一种白细胞介素-6的制备方法与流程

本发明涉及生物制品
技术领域：
，进一步涉及分子生物学技术，具体涉及一种白细胞介素-6的制备方法。
背景技术：
：白细胞介素-6(interleukin6，il-6)是由纤维母细胞、巨噬细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞、以及多种瘤细胞所产生的细胞因子。il-1、病毒感染、双链rna及camp等，均可诱导正常细胞产生白介素6。白介素6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能，在机体的免疫应答中起重要作用。人类il-6的研究发展很快，目前，已实现了il-6基因借助大肠杆菌、酵母或真核细胞进行表达，并广泛应用于各种疾病的治疗和疫苗免疫。在目前的制备方法中，il-6的产率仍处于较低水平，这是由几方面因素共同导致的，首先目前常规的载体难以实现il-6天然基因的高效表达，尤其在异源表达系统中，表达效率更不理想。针对此问题，诸多研究者尝试通过基因改造对表达体系进行改良，并取得了一定的成果，然而由于基因重组后大肠杆菌与野生型相比其生理特性发生了变化，因此如果继续沿用野生型菌株的培养条件往往不能有效表达il-6；此外，应当针对il-6基因的特性匹配适宜的表达条件，从而提升表达效率。而且，对于表达产物的后续纯化也需要根据基因工程菌的特性、蛋白的特性进行具体设计。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种白细胞介素-6的制备方法，以解决目前白细胞介素-6生产效率较低的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是提高白细胞介素-6的纯化效率。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种白细胞介素-6的制备方法，包括以下步骤：1)提取人外周血t淋巴细胞总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-ttctagcaagctgggtcagatc-3’；5’-cggatgatgcatgacttggacc’；得到第一目的基因；2)提取蓝色犁头霉总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-tctggagctagaatcaagga-3’；5’-atcgtcatgcattgtcagaat-3’；得到第二目的基因；3)用限制性内切酶hindiii分别酶切所述第一目的基因和第二目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到第三目的基因；合成如下序列的dna片段：5’-ccatctgctcagcgcatggaactagcttgtactaagagcagtcggct-3’；用限制性内切酶asei分别酶切该dna片段以及所述第三目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到重组表达基因；4)用限制性内切酶bamhi与psti同时酶切所述多元表达基因和pcmv-mcs载体，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到重组表达载体；5)取木糖葡萄球菌接种于mrs培养基中，培养至菌液od630值为0.5；将菌液冰浴40min后，离心取沉淀；用0.15mmol/l的氯化钠溶液l0ml重悬沉淀，而后离心取沉淀，再悬浮于20mmol/l的氯化钙溶液中，得到感受态的木糖葡萄球菌；6)在电转杯中，将4μg步骤4)所述重组表达载体与150μl步骤5)所述感受态的木糖葡萄球菌混合，而后以电压1.3kv、电阻230ω、电容21uf的条件电转6.7ms；筛选阳性克隆，即得到重组表达菌株；7)取步骤6)所得的重组表达菌株，在mrs培养基中培养至菌液od630值为0.3，而后向其中加入等体积、等浓度的副干酪乳杆菌水悬液，调整ph至5.1，继续培养15h；而后向菌液中加入0.8mmol/l的ly294002，在32℃条件下诱导表达6h；8)取步骤7)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，再加入复性缓冲液进行稀释复性，而后将复性后的蛋白执行层析纯化。作为优选，步骤1)中所述提取人外周血t淋巴细胞总dna，包括以下步骤：取人外周血t淋巴细胞，接种于10mlrpmi1640培养液中，以37℃的温度，120rpm的转速摇瓶培养，至od680处吸光度为0.8时，以3000rpm的转速离心4min，向沉淀物中加入4ml以下成分的灭菌后的溶液：葡萄糖0.99g，1mol/l的tris·hcl25ml，0.5mol/l的edta20ml，加ddh2o定容至100ml；重悬沉淀，再向其中加入谷氨酰胺转氨酶至浓度为1mg/ml，在35℃条件下孵育40min，加入蛋白酶k至浓度为0.3mg/ml，继续在37℃条件下孵育3h，而后用等体积的酚-氯仿混合液抽提2次，用无水乙醇沉淀核酸，抽干后待用。