药用载体优选具有足够的纯度和足够低的毒性，并且与本发明活性成分具有相容性且不明显减低活性成分的药效。例如，药用载体可以填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、水性溶剂或非水性溶剂等。
本发明所述的药物制剂，可以制成药学上可接受的任意剂型，以任何合适的给药方式，例如通过口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要这种治疗的患者或受试者。用于口服给药时，可以制成片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等。用于肠胃外给药时，可以制成注射液、注射用无菌粉末等。
本发明还要求保护本发明的化合物用于治疗或者预防由hpk1介导的相关疾病的药物中的用途。hpk1在t细胞介导的信号通路中中具有负反馈调节作用，因此可将hpk1的抑制剂作为免疫抗肿瘤药物应用到癌症或非癌性增殖性疾病的治疗中，其中所述的疾病包括肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、乳腺癌、乳腺导管癌、头颈癌、子宫内膜癌、宫体癌、直肠癌、肝癌、肾癌、肾盂癌、食管癌、食管腺癌、神经胶质瘤、前列腺癌、甲状腺癌、女性生殖系统癌症、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤病、骨癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、口腔癌、咽癌、多发性骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、大肠绒毛腺瘤、黑色素瘤、细胞瘤和肉瘤，骨髓增生异常综合症。
发明详述
本发明所述的“卤素”是指氟、氯、溴、碘等，优选氟原子，氯原子。
本发明所述的“卤代”是指取代基中的任一氢原子可被一个或多个相同或不同的卤素原子取代。“卤素”如前文所定义。
本发明所述的“c1-6烷基”指含有1-6个碳原子的烃部分去除一个氢原子衍生的直链或支链的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基和1-甲基-2-甲基丙基等。所述“c1-4烷基”指含有1-4个碳原子的上述实例。
本发明所述的“c2-8烯基”指含有碳碳双键的2～8个碳原子的烯烃部分去除一个氢原子衍生的直链或支链，如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、1,4-己二烯基。
本发明所述的“c2-8炔基”指含有碳碳叁键的2～8个碳原子的炔烃部分去除一个氢原子衍生的直链或支链的炔烃基，如乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基等。
本发明所述的“c1-6烷氧基”是指前文所定义的“c1-6烷基”通过氧原子与母体分子连接的基团，即“c1-6烷基-o-”基团，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基和正己氧基等。所述的“c1-4烷氧基”指含有1-4个碳原子的上述实例，即“c1-4烷基-o-”基团。
发明所述的“c1-6烷基氨基”、“(c1-6烷基)2氨基”、“c1-6烷基羰基氨基”、“c1-6烷基磺酰氨基”、“c1-6烷基氨基羰基”、“(c1-6烷基)2氨基-羰基”、“c1-6烷氧基-羰基”、“c1-6烷基磺酰基”、“c1-6烷基硫基”、“c1-6烷基羰基”、分别指c1-6烷基-nh-、(c1-6烷基)(c1-6烷基)n-、c1-6烷基-c(o)-nh-、c1-6烷基-s(o)2-nh2-、c1-6烷基-nh-c(o)-、(c1-6烷基)(c1-6烷基)n-c(o)-、c1-6烷基-o-c(o)-、c1-6烷基-s(o)2-、c1-6烷基-s-、c1-6烷基-c(o)-；所述“c1-6烷基”如前文所定义，优选为“c1-4烷基”。
本发明所述的“稠环”是指由两个或两个以上环状结构以并、螺、桥的连接方式所形成的多环系结构。所述的并环是指由两个或两个以上环状结构彼此公用两个相邻的环原子(即共用一个键)所形成的稠环结构。所述的桥环是指有两个或两个以上环装结构彼此共用两个非相邻的环原子所形成的稠环结构。所述的螺环是指由两个或两个以上环状结构彼此共用一个环原子所形成的稠环结构。
本发明所述的“3-12元环烯基”，在不特别指明的情况下，包括可能形成的所有单环、稠环(包括以并、螺、桥的形式稠合)的情形，例如3-8元环烯、7-11元螺环烯、7-11元并环烯、6-11元桥环烯等。
本发明所述的“3-12元环烷基”，可以是单环、双环、或者多环环烷基系统(也称为稠环系统)。在不特别指明的情况下，包括可能形成的所有单环、稠环(包括以并、螺、桥的形式稠合)的情形。单环系统是含3-8个碳原子的环烃基基团。3-8元环烷基实例包括但不限于：环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、环庚烷基、环辛烷基等。稠环环烷基包括并环环烷基、桥环烷基、螺环烷基。并环环烷基可以为6-11元并环环烷基、7-10元并环环烷基，其的代表性例子包括但不限于双环[3.1.1]庚烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、双环[3.2.2]壬烷、双环[3.3.1]壬烷和双环[4.2.1]壬烷。所述的螺环基可以为7-12元螺环基、7-11元螺环基，其实例包括但不限于：
本发明所述的“杂环基”是指3-12元的至少一个环碳原子被选自o、s、n的杂原子替代的非芳香性的环状基团，优选1-3个杂原子，同时包括碳原子、氮原子和硫原子可以被氧代。
“3-12元杂环基”，是指单环杂环基、双环杂环基系统或多环杂环基系统(也称为稠环系统)，包括饱和、部分饱和的杂环基，但不包括芳环。在不特别指明的情况下，包括可能形成的所有单环、稠环(包括以并、螺、桥的形式稠合)、饱和、部分饱和的情形。
单杂环基可以为3-8元杂环基、3-8元饱和杂环基、3-6元杂环基、4-6元杂环基、4-7元杂环基、5-7元杂环基、5-6元杂环基、5-6元含氧杂环基、3-8元含氮杂环基、5-6元含氮杂环基、5-6元饱和杂环基、4-8元单杂环基、4-8元饱和单杂环基等。“3-8”元饱和杂环基，其实例包括但不限于氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、咪唑烷基、吡唑烷基、1,2-噁唑烷基、1,3-噁唑烷基、1,2-噻唑烷基、1,3-噻唑烷基、四氢-2h-吡喃基、四氢-2h-噻喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、氮杂庚烷基、1,4-二氧杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烷基；“3-8”元部分饱和杂环基，其实例包括但不限于4,5-二氢异噁唑基、4,5-二氢噁唑基、2,5-二氢噁唑基、2,3-二氢噁唑基、3,4-二氢-2h-吡咯基、2,3-二氢-1h-吡咯基、2,5-二氢-1h-咪唑基、4,5-二氢-1h-咪唑基、4,5-二氢-1h-吡唑基、4,5-二氢-3h-吡唑基、4,5-二氢噻唑基、2,5-二氢噻唑基、2h-吡喃基、4h-吡喃基、2h-噻喃基、4h-噻喃基、2,3,4,5-四氢吡啶基、1,2-异噁嗪基、1,4-异噁嗪基或6h-1,3-噁嗪基等。稠杂环包括并杂环基、螺杂环基、桥杂环基，可以是饱和的、部分饱和的或不饱和的，但不是芳香性的。稠杂环基是稠合到苯环、5-6元的单环环烷基、5-6元单环环烯基、5-6元单环杂环基或5-6元单环杂芳基的5-6元单环杂环基环。所述的并杂环基可以为6-12元并环基、7-10元并环基、6-10元并环基、6-12元饱和并环基，代表性实例包括但不限于：3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3,6-二氮杂双环[3.2.0]庚烷基、3,8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷基、3,7-二氮杂双环[4.2.0]辛烷基、八氢吡咯并[3,4-c]吡咯基、八氢吡咯并[3,4-b]吡咯基、八氢吡咯并[3,4-b][1,4]噁嗪基、八氢-1h-吡咯并[3,4-c]吡啶基、2,3-二氢苯并呋喃-2-基、2,3-二氢苯并呋喃-3-基、二氢吲哚-1-基、二氢吲哚-2-基、二氢吲哚3-基、2,3-二氢苯并噻吩-2基、八氢-1h-吲哚基、八氢苯并呋喃基。所述的螺杂环基可以为6-12元螺杂环基、7-11元螺杂环基、6-12元饱和螺环基、7-10元饱和螺杂环基，其实例包括但不限于：
所述的桥杂环基可以为6-12元桥杂环基、7-11元桥杂环基、6-12元饱和桥环基、7-11元饱和桥杂环基，其实例包括但不限于：
本发明所述“芳基”，是指含有6-14个碳原子的环状芳香性基团，包括，苯基、萘、菲等。
本发明所述“5-10元杂芳基”是指至少一个环碳原子被选自o、s、n的杂原子替代的芳香性的环状基团，优选1-3个杂原子，同时包括碳原子、硫原子被氧代的情况，例如碳原子被c(o)替代，硫原子被s(o)、s(o)2替代。杂芳基包括单杂芳基和稠杂芳基，在不特别指明的情况下，包括可能形成的所有单环、稠环、全部芳香、部分芳香的情形。单杂芳基可以为5-7元杂芳基、5-6元杂芳基，其实例包括但不仅限于呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、噁二唑基、噁唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、吡咯基、四唑基、噻二唑基、噻吩基、三唑基和三嗪基。在某些实施例中，稠杂芳基是指单环杂芳环稠合到苯基、环烯基、杂芳基、环烷基、杂环基所形成的基团，稠杂芳基可以为8-12元并杂芳基、9-10元并杂芳基，例子包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、噌啉基、5,6-二氢喹啉-2-基、5,6-二氢异喹啉-1-基、呋喃并吡啶基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、萘啶基、嘌呤基、喹啉基、5,6,7,8-四氢喹啉-2-基、5,6,7,8-四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹啉-4-基、5,6,7,8-四氢异喹啉-1-基、噻吩并吡啶基、4,5,6,7-四氢并[c][1,2,5]噁二唑基和6,7-二氢并[c][1,2,5]噁二唑-4(5h)酮基。
