一种ACAT1基因干扰的嵌合抗原受体T细胞的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，更具体地涉及一种acat1基因干扰的嵌合抗原受体t细胞。
背景技术：
：胆固醇是存在于哺乳动物细胞膜中的必需脂质分子,大多数器官和组织的细胞通过内源性胆固醇生物合成满足了对膜胆固醇的需求。然而，异常高的胆固醇水平，特别是游离(未酯化)胆固醇，对细胞有害。细胞可以通过抑制内源性胆固醇生物合成和ldl受体表达，以应对胆固醇负荷。此外，这些细胞也已经发展出其他机制来预防。通过胆固醇酰基转移酶(acat)，将游离胆固醇转化为胆固醇酯，以防止细胞膜上的游离胆固醇过度积累。编码胆固醇酯化酶的两个关键基因是acat1和acat2。acat1广泛表达与各种细胞内，而acat2主要表达于肝脏和小肠。大量的研究表明膜脂可以直接调节t细胞信号传导和免疫功能。胆固醇作为细胞膜的关键组成部分，已被证明是形成t细胞受体(tcr)聚合和形成t细胞免疫突触所必需的。嵌合抗原受体t细胞(cart)免疫疗法是通过整合嵌合抗原受体的经过基因修饰的t细胞来抵抗肿瘤细胞的疗法。嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原，识别结合后将激活及增殖信号传递至t细胞内，引起t细胞激活，增殖，释放细胞因子，从而杀伤肿瘤细胞。cart的杀伤效率决定了其在体内的抗肿瘤效果，因此，如何提高cart的肿瘤杀伤效率具有关键意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种acat1基因干扰的嵌合抗原受体t细胞。具体地，本发明通过rnai的方式干扰胆固醇酯化酶acat1基因，从而显著提升了cart的肿瘤杀伤效率。在本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物的结构如下式a或式b所示：b1-z-b2(a)b2-z-b1(b)式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；b1为第一表达盒，所述的第一表达盒用于表达抑制acat1基因表达的干扰rna；b2为第二表达盒，所述的第二表达盒用于表达嵌合抗原受体；z为任选的间隔序列。在另一优选例中，所述的第二表达盒含有编码所述的嵌合抗原受体(car)的核酸序列。在另一优选例中，所述干扰rna针对的靶序列如seqidno.:1所示。在另一优选例中，所述的干扰rna选自下组：shrna，mirna、pirna、和sirna。在另一优选例中，所述的干扰rna为shrna。在另一优选例中，所述的shrna的序列如seqidno.:2所示。在另一优选例中，所述的干扰rna的序列如seqidno.:14所示。在另一优选例中，所述的第一表达盒还包含第一启动子序列。在另一优选例中，所述的第一启动子包括u6启动子。在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列的长度为m个核苷酸，其中m为1-20(较佳地1-10)的正整数。在另一优选例中，所述的间隔序列的长度为3-30bp，较佳地为4-20bp。在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式c所示：l－scfv－h－tm－c－cd3ζ(c)式中，各“－”独立地为连接肽或肽键l为任选的引导序列(leadersequence，即信号肽序列)；scfv为抗原结合结构域；h为绞链区；tm为跨膜结构域；c为共刺激信号受体酪氨酸激活基序(共刺激分子)；cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。在另一优选例中，所述的l为选自下组的蛋白的信号肽：cd8、gm-csf、cd4、cd137、或其组合。在另一优选例中，l的序列如seqidno.:12的第1-25位所示。在另一优选例中，所述scfv为靶向肿瘤抗原的抗体单链可变区序列。在另一优选例中，所述scfv为靶向选自下组抗原的抗体单链可变区序列：cd19、cd20、cd22、cd123、cd47、cd138、cd33、cd30、mesothelin、egfr、gpc3、bcma、erbb2、nkg2dligands、lmp1、epcam、vegfr-1、lewis-y、ror1、claudin18.2、或其组合。在另一优选例中，scfv包括靶向cd19的抗原结合结构域。在另一优选例中，scfv为靶向cd19的抗原结合结构域，优选地scfv的序列如seqidno.:12的26-810位所示。在另一优选例中，所述的h1为选自下组的蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、或其组合。在另一优选例中，绞链区的序列如seqidno.:12的811-945位所示。在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：cd28、cd3epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。在另一优选例中，tm为源于cd8的跨膜区，优选地tm的序列如seqidno.:12的946-1017位所示。在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号受体酪氨酸激活基序：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。在另一优选例中，c为4-1bb来源的共刺激信号受体酪氨酸激活基序，优选地c的序列如seqidno.:12的1018-1143位所示。