作为优选，其中氯仿混合液中酚与氯仿的体积比为32:19。作为优选，步骤1)中pcr扩增体系为：1×lapcrbufferiimg2++，400μmdntp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，100ng模板dna，2.5u热启动tag酶，用ddh2o补足至50μl；步骤1)中pcr扩增反应条件为：95℃预变性2min；93℃变性30s，66℃退火1min，73℃延伸2min，30个循环；72℃最后延伸5min。作为优选，步骤2)中pcr扩增体系为：1×lapcrbufferiimg2++，400μmdntp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，1μl模板dna，2.5u热启动tag酶，用ddh2o补足至50μl；步骤2)中pcr扩增反应条件为：91℃预变性2min；96℃变性30s，62℃退火1min，73℃延伸3min，35个循环；77℃最后延伸5min。作为优选，步骤7)中所述继续培养15h，是在在气升式发酵罐中进行的，过程中持续以0.9vvm的速率向培养液中通入无菌空气。作为优选，步骤6)所述的筛选阳性克隆，是通过提取转化子的dna，而后利用测序方式实现的。作为优选，步骤8)所述变性缓冲液包括以下成分：80mmtris-hcl，7murea，10mmdtt，0.9mmedta。作为优选，步骤8)所述复性缓冲液包括以下成分：70mmtris-hcl，2.2murea，1.3mm胱氨酸，4mm半胱氨酸。作为优选，所述层析为阴离子交换层析，上样后、洗脱目的蛋白之前，先以含有0.2mnacl、67mmtris-hcl的溶液洗脱杂蛋白；用于洗脱目的蛋白的溶液包括以下成分：0.5mnacl，32mmtris-hcl。在以上技术方案中，人外周血t淋巴细胞、蓝色犁头霉以及木糖葡萄球菌均为常规菌株，购自中国工业微生物菌株保藏管理中心。所述hindiii、asei、bamhi、psti为常规的限制性核酸内切酶，上述酶制剂以及t4dna连接酶均购自华大基因科技服务有限公司。所述pcmv-mcs载体为常规市售产品，购自上海名劲生物科技有限公司。序列为5’-ccatctgctcagcgcatggaactagcttgtactaagagcagtcggct-3’的dna片段由本申请人设计，由上海生工生物工程有限公司合成。本发明提供了一种白细胞介素-6的制备方法，该技术方案首先研究了影响il-6天然基因表达效率的因素，并探索了外源性dna与l-6天然基因重组的可行性，以此为依托，对各类外源基因进行了筛选。意外发现整合有蓝色犁头霉部分结构基因的dna片段对il-6蛋白的表达具有显著的促进作用。在此基础上，本发明以密码子的偏好性为依据筛选表达系统，最终构建了全新的木糖葡萄球菌表达系统；针对异源表达不稳定的问题，本发明对上述dna片段进行了结构改进，利用asei将末端部分碱基切除，并设计了替换性序列，将其与pcmv-mcs质粒双酶切后连接，所得的重组载体通过电击转化方法导入感受态的木糖葡萄球菌中，实现异源表达。在此基础上，本发明优化了重组菌的培养条件，在菌体扩增到一定浓度后采用ly294002进行诱导表达，从而定向积累il-6蛋白；对于收集到的菌体蛋白，通过变性、复性手段去除杂质，再通过离子交换层析得到纯化的il-6蛋白。通过以上dna的结构改进，可提高异源表达的效率，同时有利于il-6蛋白的分离纯化。本发明可显著改善il-6蛋白的制备效率，并提高其纯化收率，同时不影响il-6蛋白的生物学活性。附图说明图1是电泳检测诱导后与未经诱导的il-6蛋白的表达结果，其中m为非预染蛋白marker。图2是电泳检测il-6蛋白的变复性结果，其中m为非预染蛋白marker。图3是电泳检测il-6蛋白的离子交换层析结果，其中l1为上样流穿液，l2为平衡缓冲液洗涤的杂蛋白，l3为洗脱缓冲液洗脱的蛋白，l4为清洗柱子的洗脱物。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。实施例1一种白细胞介素-6的制备方法，包括以下步骤：1)提取人外周血t淋巴细胞总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-ttctagcaagctgggtcagatc-3’；5’-cggatgatgcatgacttggacc’；得到第一目的基因；2)提取蓝色犁头霉总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-tctggagctagaatcaagga-3’；5’-atcgtcatgcattgtcagaat-3’；得到第二目的基因；3)用限制性内切酶hindiii分别酶切所述第一目的基因和第二目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到第三目的基因；合成如下