本发明所述的“药学上可接受的盐”是指可药用的酸和碱的加成盐或其溶剂化物。这样的可药用盐包括诸如以下的酸的盐：盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、亚硫酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、硝酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、氢碘酸、链烷酸(诸如乙酸、hooc-(ch2)n-cooh(其中n是0～4))等。碱的盐：钠盐、钾盐、钙盐、铵盐等。本领域技术人员知晓多种无毒的可药用加成盐。
本发明式(i)化合物的“立体异构体”是指当式(i)化合物存在不对称碳原子时，会产生对映异构体；当化合物存在碳碳双键或环状结构时，会产生顺反异构体；当化合物存在酮或肟时，会产生互变异构体，所有式(i)化合物的对映异构体、非对映异构体、消旋异构体、顺反异构体、互变异构体、几何异构体、差向异构体及其混合物，均包括在本发明范围中。
具体实施方式
中间体制备例：2-氨基噻吩-3-甲腈的合成
步骤1：2-氨基噻吩-3-甲腈的合成
将原料1,4-二噻烷-2,5-二醇(100g,0.66mol,1.0eq)溶于甲醇(500ml)，再加入丙二腈(86.86g,1.32mol,2.0eq)和三乙胺(20ml)，70℃反应30分钟，tlc检测反应完全，反应液浓缩，粗品经硅胶柱层析(pe:ea＝4:1)纯化得黄色固体状产物(80g,产率:98％)。
实施例1中间体2-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)乙酸乙酯的制备
步骤1：5-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺的合成
将5-氯-2-硝基苯胺(30g,0.19mol,1equiv)溶于无水nmp(40ml)，室温下加入三乙胺(58ml,0.42mol,2.2eq)，搅拌30分钟，慢慢滴加1-甲基哌嗪(18ml,0.21mol,1.1eq)，加热至160℃反应16小时。tlc监控反应完成后，加入水(1l)，过滤，滤饼用乙醚洗涤，干燥得5-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺(23g,产率:56％)。
步骤2：2-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)乙酸乙酯的合成
5-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-硝基苯胺(16g,67.8mmol,1.0eq)溶于无水乙醇(320ml)中，加入10％pd/c(4.8g)，充入氢气，搅拌至反应完全。氮气保护下加入3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(31.7g,162mmol,2.4eq)，加热至50℃反应3小时。反应液过滤，滤液减压浓缩，所得残留物溶于二氯甲烷(500ml)，用氨水中和，再用水洗(2×100ml)，有机相浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(ea洗脱)得到白色固体2-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)乙酸乙酯(3.23g,产率:15.7％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.08-12.01(1h,m),7.39-7.29(1h,m),6.94-6.87(2h,m),4.14(1h,q,j＝7.2hz),3.90(2h,s),3.09-3.07(4h,m),2.51-2.47(4h,m),2.23(3h,s),1.21(3h,t,j＝7.2hz).
实施例2中间体5-氨基噻唑-4-甲腈的制备
步骤1：5-溴噻唑-4-甲酰胺的合成
将5-溴噻唑-4-甲酸乙酯(10g,42.3mmol,1.0eq)加入到氨水(100ml)中，室温搅拌过夜。tlc检测反应完毕后，加水(100ml)，乙酸乙酯萃取(100ml×6)，有机相合并，用饱和食盐水洗(100ml)，干燥，浓缩得到产品(7.0g粗品)，不经纯化直接用于下一步。
步骤2：5-溴噻唑-4-甲腈的合成
5-溴噻唑-4-甲酰胺(7g粗品,33.8mmol,1.0eq)加入到甲苯(70ml)中，滴加三氯氧磷(10.4g,67.6mmol,2.0eq)，滴加完毕后回流搅拌反应2h。tlc检测反应完毕，冷却到室温，倒入冰水(100ml)中，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，饱和碳酸氢钠洗(50ml×2)，盐水洗(50ml×2)，干燥，浓缩得到5-溴噻唑-4-甲腈(5.6g粗品)，不经纯化直接用于下一步。
步骤3：5-((二苯亚甲基)氨基)噻唑-4-甲腈的合成
5-溴噻唑-4-甲腈(4.6g,24.3mmol,1.0eq)、二苯甲酮亚胺(6.6g,36.5mmol,1.5eq)、碳酸铯(17.5g,53.5mmol,2.2eq)、pd2(dba)3(2.3g,2.43mmol,0.1eq)和xantphos(2.99g,5.1mmol,0.21eq)加入到甲苯(115ml)中，氮气置换3次，80℃搅拌反应过夜。tlc检测反应完毕后，冷却到室温，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗(50ml×3)，滤液浓缩，粗品经硅胶柱层析得到黄色固体(3.9g,收率:30％)。
步骤4：5-氨基噻唑-4-甲腈的合成
5-((二苯亚甲基)氨基)噻唑-4-甲腈(4.2g,14.5mmol,1.0eq)加入到四氢呋喃(16.8ml)中，然后加入4mol/l盐酸(16.8ml,67.2mmol,4.6eq)，加完25℃搅拌反应3h。tlc检测反应完全，加水(50ml)，0℃下用饱和碳酸氢钠调ph值至8-9，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，食盐水洗(50ml×3)，干燥，浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(1.3g,收率:76％)。
1hnmr(300mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.06(s,1h),7.38(s,2h).
实施例34-氨基-5-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成(化合物1)
步骤1：6-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-硝基吡啶-2-胺的制备
将6-氯-3-硝基吡啶-2-胺(5g,0.029mol,1eq)溶于无水dmf(40ml),室温下加入碳酸钾(8.8g,0.064mol,2.2eq)，搅拌30分钟后，慢慢滴加n-甲基哌嗪(2.7ml,0.032mol,1.1eq)，升温至150℃再搅拌16小时。tlc监控反应完全后，加入水(1l)，过滤，收集所得黄色固体。用乙醚洗涤，空气中干燥得到6-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-硝基吡啶-2-胺(6g,粗品)，不经纯化直接用于下一步。
步骤2：2-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙酸乙酯的制备
将6-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-硝基吡啶-2-胺(6g,粗品,1.0eq)溶于无水乙醇(100ml)中，加入10％pd/c(0.6g)。充入氢气，搅拌至反应完成。氮气保护下加入3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(11.8g,61mmol,2.4eq)，加热至80度3小时。反应不完全，抽滤，浓缩，加入甲苯和dmf，加热回流，转化完全。反应液过滤，滤液减压浓缩。所得残留物溶于二氯甲烷(100ml),用氨水中和，用水洗(2×50ml)，有机相浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(洗脱剂：ea)得到2-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙酸乙酯(2.1g,两步总收率:26.5％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δppm:7.77(1h,d,j＝8.8hz),6.65(1h,d,j＝8.8hz),4.25(1h,q,j＝7.2hz),4.01(2h,s),3.64-3.60(4h,m),2.63-2.60(4h,m),2.40(3h,s),1.31(3h,t,j＝7.2hz).ms:304.1[m+h]+
步骤3：4-氨基-5-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的制备
将2-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙酸乙酯(200mg,0.659mmol,1.0eq)和2-氨基噻吩-3-甲腈(82mg,0.659mmol,1.0eq)溶解于thf(3ml)，加热至40℃，滴加lda(1.6ml,3.296mmol,5eq)，搅拌反应2小时，升温至60℃继续反应2小时，将反应液冷却至室温，缓慢加入饱和氯化铵溶液中，搅拌片刻，ea萃取(50ml×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得到固体粗品，加入适量ea和dcm打浆，再用少量甲醇打浆，抽滤，滤饼用dcm洗涤，抽干，减压干燥，得到4-氨基-5-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮(67.97mg,收率27.1％)。
1hnmr(400mhz,dmso)δ(ppm):12.74-12.79(d,1h),12.16(s,1h),10.33-10.54(d,1h),8.15(s,1h),7.86-7.88(d,1h),7.61-7.62(d,1h),7.18-7.21(t,1h),6.80-6.85(t,1h),3.73-3.82(d,4h),3.15(s,4h),2.68-2.71(d,3h).