在另一优选例中，cd3ζ的序列如seqidno.:12的1144-1482位所示。在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体的序列如seqidno.:12所示。在另一优选例中，编码所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如seqidno.:13的第3675-5156位所示。在另一优选例中，所述的第二表达盒还包含第二启动子序列。在另一优选例中，所述的第二启动子选自下组：组成型启动子、或诱导型启动子。在另一优选例中，所述的第二启动子包括ef1α启动子。在本发明的第二方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明的第一方面所述的核酸构建物。在另一优选例中，所述的载体为质粒、病毒载体。在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体、腺病毒载体。在另一优选例中，所述的载体为pll3.7载体。在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明的第二方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明的第一方面所述的核酸构建物。在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。在另一优选例中，所述细胞为人或非人的哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述细胞为t细胞。在另一优选例中，所述细胞的acat1基因的表达被抑制。在本发明的第四方面，提供了一种细胞制剂，所述细胞制剂含有嵌合抗原受体细胞，所述的嵌合抗原受体细胞含有本发明的第二方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明的第一方面所述的核酸构建物。在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体细胞的acat1基因表达受抑制。在另一优选例中，所述的细胞制剂为液态。在另一优选例中，所述细胞制剂的细胞浓度为1×104-1×1010个细胞/ml，较佳地为1×105-1×109个细胞/ml。在另一优选例中，所述细胞制剂的剂型包括注射剂。在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明的第一方面所述的核酸构建物、本发明的第二方面所述的载体、或本发明的第三方面所述的细胞。在本发明的第六方面，提供了一种本发明的第一方面所述的核酸构建物、本发明的第二方面所述的载体、或本发明的第三方面所述的细胞、或本发明的第四方面所述的细胞制剂、或本发明的第五方面所述的药物组合物的用途，用于制备抑制肿瘤细胞的药物或制剂。在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自下组：白血病细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、骨髓瘤细胞。在本发明的第七方面，提供了一种抑制acat1基因表达的干扰rna，所述干扰rna针对的靶序列如seqidno.:1所示。在本发明的第八方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明的第三方面所述的细胞、或本发明的第四方面所述的细胞制剂、或本发明的第五方面所述的药物组合物。在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。在本发明的第九方面，提供了一种制备car-t细胞(car-修饰的t细胞)的方法，所述方法包括步骤：将本发明的第一方面所述的核酸构建物或本发明的第二方面所述的载体转导入t细胞内，从而获得所述car-t细胞。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了pll3.7-(shrna-a/nc)-egfp载体结构示意图。图2显示了重组质粒ecori酶切鉴定结果。图3显示了acat1-shrna在jurkat细胞上的干扰效果检测结果。其中，图3a显示了pll3.7-shrna-a-egfp和pll3.7-shrna-nc-egfp两种病毒在jurkat细胞上的感染效率接近100％。图3b显示了经pll3.7-shrna-a-egfp感染的jurkat细胞其acat1基因转录明显下调。图3c显示了经pll3.7-shrna-a-egfp感染的jurkat细胞其acat1蛋白水平显著下调。图3d显示了经shrna干扰的jurkat细胞其acat1mrna水平能够被持续降低。图4显示了pll3.7-car19、pll3.7-shrna-a-car19、pll3.7-shrna-nc-car19三种质粒的结构示意图。图5显示了acat1-shrna-cart杀伤效率结果(e:t＝0.5：1)。其中，图5a和图5b显示了各组别流式细胞仪检测结果，图5c显示了各组别对nalm6的杀伤效率。具体地，靶细胞nalm6细胞经efluor670染色后与效应细胞共培养，0h(上排)和6h(下排)分别在流式细胞仪上选择fl4通道进行efluor670的检测，圈出所有efluor670阳性的细胞，结果如图5b所示；efluor670阳性圈门后，选择fl2通道进行pi染色，pi染色阳性的细胞即为凋亡细胞。根据流式结果，计算各组别对nalm6的杀伤效率，如图5c所示。图6显示了pll3.7-(shrna-a/b/c/nc)-egfp重组质粒ecori酶切鉴定结果。图7a显示了设计的三种不同序列(shrna-a/b/c/nc)的shrna在acat1mrna水平上的干扰效果。