序列的dna片段：5’-ccatctgctcagcgcatggaactagcttgtactaagagcagtcggct-3’；用限制性内切酶asei分别酶切该dna片段以及所述第三目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到重组表达基因；4)用限制性内切酶bamhi与psti同时酶切所述多元表达基因和pcmv-mcs载体，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到重组表达载体；5)取木糖葡萄球菌接种于mrs培养基中，培养至菌液od630值为0.5；将菌液冰浴40min后，离心取沉淀；用0.15mmol/l的氯化钠溶液l0ml重悬沉淀，而后离心取沉淀，再悬浮于20mmol/l的氯化钙溶液中，得到感受态的木糖葡萄球菌；6)在电转杯中，将4μg步骤4)所述重组表达载体与150μl步骤5)所述感受态的木糖葡萄球菌混合，而后以电压1.3kv、电阻230ω、电容21uf的条件电转6.7ms；筛选阳性克隆，即得到重组表达菌株；7)将重组表达菌株接种于100ml含氨苄抗性(amp+)的液体mrs培养基中，在37℃、200rpm的摇床上震荡培养，至od630值为0.3时，而后向其中加入等体积、等浓度的副干酪乳杆菌水悬液，调整ph至5.1，继续培养15h；而后添加诱导物ly294002至终浓度0.8mmol/l，以32℃的温度、180rpm的转速继续诱导培养6小时；同时设对照组，除不加诱导物ly294002外，其他操作相同；分别取诱导和未诱导的发酵培养液各取5ml，8000-10000rpm离心20min收集菌体。然后加入500μltris-hcl(ph8.0)重悬菌体，超声破碎后，14000g离心10min，分别收集上清与沉淀(沉淀依然使用500μltris-hcl重悬)。取以上4种样品各60μl，分别加入20μl4×蛋白上样缓冲液(含dtt)，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样10μl进行sds-page电泳检测，电泳检测结果如图1所示，诱导后的菌体沉淀中在15kd左右处出现一条蛋白条带，与预期大小相符。8)将诱导结束的发酵液，8000-10000rpm离心20min收集菌体；用适量tris-hcl(ph8.0)缓冲液重悬菌体，再次离心收集菌体；按每克菌体加10mltris-hcl(ph8.0)缓冲液重悬，超声(或高压均质等其他适宜方法)裂解菌体，裂解液在4℃、14000g离心30min，收集沉淀，即为包涵体；tris-hcl(ph8.0)缓冲液重悬包涵体，再次离心收集包涵体；按每克包涵体加入约10ml的变性缓冲液，溶解沉淀并4℃变性24h，4℃、14000g离心，上清即为变性后的il-6蛋白溶液；测定蛋白浓度，按复性后蛋白终浓度为0.1mg/ml计算所需复性缓冲液按体积，24小时内分次缓慢加入il-6蛋白变性液中，4℃，250rpm搅拌。复性结束后离心，收集上清，即为含有复性后il-6蛋白的溶液(如图2所示)；测定复性后溶液中的蛋白浓度，计算复性回收率，计算公式为：复性蛋白溶液浓度*体积/变性蛋白质量，结果显示重组蛋白的回收率可达70％；表1包涵体变复性液配方成分变性缓冲液50mmtris-hcl，8murea，10mmdtt，1mmedta(ph8.0)复性缓冲液20mmtris-hcl，2murea，1mm胱氨酸，3mm半胱氨酸(ph8.0)使用足够体积的20mmtris-hcl(ph8.0)平衡层析柱后，即可开始上样；使用2-3倍柱体积的tris-hcl冲洗柱子，洗去杂蛋白。使用2倍柱体积的0.05mnacl(20mmtris-hcl，ph8.0)洗涤杂蛋白。使用0.5mnacl(20mmtris-hcl，ph8.0)洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。使用1mnacl(20mmtris-hcl，ph8.0)彻底洗净柱上蛋白。纯化过程中每步需各取60μl的样品，分别加入20μl4×蛋白上样缓冲液(含dtt)，混匀后煮沸5-10分钟。然后各上样10μl进行sds-page电泳检测，电泳检测结果如图3所示。结果显示：在经过洗涤杂蛋白后，使用0.5mnacl(20mmtris-hcl，ph8.0)能够完全将的将目的蛋白il-6洗脱，并且il-6的纯度能够达到90％以上。纯化前后il-6蛋白溶液的蛋白浓度，计算回收率可达90％以上，同时还达到了很好的浓缩效果。实施例2本实施例用于考察实施例1所制备il-6蛋白的生物学活性。