分子式:c18h19n7os，分子量:381.46，lc-ms(pos,m/z)＝382.3[m+h+].
实施例47-氨基-6-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻唑并[5,4-b]吡啶-5(4h)-酮的合成(化合物2)
步骤1:7-氨基-6-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻唑并[5,4-b]吡啶-5(4h)-酮的合成
将2-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)乙酸乙酯(150.0mg,0.495mmol,1.0eq)和5-氨基噻唑-4-甲腈(62.1mg,0.495mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(4.5ml)，氮气保护下40℃搅拌10min，缓慢加入二异丙基氨基锂(1.7ml,3.465mmol,7.0eq)，40℃搅拌过夜。tlc检测反应完全，加入饱和氯化铵水溶液(5ml)淬灭，乙酸乙酯(5ml×3)萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩，粗品经硅胶柱层析(dcm:meoh＝30:1～5:1)纯化得红色固体7-氨基-6-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻唑并[5,4-b]吡啶-5(4h)-酮(10.0mg,收率:5.3％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.50-12.48(d,1h),12.17-12.13(s,1h),10.63-10.42(m,1h),8.88(s,1h),8.65(s,1h),8.12-8.00(t,2h),7.53-7.44(m,1h),7.22-7.12(d,1h),6.92-6.89(d,1h),3.17-3.11(t,4h),2.27(s,3h).
分子式:c18h19n7os分子量:381.46lc-ms(pos，m/z)＝382.21[m+h]+.
实施例54-氨基-5-(5-(哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成(化合物16的盐酸盐)
步骤1：6-氨基-5-硝基-3',6'-二氢-[2,4'-联吡啶]-1'(2'h)-羧酸叔丁酯合成
将(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-甲酸叔丁酯(23.32g,74.9mmol,1.3eq)和6-氯-3-硝基吡啶-2-胺(10g,57.6mmol,1.0eq)加入到二氧六环(500ml)中，加入四丁基溴化铵(1.86g,7.5mmol,0.1eq)、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(2.38g,3.74mmol,0.05eq)、碳酸钠(15.3g,187.3mmol,2.5eq)和水(48ml)，氮气保护下80℃搅拌反应过夜。反应完毕后，冷却到室温，抽滤，固体用乙酸乙酯(200ml×3)洗，滤液浓缩，剩余物加水(500ml)，乙酸乙酯萃取(200ml×3)，合并有机相，食盐水洗(200ml×3)，干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化得到黄色固体状产物(12g,产率:65％)。
步骤2：4-(5,6-二氨基吡啶-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
将6-氨基-5-硝基-3',6'-二氢-[2,4'-联吡啶]-1'(2'h)-羧酸叔丁酯(12g,37.5mmol)加入到无水乙醇(240ml)中，然后加入钯碳(6g,10％)，室温加氢过夜，hplc、tlc检测反应完毕后，抽滤，固体用乙醇(50ml×3)洗，滤液浓缩，得到黑色固体状化合物4-(5,6-二氨基吡啶-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(9.5g,粗品)，不经纯化直接用于下一步。
步骤3：4-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
将4-(5,6-二氨基吡啶-2-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(5g,17.1mol,1.0eq)加入到乙醇(100ml)中，然后加入3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(6.7g,34.2mmol,2.0eq)，回流过夜。hplc和lc-ms检测反应完毕后，浓缩，残余物加水(25ml)，0℃下用氨水调ph至9-10，乙酸乙酯萃取(20ml×5),有机相干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(ea洗脱)得到白色固体(1.4g,收率:21％)。
分子式:c20h28n4o4分子量:388.47lc-ms(pos，m/z)＝389.1[m+h]+.
1hnmr(300mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.8-12.5(br,1h),7.88-7.78(m,1h),7.12(d,j＝8.1hz,1h),4.13-3.99(m,4h),2.91-2.88(m,3h),1.84(m,2h),1.64(m,2h),1.41(s,9h),1.19(t,j＝6.6hz,3h).
步骤4：叔丁基4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-羧酸酯的合成
将4-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(100.0mg,0.257mmol,1.0eq)、2-氨基噻吩-3-甲腈(31.9mg,0.257mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(2.0ml)，n2保护下40℃搅拌20min，缓慢滴加双三甲基硅基胺基锂(2.57ml,2.574mmol,10.0eq)，40℃搅拌2h，然后升温到80℃反应2h。加入饱和氯化铵溶液(5ml)淬灭，乙酸乙酯(5ml×3)萃取，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(dcm:meoh＝150:1～40:1)得黄色固体状产物叔丁基4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-羧酸酯(40.0mg,收率:40％)。
步骤5：4-氨基-5-(5-(哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成
将叔丁基4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-羧酸酯(40.0mg,0.0857mmol,1.0eq)溶于乙醇(1.0ml)，加入氯化氢乙醇溶液(1.0ml)，室温过夜。tlc检测反应完全，向反应液中加入少量水(约0.5ml)，抽滤，得黄色固体4-氨基-5-(5-(哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐(7.88mg,收率:19.7％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):13.47(s,1h),12.37(s,1h),10.21(s,2h),9.11-8.95(m,2h),8.65(s,1h),8.31-8.30(m,1h),7.68-7.67(m,1h),7.34-7.24(m,2h),3.51-3.30(m,4h),3.09-3.01(m,2h),2.17-2.03(m,4h).
分子式:c18h18n6os分子量:366.44lc-ms(pos，m/z)＝367.06[m+h]+.
实施例6n-(5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-4-基)乙酰胺的合成(化合物17)
步骤1:4-氨基-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成
将2-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)乙酸乙酯(866mg,2.864mmol,1.0eq)和2-氨基噻吩-3-甲腈(355.6mg,2.864mmol,1.0eq)溶解在thf中，氮气保护下升温至40℃，缓慢滴加二异丙基氨基锂(2mol/l,7.134ml,14.32mmol,5.0eq)，约40min加完，继续反应2h，lc-ms监测反应完全。将反应液加入到饱和氯化铵水溶液(50ml)中，用ea萃取(50ml×3)，有机相合并，水洗(30ml)，有机相干燥，浓缩，粗品加入dcm(1ml)浆洗，抽滤得产品(301mg,收率27.6％)。
步骤2:n-(5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-4-基)乙酰胺的合成
将4-氨基-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮(155mg,0.407mmol,1.0eq)和dipea(157.9mg,1.22mmol,3.0eq)溶解在dmf(1ml)中，滴加乙酰氯(63.9mg,0.815mmol,2.0eq)，加完微波70℃反应6h，补加dipea(157.9mg,1.22mmol,3.0eq)和乙酰氯(63.9mg,0.815mmol,2.0eq)，微波70℃反应6h。将反应液倒入冰水中，dcm萃取(50ml×3)，有机相用饱和食盐水洗(30ml)，分液，干燥，浓缩，粗品经制备薄层色谱纯化(甲醇:二氯甲烷＝1:20)得产品(3.4mg,收率:2％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.97-12.92(s,1h),12.87-12.74(s,1h),7.58-7.56(s,1h),7.21-7.19(m,2h),7.15-7.13(s,1h),7.03-7.01(s,1h),3.15(d,4h),2.57(d,4h),2.36(s,3h),2.29(s,3h).