图7b显示了设计的三种不同序列(shrna-a/b/c/nc)的shrna在acat1基因转录上的干扰效果。图8显示了一种典型的shrna的结构。具体实施方式本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种抑制acat1基因表达的干扰rna，以及包含所述干扰rna和嵌合抗原受体编码序列的核酸构建物，并基于所述shrna和核酸构建物制备了增强型的car-t细胞。实验表明，本发明的干扰rna可以有效抑制acat1基因的表达，显著增强car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。在此基础上完成了本发明。嵌合抗原受体本发明的嵌合抗原受体(car)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的car的胞外结构域包括靶向cd19的抗原结合结构域。本发明的car当在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1bb信号传导结构域、和cd3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。在一个实施方式中，本发明的car包括被称为抗原结合结构域的靶-特异性结合元件。本发明car的抗原结合结构域为靶向cd19的特异性结合元件。对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与car中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。本发明的car中的胞内结构域包括4-1bb的信号传导结构域和cd3ζ的信号传导结构域。核酸构建物本发明提供了一种抑制acat1基因表达的干扰rna，所述干扰rna的靶序列如seqidno.:1所示，优选的干扰rna为shrna，优选地shrna的序列如seqidno.:2所示。本发明还提供了包含所述干扰rna和嵌合抗原受体编码序列的核酸构建物。具体地，所述的核酸构建物包含第一表达盒和第二表达盒，其中，所述的第一表达盒包含抑制acat1基因表达的干扰rna，所述的第二表达盒包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。本发明也提供了其中插入本发明的核酸构建物的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。简单概括，通常通过可操作地连接干扰rna至启动子，作为第一表达盒，并可操作地连接编码car多肽或其部分的核酸至启动子，作为第二表达盒，将第一表达盒和第二表达盒并入表达载体，实现干扰rna以及编码car的天然或合成核酸的共表达。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。一种优选的包含本发明核酸构建物的载体的序列如seqidno.:14所示。本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，ui-tei等，2000febsletters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如sambrook等(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(deliveryvehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(exvivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。在本发明的一种优选的实施方式中，所述载体为慢病毒载体。rna干扰(rnai)如本文所用，术语“rna干扰(rnainterference，rnai)”是指：一些小的双链rna可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mrna降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为rna干预或者rna干涉。rna干扰是高度特异的在mrna水平上的基因沉默机制。如本文所用，术语“小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)”、“干扰rna”是指一种短片段双链rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰途径(rnainterferencepathway)。在本发明中，干扰rna包括sirna、shrna以及相应的构建物。一种典型的构建物为双链，并且其正链或负链含有式ai所示的结构：seq正向-x-seq反向式ai式中，seq正向为acat1基因或片段的核苷酸序列；seq反向为与seq正向基本上互补的核苷酸序列；x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和seq反向不互补。在本发明的一个优选例中，seq正向、seq反向的长度为19-30bp，较佳地为20-25bp。在本发明中，一种典型的shrna如图8中的式aii所示，式中，seq’正向为seq正向序列对应的rna序列或序列片段；seq’反向为与seq’正向基本上互补的序列；x’为无；或为位于seq’正向和seq’反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq’正向和seq’反向不互补，||表示在seq正向和seq反向之间形成的氢键。