一种制备P2X7R免疫原的方法与流程

本发明属于制药技术领域，涉及人类嘌呤能离子通道型受体7(purinergicligand-gatedionchannel7receptor,p2x7r)的胞外段免疫原制备、纯化及鉴定。

背景技术：

在细胞损伤、缺氧或炎症状态时，体内多种细胞释放大量atp，进入细胞外间隙的atp及其分解产物adp和amp作用于p2受体。p2受体包括离子通道型p2x受体(p2x1～7)和代谢型g-蛋白偶联p2y受体(p2y1/2/4/6/11/12/13/14)，其中atp/p2x7r信号通路参与诱导炎性细胞因子分泌，与炎症发生发展密切相关。t淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等多种免疫细胞上均可检测到p2x7r的表达。不同细胞利用atp/p2x7受体通路发挥不同的功能。在多种自身免疫性疾病的研究中已证实atp/p2x7受体信号通路对病程、病情的调控作用。p2x7r亚基的胞外环上有atp结合位点，胞内含有一个短链n端和一个长链c端，c端为p2x7r受体的主要功能结构域。n端的结构序列高度保守，由395个氨基酸残基组成，与p2x7r受体家族其它亚型有35％-40％的同源性；c端由200个氨基酸残基组成，是p2x受体家族成员中最长的，与p2x受体家族其它亚型无同源性。

研究证实应用小鼠的p2x7r抗体阻断p2x7r的体内信号传导，可减轻atp诱导的炎症反应。因此p2x7r抗体成为治疗炎症及自身免疫性疾病的新靶标，而且可以从源头减少促炎因子的释放，因而靶向p2x7r的药物可能较靶向其它参与炎症或免疫性疾病的促炎因子等具有更广阔治疗效果和应用范围。

目前主要使用p2x7r拮抗剂研究及治疗相关炎症及自身免疫性疾病，如临床使用p2x7r拮抗剂azd9056及ec-224.535治疗自生免疫性疾病类风湿性关节炎，但效果不明显。因此本领域急切需要靶向且高效的治疗患者的抗p2x7r抗体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种制备p2x7r免疫原的方法，本发明的有益效果是能够获得免疫原性p2x7r胞外段，用于p2x7r抗体制备。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：对p2x7r蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点ndei和hindiii将p2x7r胞外段基因编码序列插入到表达载体pet30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；

步骤2：将构建好的含有p2x7r胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到bl21表达菌株中并进行iptg诱导表达，将含有重组质粒的bl21菌种接种到4ml的lb培养基中，待培养至od600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mmiptg，之后分别置于15℃、37℃诱导表达，取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入pbs液重悬沉淀，最后加入sds-page上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳，电泳后取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰；

步骤3：(1)上清中亲和层析纯化p2x7r蛋白；全菌采用20mmpb，300mmnacl，20mmimidazole含1％tritonx-100，1mmdtt，1mmpmsf超声裂解，同时以20mmpb，300mmnacl，20mmimidazole缓冲液平衡ni-ida亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行sds-page分析检测；

(2)包涵体通过亲和层析纯化p2x7r蛋白；

包涵体采用20mmpb，300mmnacl含1％tritonx-100，5mmdtt洗涤后，以20mmpb，300mmnacl，8murea，20mmimidazole，1mmdtt缓冲液溶解包涵体同时平衡ni-ida柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行sds-page分析检测。

附图说明

图1为图1sds-page分析p2x7r蛋白于bl21(de3)表达情况；

图2为sds-page分析p2x7r蛋白上清纯化结果；

图3为sds-page分析包涵体中p2x7r蛋白纯化结果；

图4为p2x7r蛋白质检结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

一种制备p2x7r免疫原的方法，按照以下步骤进行：

步骤1：p2x7r胞外区域的克隆；

使用密码子优化软件对p2x7r蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点ndei和hindiii将p2x7r胞外段基因编码序列插入到表达载体pet30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性。为了便于纯化，在重组蛋白的n端添加了his-tag。

步骤2：表达；

将构建好的含有p2x7r胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到bl21(de3)表达菌株中并进行iptg诱导表达。将含有重组质粒的bl21菌种接种到4ml的lb培养基中(含50μg/ml的硫酸卡那霉素)，待培养至od600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mmiptg，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。

取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入pbs液重悬沉淀，最后加入sds-page上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳后取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见图1，其中lanem:sds-pageproteinmarker；lane0:对照；lane1:15℃诱导16h；lane2:37℃诱导16h。

步骤3：纯化；

(1)上清中亲和层析纯化p2x7r蛋白

全菌采用20mmpb(ph7.2)，300mmnacl，20mmimidazole含1％tritonx-100，1mmdtt，1mmpmsf超声裂解，同时以20mmpb(ph7.2)，300mmnacl，20mmimidazole缓冲液平衡ni-ida亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行sds-page分析检测，分析结果见图2，lanem:sds-pageproteinmarker；lane1:全菌破菌离心后上清；lane2:上清同ni-ida孵育后流出液；lane3:50mmimidazole的洗脱组分；lane4-6:100mmimidazole的洗脱组分；lane7-9:300mmimidazole的洗脱组分。

(2)包涵体通过亲和层析纯化p2x7r蛋白

包涵体采用20mmpb(ph7.2)，300mmnacl含1％tritonx-100，5mmdtt洗涤后，以20mmpb(ph7.2)，300mmnacl，8murea，20mmimidazole，1mmdtt缓冲液溶解包涵体同时平衡ni-ida柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行sds-page分析检测。分析结果见图3。lanem:sds-pageproteinmarker；lane1:包涵体溶解离心后上清；lane2:上清同ni-ida孵育后流出液；lane3-4:50mmimidazole的洗脱组分；lane5-7:100mmimidazole的洗脱组分；lane8-10:500mmimidazole的洗脱组分；

经ni-ida亲和层析纯化分析，收集纯度相对较高的lane4-7，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[1×pbs(ph7.4)，4mmgsh，0.4mmgssg，0.4ml-arginine，2mmedta]中复性，复性后p2x7r蛋白最终透析于储存液1×pbs(ph7.4)溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，-80℃冻存。

步骤4：p2x7r蛋白质检；

(1)p2x7r蛋白稳定性测试(冻融实验)

取一支分装后冻于-80℃的p2x7r蛋白，放置于冰水混合物中待其缓慢融化，融化后无异常现象，说明p2x7r蛋白冻融实验是正常的。

(2)p2x7r蛋白浓度及纯度测定

用bsa做标准品，采用bradford法测定蛋白浓度为0.439mg/ml。>90％，评估来源于r250染色的sds-page胶，如图4所示。lane1:bsa(1.50μg)；lane2:p2x7rprotein(1.50μg)；m1:sds-pagemarker；m2:westernblotmarker；usinganti-hisantibody。

(3)p2x7r蛋白wb检测。

本发明提供的p2x7r蛋白胞外段，可用于p2x7r抗体制备，具有实际应用价值，为临床由p2x7r介导的炎症及自身免疫性疾病的检测提供了免疫学方法；本发明提供的p2x7r蛋白胞外段，可用于p2x7r抗体制备，p2x7r单克隆抗体分子作为药物用于临床上由p2x7r介导的炎症及自身免疫性疾病的使用。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。