分子式:c21h22n6o2s分子量:422.51lc-ms(pos,m/z)＝423.25[m+h]+.
实施例7：n-(5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-4-基)甲磺酰胺的合成(化合物18)
步骤1：n-(5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-4-基)甲磺酰胺的合成
将4-氨基-5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮(100mg,0.263mmol,1.0eq)和吡啶(124.7mg,1.576mmol,6.0eq)溶解在dmac(1ml)中，滴加甲磺酸酐(91.5mg,0.526mmol,2.0eq)，加完后40℃反应2h，补加甲磺酸酐(91.5mg,0.526mmol,2.0eq)，加完后40℃反应2h，补加甲磺酸酐(91.5mg,0.526mmol,2.0eq)，加完后40℃反应12h。将反应液倒入冰水中，用dcm萃取(50ml×3)，有机相合并，用饱和食盐水洗(30ml)，干燥，浓缩，粗品经制备薄层色谱纯化(甲醇:二氯甲烷＝1:20)得产品n-(5-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-4-基)甲磺酰胺(3.6mg,收率:2％)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm):10.27-11.25(s,1h),8.13(s,1h),7.75-7.77(s,1h),7.64-7.66(s,1h),7.36-7.37(s,1h),7.22-7.24(s,1h),3.33(d,3h),2.74(d,3h),2.45-2.50(m,3h),2.26-2.28(m,2h),2.22-2.24(m,2h),2.03-2.06(m,2h).
分子式:c20h22n6o3s2分子量:458.56lc-ms(pos,m/z)＝459.07[m+h]+.
实施例8：4-氨基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成(化合物25)
步骤：
将4-氨基-5-(5-(哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐(30.0mg,0.0745mmol,1.0eq)和甲醛水溶液(37％)(12.1mg,0.149mmol,2.0eq)溶于甲醇(1.5ml)与水(0.5ml)中，0℃下加入乙酸(0.1ml)搅拌1h，加入氰基硼氢化钠(23.4mg,0.372mmol,5.0eq)，室温搅拌5h，tlc显示反应完全。将反应液减压浓缩，粗品经制备薄层色谱分离(dcm:meoh＝48:10)得产品(10.0mg,收率:33.3％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):13.00-12.90(s,1h),12.16(s,1h),10.61-10.41(s,1h),8.22(s,1h),7.93-7.91(d,1h),7.64-7.63(d,1h),7.24-7.20(m,1h),7.16-7.06(m,1h),3.52-3.42(m,2h),3.05(m,2h),2.78-2.77(m,1h),2.38-2.28(m,4h),1.91(s,3h).
分子式：c19h20n6os分子量：380.47lc-ms(pos,m/z)＝381.14[m+h]+
实施例9:4-氨基-5-(5-(1-环丙基哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成(化合物26)
步骤1：4-((2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
将原料4-(5,6-二氨基吡啶-2-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.7g,5.81mmol,1.0eq)和3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(3.63g,18.6mmol,3.0eq)溶于乙醇(20ml)，氮气保护下升温至90℃反应3小时。lc-ms检测反应完全，反应液倒入水中(50ml)淬灭，水相用乙酸乙酯(50ml×2)萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(ea)纯化得产品(1.2g,收率:53％)。
步骤2：4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-叔丁酯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体4-((2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(500mg,1.29mmol,1.0eq)和2-氨基噻吩-3-甲腈(160mg,1.29mmol)溶于四氢呋喃(10ml)中，升温至40℃，缓慢加入双(三甲基硅基)胺基锂四氢呋喃溶液(13ml,13mmol,10.0eq)，升温至80℃反应2小时。lc-ms检测反应完全，反应液倒入水中(30ml)淬灭，水相用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(dcm:meoh＝20:1)得产品(240mg,收率:40％)。
步骤3：4-氨基-5-(5-(哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成
将4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-叔丁酯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(240mg,0.51mmol)溶于乙醇(5ml)，加入氯化氢乙醇溶液(5ml)，室温反应过夜。反应液由澄清变浑浊，析出固体，lc-ms检测反应完全，减压浓缩得产品(250mg,收率:100％).
步骤3：4-氨基-5-(5-(1-环丙基哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成
将中间体4-氨基-5-(5-(哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐(250mg,0.682mmol,)和(1-乙氧基环丙氧基)三甲基硅烷(594mg,3.41mmol,5.0eq)溶于甲醇(10ml)，加入乙酸(0.5ml)和氰基硼氢化钠(258mg,4.10mmol,6.0eq)，升温至60℃反应12小时，lc-ms未反应，加入n,n-二甲基甲酰胺(1ml)，70℃反应2小时，lc-ms检测反应完全，反应液倒入水中(30ml)，用饱和碳酸氢钠水溶液调节ph值至8，用二氯甲烷(30ml×3)萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤两次，干燥，过滤，浓缩，粗品用二氯甲烷浆洗后得产品(46mg,收率:16.6％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.89(s,1h),12.19(s,1h),10.36-10.68(m,1h),8.25(s,1h),7.90-7.92(d,1h),7.63-7.65(d,1h),
7.19-7.21(m,1h),3.08(m,3h),2.56-2.59(m,2h),2.29-2.33(m,2h),1.80-1.85(m,2h),1.65-1.85(m,3h),0.33-0.44(m,4h).
分子式:c21h22n6os分子量:406.51lc-ms(pos,m/z)＝407.32[m+h]+
实施例10:4-氨基-5-(5-(氮杂环庚烷-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成(化合物39的盐酸盐)
步骤1：5-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2,3,4,7-四氢-1h-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯的合成
将原料4-氧代环庚烷-1-羧酸叔丁酯(5.0g,23.44mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(50ml)中，降温至-70℃，缓慢加入双(三甲基硅基)胺基锂四氢呋喃溶液(28ml,28.13mmol,1.2eq)，-70℃反应0.5小时，再缓慢加入1,1,1-三氟-n-苯基-n-((三氟甲基)磺酰基)甲磺酰胺(10.0g,28.13mmol,1.2eq)，自然升至室温反应16小时。tlc(pe:ea＝5:1)检测反应完全，反应液倒入冰水(100ml)中淬灭，用乙酸乙酯(100ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(pe:ea＝5:1)纯化得产品(4.5g,收率:56％)。
步骤2：5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-2,3,4,7-四氢-1h-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体5-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2,3,4,7-四氢-1h-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(4.5g,13.03mmol,1.0eq)和联硼酸频那醇酯(3.3g,13.03mmol,1.0eq)溶于1,4-二氧六环(50ml)中，加入乙酸钾(3.84g,39.09mmol,3.0eq)、1,1'-双(二苯基磷)二茂铁(722mg,1.303mmol,0.1eq)和1,1'-双(二苯基磷)二茂铁二氯化钯(953mg,1.303mmol,0.1eq)，氮气保护下升温至90℃反应3小时。tlc(pe:ea＝5:1)检测反应完全，反应液倒入冰水(100ml)中淬灭，用乙酸乙酯(100ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(pe:ea＝5:1)纯化得到产物(3.2g,收率:76％)。
步骤3：5-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)-2,3,4,7-四氢-1h-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体5-氯-2-硝基苯胺(1.74g,10mmol,1.0eq)和5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-2,3,4,7-四氢-1h-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(3.23g,10mmol,1.0eq)溶于1,4-二氧六环(40ml)和水(10ml)中，加入碳酸钠(3.2g,30mmol,3.0eq)、1,1'-双(二苯基磷)二茂铁二氯化钯(732mg,0.1mmol,0.1eq)，氮气保护下升温至90℃反应3小时。tlc(pe:ea＝5:1)检测反应完全，反应液倒入冰水中(100ml)淬灭，用乙酸乙酯(100ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(pe:ea＝5:1)纯化得产品(850mg,收率:25％).