一种优选的实施方式中，所述的间隔序列x的长度为3-30bp，较佳地为4-20bp。一种优选的实施方式中，所述的shrna可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的shrna可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。通过与mirna的加工相同的rnai机制，shrna可以被加工成sirna。使用细菌或病毒载体，shrna被导入靶细胞的细胞核内，在某些情况下，载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同，shrna可被rna聚合酶ii或者iii催化转录。在被exportin-5转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先用drosha及其双链rna结合伴侣dgcr8加工形成pre-shrna。pre-shrna随后被dicer和trbp/pact酶切，去除发卡结构，产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链sirna。这一有活性的sirna随后被整合到沉默复合物上去。一种优选的实施方式中，所述的shrna被剪切形成干扰acat1基因表达的sirna，较佳地，所述的sirna的序列如seqidno.:14所示。一种优选的实施方式中，所述的shrna的序列如seqidno.:2所示。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多8个不匹配的核苷酸，优选地，具有1、2、3、4、5个不匹配的核苷酸。如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。本发明中，“茎环结构”可存在于式aii所示shrna的末端，例如由于seq’正向和seq’反向形成基本互补后，x’会形成一固定的末端茎环结构；所述的“茎环结构”还可存在于式aii所式shrna内部，例如由于seq’正向和seq’反向之间并非完全互补，造成未互补结合seq’正向和seq’反向的碱基会形成一内部的茎环(internalloop)。治疗性应用本发明包括用编码本发明核酸构建物的慢病毒载体(lv)转导的细胞(例如，t细胞)进行的治疗性应用。转导的t细胞可引起car-介导的t-细胞应答，并且转导的t细胞的acat1基因被抑制，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的t细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达本发明核酸构建物的t细胞。在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中t细胞被基因修饰以表达本发明的核酸构建物，得到acat1基因被抑制的car-t细胞，且car-t细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。在一个实施方式中，本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗cd19car-t细胞引起抗表达cd19的细胞的特异性免疫应答。尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-cd19scfv、铰链和跨膜区、和4-1bb和cd3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。本发明的car-修饰t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和car-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的car-修饰的t细胞。本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如il-2、il-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.ofmed.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ara-c)或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对pml患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的t细胞(如，car-t20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。本发明的主要优点包括：(a)首次利用rnai干扰acat1基因,可以促进cart的肿瘤杀伤效率；(b)本研究所设计的如表1所示的acat1的rnai序列，可以有效的实现对acat1基因的干扰；(c)本发明所设计的整合了acat1rnai的基于pll3.7的cd19-car载体，证实了能显著提高cd19-cart的杀伤效率，但本