步骤4：4-(5,6-二氨基吡啶-2-基)氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体5-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)-2,3,4,7-四氢-1h-氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(850mg,2.54mmol,1.0eq)溶于乙醇(10ml)中，加入10％钯碳(500mg)，氢气条件下室温反应3小时，lc-ms检测反应完全。反应液过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(dcm:meoh＝10:1)纯化得产品(650mg,收率:82％)。
步骤5：4-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体4-(5,6-二氨基吡啶-2-基)氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(950mg,3.1mmol,1.0eq)和3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(1.82g,9.3mmol,3.0eq)溶于乙醇(25ml)中，氮气保护下升温至90℃反应3小时，tlc(dcm:meoh＝10:1)检测反应完全，反应液倒入水中(50ml)淬灭，用乙酸乙酯(50ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(dcm:meoh＝10:1)纯化得产品(540mg,收率:43％)。
步骤6：4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体4-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(540mg,1.33mmol,1.0eq)和2-氨基噻吩-3-甲腈(165mg,1.33mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(50ml)中，升温至40℃，缓慢加入双(三甲基硅基)胺基锂四氢呋喃溶液(13.3ml,13.3mmol,10.0eq)，升温至80℃反应2小时，lc-ms检测反应完全。反应液倒入水中(30ml)淬灭，用乙酸乙酯(30ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(dcm:meoh＝10:1)纯化得产品(240mg,收率:38％)。
步骤6：4-氨基-5-(5-(氮杂环庚烷-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮-盐酸盐的合成
化合物39的盐酸盐
将中间体4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)氮杂环庚烷-1-羧酸叔丁酯(240mg,0.5mmol,1.0eq)溶于乙醇(4ml)，缓慢加入氯化氢乙醇溶液(1ml)，升温至35℃反应2小时，反应液由澄清变浑浊，析出固体，lc-ms检测反应完全，过滤，滤饼用丙酮漂洗两次，60℃常压干燥得产品(158mg,收率:76％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.39(s,1h),10.17(s,1h),9.20(s,1h),8.68-8.72(m,1h),8.35(s,1h),7.65-7.67(d,1h),7.39-7.41(s,1h),7.25-7.26(d,1h),3.17-3.40(m,6h),1.97-2.37(m,7h).
分子式:c19h20n6os分子量:380.47lc-ms(pos,m/z)＝381.2[m+h]+
实施例11:4-羟基-5-(5-(哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成(化合物41的盐酸盐)
步骤1：4-(2-(4-羟基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
将原料4-((2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.0g,2.57mmol,1.0eq)和2-氨基噻吩-3-羧酸甲酯(404mg,2.57mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(20ml)中，升温至40℃，缓慢加入双(三甲基硅基)胺基锂的四氢呋喃溶液(25.7ml,25.7mmol,10.0eq),反应2小时,升温至80℃反应2小时,lc-ms检测反应完全，反应液倒入水中(30ml)淬灭，水相用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(dcm:meoh＝10:1)得产品(200mg,收率:16.6％)。
步骤2：4-羟基-5-(5-(哌啶-4-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成
化合物41的盐酸盐
将原料4-(2-(4-羟基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(200mg,0.43mmol)，溶于甲醇(10ml)，加入氯化氢乙醇溶液(10ml)，升温至50℃反应2小时。体系由澄清变浑浊，析出固体，lc-ms检测反应完全，过滤，滤饼用二氯甲烷淋洗两次，50℃真空干燥后得产品(139mg,收率:80％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):14.30(s,1h),13.29(s,1h),12.01(s,1h),9.07-9.10(m,1h),8.76-8.79(m,1h),8.04-8.06(d,1h),7.29-7.31(d,1h),7.24-7.26(d,1h),7.06-7.08(d,1h),3.37-3.40(m,2h),3.11-3.15(m,1h),2.99-3.10(m,2h),1.96-2.08(m,4h)。
分子式:c18h17n5o2s分子量:367.43lc-ms(pos,m/z)＝368.11[m+h]+
实施例12:4-氨基-5-(5-(哌嗪-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成(化合物47的盐酸盐)
步骤1：4-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成
将原料6-氯-3-硝基吡啶-2-胺(5.0g,28.81mmol,1.0eq)溶解在n,n-二甲基乙酰胺(50ml)中，加入哌嗪-1-羧酸叔丁酯(8.05g,43.21mmol,1.5eq)和无水碳酸钾(15.9g,115.24mmol,4.0eq)，升温至80℃反应3h，tlc监测反应完全，减压浓缩得到淡黄色固体，用水浆洗，过滤，滤饼干燥得到产品(8.3g,收率:90％)。
步骤2：4-(5,6-二氨基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体4-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(1g,3.09mmol,1.0eq)溶于无水乙醇(30ml)中，加入10％钯碳(500mg)，置换氢气，氢气氛围下升温至50℃反应12h，tlc监测反应完全，氮气保护下过滤，滤饼用无水乙醇淋洗，滤液减压浓缩，加入甲苯(20ml)，浓缩，重复三次，再加入无水乙醇(20ml)，浓缩得到产品，不经纯化直接用于下步反应。
步骤3：4-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成
将上一步的产物溶解在无水乙醇(20ml)中，氮气保护下，加入3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(1.45g,7.42mmol,2.4eq)，升温至50℃反应3h，lc-ms检测反应完全，降温至10℃，过滤，滤饼用乙醇淋洗，滤液减压浓缩，所得固体加二氯甲烷(100ml)溶解，用饱和碳酸钠溶液调ph值至8左右，用水(50ml×2)洗涤，分液，有机相干燥，过滤，浓缩，所得固体再用甲基叔丁基醚浆洗得到产品(475mg，2步收率:39.5％)。
步骤4：4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体4-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(200mg,0.51mmol,1.0eq)溶于无水四氢呋喃(5ml)中，加入2-氨基噻吩-3-甲腈(64.2mg,0.51mmol,1.0eq)，氮气保护下升温至40℃，滴加双(三甲基硅基)氨基锂的四氢呋喃溶液(1mol/l,5.1ml,10.0eq)，加毕，40℃反应2h，再升温至60℃反应2h，tlc监测反应完全，用饱和氯化铵溶液调ph值至8左右，用二氯甲烷(100ml×3)萃取，分液，有机相合并，干燥，过滤，滤液减压浓缩得产品(270mg粗品)。
步骤5：4-氨基-5-(5-(哌嗪-1-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成
化合物47的盐酸盐
将中间体4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(100mg,0.21mmol,1.0eq)溶于无水乙醇(5ml)中，降温至0～10℃，滴加30％氯化氢乙醇溶液(5ml)，加毕，室温搅拌4h。lc-ms监测反应完全，浓缩，加入乙酸乙酯(10ml)，浓缩，重复三次，所得固体用乙酸乙酯(5ml)浆洗，过滤，滤饼烘干得产品(63mg,收率:73％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.23-12.16(s,1h),9.37(s,2h),8.02-8.00(d,1h),7.64-7.63(d,1h),7.21-7.20(d,1h),6.94-6.92(d,1h),3.81(m,4h),3.23(m,4h).
分子式:c17h18n7oscl分子量:367.43lc-ms(pos,m/z)＝368.26[m+h]+.
实施例13:5-(5-(2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成(化合物48的盐酸盐)
步骤1：5-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯的合成
将原料6-氯-3-硝基吡啶-2-胺(1.5g,8.64mmol,1.0eq)溶解在n,n-二甲基乙酰胺(5ml)中，加入2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯(1.8g,8.64mmol,1.0eq)和无水碳酸钾(4.7g,34.56mmol,4.0eq)，升温至80℃反应3h，tlc监测反应完全，降至室温，加水(50ml)，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，分液，有机相合并，用饱和食盐水(100ml×3)洗涤，干燥，过滤，滤液减压浓缩得到产品(2.9g,收率:96.17)。
步骤2：5-(5,6-二氨基吡啶-2-基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯的合成
将中间体5-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯(2.9g,8.3mmol,1.0eq)溶于无水乙醇(30ml)中，加入10％钯碳(500mg)，氢气氛围下升温至50℃反应12h，tlc监测反应完全，氮气保护下过滤，滤饼用无水乙醇淋洗，滤液减压浓缩，加入甲苯(50ml)，浓缩，重复三次，加入无水乙醇(50ml)，浓缩得产品，不经纯化直接投入下一步。
步骤3：5-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯的合成：
将上一步的产物溶解在无水乙醇(50ml)中，加3a分子筛(2.6g)，氮气保护下加入3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(4.0g,20.69mmol,2.4eq)，氮气保护下升温至80℃反应12h，lc-ms检测反应完全，趁热过滤，过滤，滤饼用乙醇淋洗，滤液减压浓缩，所得固体加二氯甲烷(100ml)溶解，用饱和碳酸钠水溶液调ph值至8左右，分液，水相用二氯甲烷(100ml×3)萃取，有机相合并，干燥，过滤，浓缩，粗品先经硅胶柱层析(meoh:dcm＝1:100～1:50)纯化，再用甲基叔丁基醚浆洗得到产品(2g,收率:55.8％)。
步骤4：5-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯的合成
将中间体5-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯(600mg,1.44mmol,1.0eq)溶于无水四氢呋喃(6ml)中，加入2-氨基噻吩-3-甲腈(180.7mg,1.44mmol,1.0eq)，氮气保护下升温至40℃，滴加双(三甲基硅基)氨基锂的四氢呋喃溶液(1mol/l,14.4ml,10.0eq)，加毕，40℃反应2h，再升温至60℃反应2h，lc-ms监测反应完全，降至室温，用饱和氯化铵水溶液调ph值至8左右，用乙酸乙酯(100ml×2)萃取，分液，有机相合并，干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得固体用甲基叔丁基醚浆洗，过滤，滤饼烘干得到产品(688mg,收率:96％)。
步骤5：5-(5-(2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮盐酸盐的合成
化合物48的盐酸盐
将中间体5-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯(200mg,0.40mmol,1.0eq)溶于无水乙醇(5ml)中，降温至0～10℃，加30％氯化氢乙醇溶液(5ml)，室温搅拌12h。lc-ms监测反应完全，浓缩，加入乙酸乙酯(10ml)，浓缩，重复三次，所得固体再用乙酸乙酯(10ml)浆洗，过滤，滤饼烘干得到产品(131.2mg,收率:76.34)。
1hnmr(400mhz,d2o)δ(ppm):7.56(d,1h),6.80-6.77(d,2h),6.33-6.31(d,1h),4.37(m,1h),4.06(m,1h),3.87-3.85(m,1h),3.64-3.50(m,3h),2.23-2.20(m,2h),2.01-1.98(m,2h).
分子式:c19h20n7os分子量:395.49lc-ms(neg,m/z)＝394.26[m-h]-.
实施例14：5-(5-(2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮三氟乙酸盐的合成(化合物49的三氟乙酸盐)
步骤1：6-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯的合成
将原料6-氯-3-硝基吡啶-2-胺(1.426g,8.22mmol,2.0eq)和2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯半草酸盐(2.0g,4.11mmol,1.0eq)溶于dmf(10ml)，加入碳酸钾(3.403g,24.66mmol,6.0eq)，氮气保护下80℃反应12小时，tlc检测反应完全。反应液倒入水(100ml)中，搅拌10分钟，再加入乙酸乙酯(100ml×3)萃取，有机相用水洗(100ml×3)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得到产品(2.7g,产率:98％)。
步骤2：6-(5,6-二氨基吡啶-2-基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯的合成
将中间体6-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(2.52g,7.51mmol,1.0eq)溶于乙醇(20ml)，加入pd/c(500mg)，氢气置换三次，氢气条件下反应12小时，lc-ms检测反应完全。抽滤，减压浓缩得到黄色固体状产品(2.29g,产率:100％)。
步骤3：6-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯的合成
将中间体6-(5,6-二氨基吡啶-2-基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(2.2g,7.2mmol,1.0eq)溶于乙醇(50ml)，加入3a分子筛(2.0g)，搅拌10分钟，再加入3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(3.382g,17.28mmol,2.4eq)，氮气保护下80℃反应12小时，tlc检测反应完全。反应液抽滤，滤液减压浓缩，所得产品倒入水中(100ml)，用饱和碳酸钠水溶液调ph＝9，再加入乙酸乙酯(100ml×3)萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，粗品经硅胶柱层析(meoh:dcm＝1:50)纯化得到产品(1.5g,产率:52％)。
步骤4：6-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯的合成
将中间体6-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(1g,2.49mmol,1.0eq)和2-氨基噻吩-3-甲腈(309mg,2.49mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(20ml)，氮气保护下，40℃滴加双三甲基硅基胺基锂(25ml,24.9mmol,10eq)，40℃反应2小时，lc-ms检测反应完全。反应液倒入水(50ml)中，加入乙酸乙酯(50ml×3)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品用甲基叔丁基醚浆洗得产品(785mg,产率:65％)。
步骤5：5-(5-(2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮三氟乙酸盐的合成
化合物49的三氟乙酸盐
将中间体6-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,6-二氮杂螺[3.3]庚烷-2-羧酸叔丁酯(200mg,0.42mmol,1.0eq)溶于二氯甲烷(5ml)，0℃下加入三氟乙酸(5ml)，反应1小时，tlc检测反应完全。反应液减压浓缩，粗品用二氯甲烷浆洗得产品(190mg,产率:92％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):13.07-13.10(d,1h),12.23(s,1h),10.13-10.27(d,1h),8.71(s,2h),8.20(s,1h),8.00-8.03(d,1h),7.60-7.61(d,1h),7.21-7.22(d,1h),6.38-6.40(d,1h),4.21-4.27(d,8h).
分子式:c18h17n7os分子量:379.44lc-ms(pos,m/z)＝380.12[m+h]+.
实施例15:4-氨基-5-(5-(5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成(化合物50)
步骤1：5-(5-(2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮2,2,2-三氟乙酸盐的合成
将中间体5-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-羧酸叔丁酯(200mg,0.40mmol,1.0eq)溶于二氯甲烷(5ml)中，降温至0℃，滴加三氟乙酸(5ml)的二氯甲烷(5ml)溶液，滴毕，0℃搅拌4h。lc-ms监测反应完全，浓缩，加入二氯甲烷(10ml)，浓缩，重复三次，得到红褐色固体，再用甲基叔丁基醚(10ml)浆洗，过滤，滤饼烘干得到产物(190mg,收率:93.2％)。
步骤2：4-氨基-5-(5-(5-甲基-2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成
将中间体5-(5-(2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-2-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮2,2,2-三氟乙酸盐(108mg,0.21mmol,1.0eq)溶于无水甲醇(5ml)中，加乙酸(12.7mg,0.21mmol,1.0eq)和37％的甲醛水溶液(85.1mg,1.05mmol,5.0eq)，室温搅拌1h，加氰基硼氢化钠(65.9mg,1.05mmol,5.0eq)，室温搅拌12h，lc-ms监测反应完全，减压浓缩，依次加入加饱和食盐水(10ml)和饱和碳酸钠水溶液(10ml)，用二氯甲烷(100ml×3)萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到产品(72mg,收率:80.2％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.61(s,1h),8.70(s,1h),10.58-10.34(s,1h),8.04(d,1h),7.86-7.77(d,1h),7.75-7.59(d,1h),7.20-7.17(d,1h),6.47-6.37(d,1h),6.06(s,1h),4.59-4.55(d,1h),3.74-3.71(d,1h),2.93-2.90(d,1h),2.81-2.76(m,2h),2.33-2.30(s,3h),2.27-2.02(d,1h),1.88-1.75(m,2h),1.59-1.50(d,1h).
分子式:c20h21n7os分子量:407.51lc-ms(neg,m/z)＝408.32[m+h]-.