发明内容不限于用pll3.7构建的car载体，应适合于所有适合于构建cart的其他质粒载体，靶点也不限于cd19-cart，应适合于所有靶点的cart。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例中部分通用材料如下所示：pei(聚乙烯亚胺)：购自thermo；opti-mem培养基：购自thermo；polybrene：购自millipore；il-2：购自peprotech；x-vivo15：购自lonza；transact：购自metyni；pll3.7载体：(华东师范大学李大力教授实验组赠与)。实施例1pll3.7-acat1-shrna干扰载体的构建1.1rnai靶序列设计根据网站(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)设计acat1基因rnai靶序列，结果表1所示。表1.acat1基因rnai靶序列靶序列名称起始位置rnai靶序列的核苷酸序列gc％seqidno.靶序列a131ggtgcaggaaataagatatgt38.1seqidno.:11.2根据靶向序列设计干扰序列：基于筛选出的靶序列，如下设计和确定干扰序列：5端以g开头，设定g+c含量为30％～50％。根据pll3.7载体的要求，在正义链5’端加t重建u6启动子l位的t，干扰靶序列后加loop环“ttcaagaga”，加入反转互补序列及终止信号“tttttt”，在3端再加上ecori酶切位点gaattc以方便鉴定。再补平xhoi酶切位点合成1对互补片段。最终干扰靶序列的sirna的序列为ccacguccuuuauucuauaca(seqidno.:14)。将序列打乱设计nc(negativecontrol)序列，各序列如下表2所示表2.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列1.3构建干扰质粒将合成的干扰片段稀释至浓度为0.1mol/l，上、下游片段各取10ul加入ep管中，轻轻混匀，95℃水浴锅5min后自然冷却至室温。取2ul产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测合链情况。干扰序列a和阴性对照序列nc的前体序列退火后，经丙烯酰胺凝胶电泳验证退火成功。空载pll3.7予以限制性内切酶xhoⅰ、hpaⅰ双酶切,胶回收后与合链的干扰片段连接过夜，构建重组质粒。重组质粒ecori酶切鉴定并测序。实施例2pll3.7-shrna-(a/nc)-(egfp/car19)慢病毒的包装1.质粒转染1)将质粒，pei，opti-mem培养基置于室温5min；2)取opti-mem436μl于1.5mlep管中，再加入64μgpei混匀，室温静置5min；3)取12μg载体质粒，8μgpspa×2，4μgpmd2.g，加入opti-mem至500μl，室温静置5min；4)将配好的pei-opti-mem溶液加入含质粒的opti-mem中，室温静置20min；5)将1mldna/pei混合物慢慢滴入前一天铺好的293t培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育，6-8h或者过夜；6)更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育。2.病毒收集和浓缩1)质粒转染48h后，收集上清后，添加10ml新鲜培养基继续培养至72h，再次收集上清，与48h收集的上清混合后，置于4℃冰箱内待用；2)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；3)以0.45μm滤器过滤得到的上清；4)将过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000转离心2h，用1/100上清体积的pbs进行稀释，反复吹打后转入密闭的离心管中4℃过夜；5)将病毒液分装至合适的体积，置于-80℃中保存，并取200μl病毒进行滴度测定。3.病毒滴度测定1)消化293t细胞，离心后计数，用含血清培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为4×105/ml，加入polybrene至12μg/ml，向24孔培养板的每孔中加入0.5ml细胞悬液；2)用全培养基按以下比例稀释病毒上清：1:3；1:9；1:27；3)分别将100μl病毒原液及按不同比例稀释后的病毒液，加入到已接种细胞的24孔板中；4)16h后弃去感染上清，添加0.5ml新鲜全培养基；5)48h后流式检测被感染细胞的目的基因表达；6)计算滴度，滴度＝2*106*感染效率*稀释倍数。结果如下：病毒收集浓缩后，经滴度检测，pll3.7-shrna-a-egfp、pll3.7-shrna-nc-egfp两种病毒的滴度分别为1*108、1.2*108。实施例3pll3.7-acat1-shrna-egfp载体干扰验证试验将jurkatt接种于24孔板中,每孔2×105个细胞，共9孔。分为3组：空白阴性对照及pll3.7-shrna-a-egfp慢病毒组、pll3.7-shrna-nc-egfp，每组各3孔。两个实验组分别按照moi＝10:1加入相应体积的病毒，并加入10μg/mlpolybrene促进感染。10h后将细胞进行收集，1000g离心10min，弃去培养基，加入新鲜培养基。慢病毒感染48h后收取细胞，流式检测gfp表达效率，即病毒感染阳性率。结果如图3a所示。pll3.7-shrna-a-egfp和pll3.7-shrna-nc-egfp两种病毒在jurkat细胞上的感染效率接近100％。收取感染48h后的三组jurkatt细胞。用trizol裂解细胞，抽提总rna，进行逆转录。q-pcr分析重组质粒的干扰效果。结果显示pll3.7-shrna-a-egfp慢病毒感染细胞后能显著干扰acat1的转录(图3b)。经pll3.7-shrna-a-egfp感染的jurkat细胞其acat1蛋白水平也显著下调(图3c)。为了验证pll3.7-shrna-a-egfp慢病毒感染细胞能否持续抑制acat1的转录，分别收取感染0d、2d、4d、6d、8d细胞，检测acat1的转录水平。