实施例16：5-(5-(7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成(化合物51)
步骤1：3-硝基-6-(7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)吡啶-2-胺的合成
将原料6-氯-3-硝基吡啶-2-胺(3g,17.28mmol,1.0eq)和7-氮杂螺[3.5]壬烷盐酸盐(3.35g,20.74mmol,1.4eq)和碳酸钾(9.54g,69.12mmol,4.0eq)溶于dmac(20ml)，80℃反应12小时，tlc检测反应完全。反应液倒入水(100ml)中，搅拌30分钟，过滤得到产品(4.2g,产率:93％)。
步骤2：6-(7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)吡啶-2,3-二胺的合成
将中间体3-硝基-6-(7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)吡啶-2-胺(1.2g,4.57mmol,1.0eq)溶于乙醇(10ml)，加入pd/c(500mg)，氢气置换三次，氢气条件下反应3小时，lc-ms检测反应完全，抽滤，滤液减压浓缩得到产品(1.06g,产率:100％)。
步骤3：2-(5-(7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙酸乙酯的合成
将中间体6-(7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)吡啶-2,3-二胺(1.06g,4.57mmol,1.0eq)溶于乙醇(10ml)，再加入3a分子筛(2.0g)，搅拌10分钟，再加入3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(1.68g,8.6mmol,2.0eq)在氮气保护下，50℃反应2小时，tlc检测反应完全。反应液先抽滤，减压浓缩，所得产品倒入水(100ml)中，用饱和碳酸钠水溶液调ph＝9，再加入乙酸乙酯(100ml×3)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，粗品经硅胶柱层析(meoh:dcm＝1:200)纯化得产品(400mg,产率:28％)。
步骤4：5-(5-(7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成
将中间体2-(5-(7-氮杂螺[3.5]壬烷-7-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)乙酸乙酯(150mg,0.46mmol,1.0eq)和2-氨基噻吩-3-甲腈(57mg,0.46mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(5ml)，在氮气保护下，40℃滴加双三甲基硅基胺基锂(4.6ml,4.6mmol,10eq)，40℃反应2小时，tlc检测有原料剩余。补加2-氨基噻吩-3-甲腈(12mg,0.92mmol,0.2eq)，升温至80℃反应4h，tlc检测反应完全，反应液倒入水(10ml)中，加入乙酸乙酯(20ml×3)萃取，有机相无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品经制备薄层色谱纯化(meoh:dcm＝1:30)得产品(30mg,产率:16％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.65(s,1h),12.24(s,0.5h),12.16(s,0.5h),10.59(s,0.5h),10.35(s,0.5h),8.13-8.17(d,1h),7.75-7.79(d,1h),7.63-7.65(d,1h),7.18-7.20(d,1h),6.71-6.76(m,1h),3.42-3.46(m,4h),1.86-1.90(m,2h),1.77-1.79(m,4h),1.62(s,4h).
分子式:c21h22n6os分子量:406.51lc-ms(pos,m/z)＝407.16[m+h]+.
实施例17:4-氨基-5-(6-(1-甲基哌啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮2,2,2-三氟乙酸盐的合成(化合物56的三氟乙酸盐)
步骤1：4-(3-氨基-4-硝基苯基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯的合成
将原料5-氯-2-硝基苯胺(1.0g,5.8mmol,1.0eq)和4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯(2.0g,6.4mmol,1.1eq)溶于1,4-二氧六环(20ml)和水(5ml)中，加入碳酸钾(3.2g,23.2mmol,3.0eq)和1,1'-双(二苯基磷)二茂铁二氯化钯(212mg,0.29mmol,0.05eq)，氮气保护下升温至90℃反应3小时，tlc(pe:ea＝5:1)检测反应完全。反应液倒入冰水(50ml)中淬灭，水相用乙酸乙酯(50ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(pe:ea＝5:1)纯化得产品(1.3g,收率:70％)。
步骤2：4-(3,4-二氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体4-(3-氨基-4-硝基苯基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯(1.3g,4.1mmol,1.0eq)溶于甲醇(10ml)中，加入10％湿钯碳(500mg)，通入氢气，室温反应3小时，lc-ms检测反应完全，反应液过滤，浓缩得产品(1.2g粗品)。
步骤3：4-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1h-苯并[d]咪唑-6-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体4-(3,4-二氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.2g粗品)和3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(2.4g,12.36mmol,3.0eq)溶于乙醇(20ml)，氮气保护下升温至90℃反应3小时，lc-ms检测反应完全，反应液倒入水中(50ml)淬灭，用乙酸乙酯(50ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经硅胶柱层析(ea)纯化得产品(1.2g,两步收率:75％)。
步骤4：4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-1h-苯并[d]咪唑-6-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的合成
将中间体4-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-1h-苯并[d]咪唑-6-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.2g,3.1mmol,1.0eq)和2-氨基噻吩-3-甲腈(385mg,3.1mmol,1.0eq)溶于四氢呋喃(50ml)中，升温至40℃，缓慢加入双(三甲基硅基)胺基锂的四氢呋喃溶液(31ml,31mmol,10.0eq)，升温至80℃反应2小时，lc-ms检测反应完全。反应液倒入水中(50ml)淬灭，用乙酸乙酯(50ml×2)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，粗品经甲基叔丁基醚浆洗后得产品(800mg,收率55％).
步骤5：4-氨基-5-(6-(哌啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6i(7h)-酮盐酸盐的合成
将中间体4-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-1h-苯并[d]咪唑-6-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(800mg,1.72mmol,1.0eq)溶于乙醇(5ml)，加入氯化氢乙醇溶液(5ml)，室温反应过夜。反应液由澄清变浑浊，析出固体，lc-ms检测反应完全。过滤，滤饼60℃常压烘干得产品(600mg,收率:87％)。
步骤6：4-氨基-5-(6-(1-甲基哌啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮2,2,2-三氟乙酸盐的合成
化合物56的三氟乙酸盐
将中间体4-氨基-5-(6-(哌啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6-(7h)-酮盐酸盐(300mg,0.75mmol,1.0eq)和37％甲醛水溶液(304mg,3.75mmol,5.0eq)溶于甲醇(6ml)，搅拌0.5小时，加入氰基硼氢化钠(95mg,1.5mmol,2.0eq)，升温至60℃反应2小时，lc-ms检测反应完全，粗品经制备hplc(质量分数0.1％三氟乙酸水溶液:乙腈＝70:30)纯化得产品(182mg,收率:49％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.14(s,1h),9.54(s,1h),7.59-7.62(m,2h),7.52(m,1h),7.19-7.21(m,1h),7.06-7.09(m,1h),3.53-3.56(m,2h),3.10-3.17(m,2h),2.90-2.94(m,4h),2.05-2.08(m,2h),1.90-1.93(m,2h).
分子式:c20h21n5os分子量:379.48lc-ms(pos,m/z)＝380.2[m+h]+
实施例18:4-氨基-5-(5-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成(化合物57)
步骤1：3-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-烯-8-羧酸叔丁酯的合成
将原料3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(6.0g,26.63mmol,1.0eq)溶解在无水四氢呋喃溶液(30ml)中，氮气保护下降温至-70℃～-60℃，滴加双(三甲基硅基)氨基锂的四氢呋喃溶液(1mol/l,32ml,1.2eq)，滴毕，-70℃～-60℃搅拌1h，再滴加n-苯基双(三氟甲磺酰)亚胺(11.4g,31.96mmol,1.2eq)的四氢呋喃溶液(30ml)，加完0℃以下反应3h，自然升至室温搅拌12h。降温至0℃～10℃，加入饱和食盐水(50ml)和饱和碳酸钠水溶液(50ml)，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，有机相合并，干燥，过滤，滤液减压浓缩得到产品。