发现随着时间延长，shrna-a序列可以持续干扰jurkatt细胞acat1的表达，其mrna水平能够被持续降低(图3d)。实施例4acat1-shrna-cart促进cart肿瘤杀伤效率的验证实验1.acat1-shrna-cart的制备d0,取新鲜来源的脐血通过密度梯度离心分离pbmc后，用cd4/cd8磁珠进行免疫磁珠筛选，获得的阳性细胞按照1*106/ml的密度进行接种，添加含10％fbs、100u/mlil-2的x-vivo15培养基，然后按照1:100的比例加入transact，d2收集t细胞，离心换液，将cd19-car、pll3.7-shrna-a-car19、pll3.7-shrna-nc-car19三种慢病毒分别按照moi＝10:1的比例加入到培养基中，16h后离心换液，加入新鲜培养基继续培养。d6收集细胞进行流式检测。结果如图5所示。2.acat1-shrna-cart体外杀伤验证实验1)nalm6细胞的efluor670染色：制备单细胞悬液，1*106/ml。加入2mlpbs离心洗涤两次，清洗掉血清。用pbs重悬细胞，调整细胞密度为2*106/ml。加入等体积的10μmefluor670试剂，涡旋细胞，37℃避光孵育10分钟；加入4-5倍体积预冷的10％血清的完全培养基，冰上孵育5分钟；完全培养基洗3次。2)nalm6细胞与cart细胞的混合培养将上述经efluor670染色后的nalm6分别按照1*105/孔的数量接种至24孔板中；将cd19-car、pll3.7-shrna-a-car19、pll3.7-shrna-nc-car19三种cart和未感染病毒的pbmc分别按照5*104/孔的数量接种至预先接种nalm6的孔中，每组设三个重复，每孔补液至1ml；将细胞混合后的培养板放至37℃培养箱中培养6h；6h后，收集每孔中所有细胞，将细胞转移至流式管中，并加入pi进行孵育，上机检测。3)杀伤效率分析流式细胞仪上选择fl4通道进行efluor670的检测，圈出所有efluor670阳性的细胞，结果如图5b所示；efluor670阳性圈门后，选择fl2通道进行pi染色，pi染色阳性的细胞即为凋亡细胞。根据流式结果，计算各组别对nalm6的杀伤效率，如图5c所示。通过pi值计算了不同处理组内的肿瘤细胞的杀伤效率，shrna-a处理组具有最高的杀伤效率，为60％,与不进行acat1干扰的cd19-cart或acat1干扰空白序列的shrna-nc组相比，具有显著差异。因而充分证实了经acat1干扰的cd19-cart具有更好的杀伤效率。对比例c1和c2在筛选本申请的shrna-a干扰序列的过程中，申请人还同时针对多个不同靶序列设计了不同的干扰序列，并进行了相关实验。实验方法与实施例1-4相同。1.筛选出的其他rnai靶序列如表3所示，各靶序列对应的干扰序列的上下游片段如表4所示，其中shrna-a为实施例原有序列。表3.acat1基因rnai靶序列实施例靶序列名称起始位置rnai靶序列的核苷酸序列gc％seqidno.:实施例1靶序列a131ggtgcaggaaataagatatgt38.11对比例c1靶序列b137ggaaataagatatgtggaacg38.16对比例c2靶序列c263gcttggttccattgcaattca42.867表4.针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸序列利用与实施例1相同的方法，对干扰片段上、下游片段合链，合链情况正常。并进行酶切鉴定，结果5所示。利用与实施例2相同的方法，进行慢病毒包装。利用与实施例3相同的方法，检测pll3.7-shrna-a/b/c/nc-egfp质粒的干扰效果，结果如图7所示。图7a结果显示，在acat1mrna表达倍数来看，在众多被筛选的干扰rna中，shrna-a具有最好的效果，其均值为0.28，shrna-b和shrna-c的干扰组均值分别为0.44和0.80，因此shrna-a片段具有最优的干扰效果。图7b为经不同片段的shrna干扰后，westernblot检测acat1的蛋白水平，shrna-a的条带最淡，也显示出其干扰效果最强。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>华东师范大学上海邦耀生物科技有限公司<120>一种acat1基因干扰的嵌合抗原受体t细胞<130>p2017-1527<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>1ggtgcaggaaataagatatgt21<210>2<211>65<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>2tggtgcaggaaataagatatgtttcaagagaacatatcttatttcctgcaccttttttga60attcc65<210>3<211>69<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>3tcgaggaattcaaaaaaggtgcaggaaataagatatgttctcttgaaacatatcttattt60cctgcacca69<210>4<211>63<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400>4tggatccatagtcgtggtaatcttcaagagagattaccacgactatggatcctttttgaa60ttc63<210>5<211>68<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<400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