步骤2：3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-烯-8-羧酸叔丁酯的合成
将上步所得中间体溶于无水1,4-二氧六环(200ml)中，加入联硼酸频那醇酯(8.1g,31.96mmol,1.2eq)和乙酸钾(9.1g,93.22mmol,3.5eq)，氮气保护下加入1,1’-双(三苯基膦)二茂铁(737.8mg,1.33mmol,0.05eq)和[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(974.3mg,1.33mmol,0.05eq)，氮气保护下升温至100℃反应3h，降至室温，加饱和食盐水(100ml)，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，分液，有机相合并，干燥，过滤，滤液减压浓缩得到产品。
步骤3：3-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-烯-8-羧酸叔丁酯的合成
将上步所得产物溶于1,4-二氧六环(200ml)中，加入6-氯-3-硝基吡啶-2-胺(4.6g,26.63mmol,1.0eq)、碳酸钾(14.7g,106.53mmol,4.0eq)和水(60ml)，氮气保护下加入[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(974.3mg,1.33mmol,0.05eq)，升温至100℃反应12h。降温至50℃，加入饱和食盐水(100ml)、乙酸乙酯(100ml)和活性炭(2g)，50℃搅拌0.5h，趁热过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，分液，水相用乙酸乙酯(100ml×2)萃取，有机相合并，干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品先经硅胶柱层析(ea:pe＝1:30)纯化，再用甲基叔丁基醚浆洗，过滤，滤饼烘干得产品(3.5g,3步收率:38％)。
步骤4：3-(5,6-二氨基吡啶-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯的合成
将中间体3-(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-2-烯-8-羧酸叔丁酯(2g,5.77mmol,1.0eq)溶于无水乙醇(60ml)中，加入10％钯碳(500mg)，氢气氛围下升温至50℃反应12h，tlc监测反应完全，氮气保护下过滤，滤饼用无水乙醇淋洗，滤液在氮气保护下减压浓缩，加入甲苯(50ml)，浓缩，重复三次，加入无水乙醇(50ml)，浓缩得产品，不经纯化直接投入下一步。
步骤5：3-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯的合成
将上一步的产物溶解在无水乙醇(50ml)中，加3a分子筛(1.8g)，氮气保护下加入3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(2.7g,13.86mmol,2.4eq)，氮气保护下升温至80℃反应12h，补加3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯盐酸盐(2.7g,13.86mmol,2.4eq)，氮气保护下80℃再反应12h，趁热过滤，滤饼用乙醇淋洗，滤液减压浓缩，所得固体加二氯甲烷(100ml)溶解，用饱和碳酸钠水溶液调ph值至8左右，分液，水相用二氯甲烷(100ml×3)萃取，有机相合并，干燥，过滤，滤液浓缩，粗品经硅胶柱层析(meoh:dcm＝1:100-1:50)纯化得到产品(257mg，收率:10.7％)。
步骤6：3-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯的合成
将中间体3-(2-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(257mg,0.62mmol,1.0eq)溶于无水四氢呋喃(5ml)中，加入2-氨基噻吩-3-甲腈(77.5mg,0.62mmol,1.0eq)，氮气保护下升温至40℃，滴加双(三甲基硅基)氨基锂的四氢呋喃溶液(1mol/l,6.2ml,10.0eq)，加毕，40℃反应2h，再升温至60℃反应4h，lc-ms监测反应完全，降至室温，用饱和氯化铵水溶液调ph值至8左右，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，有机相合并，干燥，过滤，滤液减压浓缩，粗品用甲基叔丁基醚:石油醚(1:1)浆洗，过滤，滤饼烘干得产品(270mg，收率:88.2％)。
步骤7：5-(5-(8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮2,2,2-三氟乙酸盐的合成
将中间体3-(2-(4-氨基-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-5-基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(270mg,0.547mmol,1.0eq)溶于无水乙醇(4ml)中，降温至0～10℃，加入30％氯化氢乙醇溶液(4ml)，加毕，室温搅拌12h。lc-ms监测反应完全，浓缩，加入乙酸乙酯(10ml)，浓缩，重复三次，所得固体再用乙酸乙酯(10ml)浆洗，过滤，滤饼经制备hplc(质量分数0.1％三氟乙酸水溶液：乙腈＝70:30)纯化得产品(64.6mg,收率:23.3％)。
步骤8：4-氨基-5-(5-(8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮的合成：
将中间体5-(5-(8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-3h-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)-4-氨基噻吩并[2,3-b]吡啶-6(7h)-酮2,2,2-三氟乙酸盐(61.8mg,0.12mmol,1.0eq)溶于无水甲醇(3ml)中，加乙酸(7.3mg,0.12mmol,1.0eq)和37％的甲醛水溶液(49.3mg,0.60mmol,5.0eq)，室温搅拌1h，加氰基硼氢化钠(61.1mg,0.97mmol,8.0eq)，室温搅拌1h，lc-ms监测，再补加氰基硼氢化钠(98.6mg,1.2mmol,10.0eq)，减压浓缩，粗品经反相柱层析(质量分数0.1％盐酸水溶液:乙腈＝70:30)纯化得到产品(3.5mg，收率:7％)。
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):12.98(s,1h),12.21(s,1h),10.55(s,1h),9.49-9.31(s,2h),8.23(s,1h),8.00-7.95(d,1h),7.63-7.60(d,1h),7.45-7.30(d,1h),7.23-7.17(d,1h),3.90(s,3h),3.17(m,1h),3.00-2.97(m,1h),2.89(m,2h),2.73-2.71(m,1h),2.67-2.65(m,2h),2.33-2.29(m,1h),2.12-2.02(m,2h),1.98-1.93(m,1h).
分子式:c21h22n6os分子量:406.51lc-ms(pos,m/z)＝407.04[m+h]+.
根据下述实验例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实验例1酶学活性测试
测试物：表1所示本发明化合物，由实施例方法制备。试验方法：
(1)制备化合物储备液
将化合物溶解于100％dmso制备成最高浓度为500μm的储备液。
(2)制备化合物工作液
稀释化合物储备液至化合物终浓度为500，150，50，15，5，1.5，0.5，0.15，0.05μm，成为化合物工作液(50x)。
(3)制备不同酶反应液
(a)map4k1(hpk1)反应液
hpk1酶溶解于8mmmops(ph7.0)，0.2mmedta，0.33mg/ml髓鞘碱性蛋白中，制备成为终浓度为1.7nm的酶液。10mm醋酸镁，[γ-33p]-atp组成mg/atp混合液，激活酶学反应。
其中，化合物1、2、16、17和18，mg/atp混合液的[γ-33p]-atp浓度为10μm，
化合物25、26、39、47、48、49、50、51、56和57，mg/atp混合液的[γ-33p]-atp浓度为15μm。
(b)map4k3(glk)
map4k3酶溶解于8mmmops(ph7.0)，0.2mmedta，250μmrlgrdkyktlrqirq中，制备成为终浓度为5nm的酶液。终浓度为10mm醋酸镁，45μm[γ-33p]-atp组成mg/atp混合液，激活酶学反应。
(4)酶促反应
在384孔板中，加入化合物工作液，使终浓度分别为10000，3000，1000，300，100，30，10，3，1nm，再加入按照上述条件制备的不同酶反应液，室温孵育40min后，加入0.5％磷酸溶液终止试验。取10μl反应液滴至p30滤纸，以0.425％磷酸溶液清洗4次后，甲醇清洗一次，置于闪烁计数仪检测，2％dmso替代化合物溶液，作为阳性对照(max)；高浓度阳对药(map4k1使用10μm星孢菌素、map4k3使用100μmpkr抑制剂)抑制剂替代化合物溶液，作为阴性对照(min)。
表2本发明化合物的酶抑制活性
“-”代表未测定
由表2实验结果可见，本发明的化合物对hpk1具有良好的抑制活性，且相对map4k3具有良好的选择性，说明本发明化合物在治疗由hpk1介导的疾病方面具有较好的临床应用潜力。
实验例2本发明化合物的人肝微粒体稳定性评价
测试物：表1所示本发明化合物和公开号wo2016205942a1专利的化合物a1
目的：评价本发明化合物的人肝微粒体稳定性。
温孵体系的构成：
试验步骤：
(1).从-80℃冰箱中取出肝微粒体(20mg蛋白/ml)，置于37℃水浴恒温振荡器上预温孵3min，融化待用。
(2).按照上面“实验温孵体系的构成”比例，制备温孵体系混合溶液(不含化合物和β-nadph)，置于37℃水浴恒温振荡器上预孵育2min。
3).对照组(不含β-nadph)：分别取30μl水和30μl化合物工作溶液(10μm)加入到240μl步骤(2)所述温孵体系混合液中，涡旋30s，混匀，反应总体积300μl，复样。放入到37℃水浴恒温振荡器中进行孵育，并开始计时，取样时间点为0min和60min。
4).样品组：分别取70μlβ-nadph溶液(10mm)和70μl化合物工作溶液(10μm)加入560μl步骤(2)所述混合溶液中，反应总体积700μl，涡旋30s，混匀，复孔。放入到37℃水浴恒温振荡器中进行孵育，并开始计时，取样时间点为计时后0min,5min,10min,20min,30min,60min。
(5).涡旋3min后，12000rpm离心5min。
(6).取上清液50μl加入150μl水，涡旋混匀，lc/ms/ms进样分析。
数据分析：
用下列一级动力学公式计算半衰期(t1/2)和清除率(cl)：
ct＝c0*e–kt
t1/2＝ln2/k＝0.693/k
clint＝vd*k
vd＝1/肝微粒体中蛋白含量
注：k为化合物剩余量的对数与时间作图的斜率，vd为表观分布容积。
结果：
实验结论：本发明化合物较现有技术相比，具有较低的清除率，良好的肝微粒体稳定性。