1)取抗凝血5ml，与hank’s液按体积比1:1混匀后，轻轻加于10ml的细胞分离液之面上，以1500-2000rpm离心(半径15cm水平转子)15分钟，取乳白色环状淋巴细胞层放入含10mlhank’s液的离心管中，充分混匀后，以1500-2000rpm离心10-30分钟，将沉淀细胞反复洗2次即得所需细胞；2)用rpim1640细胞培养基重新悬起沉淀的细胞，调整细胞浓度至5×106个/ml，并加入刀豆球蛋白a(cona，终浓度5μg/ml)，于5％co2、42℃培养42小时；3)离心收集外周血t淋巴细胞，用rpim1640细胞培养基重悬，计数调整其浓度为5×106个/ml，作为应答细胞；取无菌96孔板种板，实验孔每孔加入应答细胞50μl，调零孔不加细胞；4)将il-6蛋白样品适当稀释，使调整后蛋白浓度达到100ng/ml，然后用rpim1640细胞培养基以2倍稀释法依次稀释，每孔加入50μl样品，每个稀释梯度做6个重复孔，5％co2、42℃培养36h；同时设置调零孔(不加细胞，以细胞培养基补其)和阴性对照孔(不加蛋白样品，以细胞培养基补其)；以可溶性表达获得的活性il-6蛋白样品作为阳性对照，操作与样品组相同。5)每孔加入mts溶液30μl，继续培养3h后，置于低速震荡的摇床上震荡10min，酶标仪检测仪测定a490值。结果表明，实施例1所制备的il-6蛋白具有很好的诱导外周血t淋巴细胞增殖的能力，并且具有明显的浓度依赖性：即随着il-6蛋白浓度的增加，其促进外周血t淋巴细胞增殖的活性逐渐增强。另外，本发明所述制备的il-6蛋白较常规il-6蛋白活性有所提高，判定标准为(实验孔od490值-调零孔od490值)/(阴性对照空od490值-调零孔od490值)≥1.4，为具有明显的促t淋巴细胞增殖活性。实施例3一种白细胞介素-6的制备方法，包括以下步骤：1)提取人外周血t淋巴细胞总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-ttctagcaagctgggtcagatc-3’；5’-cggatgatgcatgacttggacc’；得到第一目的基因；2)提取蓝色犁头霉总dna，以如下序列的dna片段为一对引物，执行pcr扩增：5’-tctggagctagaatcaagga-3’；5’-atcgtcatgcattgtcagaat-3’；得到第二目的基因；3)用限制性内切酶hindiii分别酶切所述第一目的基因和第二目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到第三目的基因；合成如下序列的dna片段：5’-ccatctgctcagcgcatggaactagcttgtactaagagcagtcggct-3’；用限制性内切酶asei分别酶切该dna片段以及所述第三目的基因，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到重组表达基因；4)用限制性内切酶bamhi与psti同时酶切所述多元表达基因和pcmv-mcs载体，而后通过t4dna连接酶将二者连接，即得到重组表达载体；5)取木糖葡萄球菌接种于mrs培养基中，培养至菌液od630值为0.5；将菌液冰浴40min后，离心取沉淀；用0.15mmol/l的氯化钠溶液l0ml重悬沉淀，而后离心取沉淀，再悬浮于20mmol/l的氯化钙溶液中，得到感受态的木糖葡萄球菌；6)在电转杯中，将4μg步骤4)所述重组表达载体与150μl步骤5)所述感受态的木糖葡萄球菌混合，而后以电压1.3kv、电阻230ω、电容21uf的条件电转6.7ms；筛选阳性克隆，即得到重组表达菌株；7)取步骤6)所得的重组表达菌株，在mrs培养基中培养至菌液od630值为0.3，而后向其中加入等体积、等浓度的副干酪乳杆菌水悬液，调整ph至5.1，继续培养15h；而后向菌液中加入0.8mmol/l的ly294002，在32℃条件下诱导表达6h；8)取步骤7)诱导表达后的菌体，裂解获得包涵体，加入变性缓冲液溶解变性，再加入复性缓冲液进行稀释复性，而后将复性后的蛋白执行层析纯化。其中，所述提取人外周血t淋巴细胞总dna，包括以下步骤：取人外周血t淋巴细胞，接种于10mlrpmi1640培养液中，以37℃的温度，120rpm的转速摇瓶培养，至od680处吸光度为0.8时，以3000rpm的转速离心4min，向沉淀物中加入4ml以下成分的灭菌后的溶液：葡萄糖0.99g，1mol/l的tris·hcl25ml，0.5mol/l的edta20ml，加ddh2o定容至100ml；重悬沉淀，再向其中加入谷氨酰胺转氨酶至浓度为1mg/ml，在35℃条件下孵育40min，加入蛋白酶k至浓度为0.3mg/ml，继续在37℃条件下孵育3h，而后用等体积的酚-氯仿混合液抽提2次，用无水乙醇沉淀核酸，抽干后待用。其中氯仿混合液中酚与氯仿的体积比为32:19。步骤1)中pcr扩增体系为：1×lapcrbufferiimg2++，400μmdntp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，100ng模板dna，2.5u热启动tag酶，用ddh2o补足至50μl；步骤1)中pcr扩增反应条件为：95℃预变性2min；93℃变性30s，66℃退火1min，73℃延伸2min，30个循环；72℃最后延伸5min。步骤2)中pcr扩增体系为：1×lapcrbufferiimg2++，400μmdntp，0.2μm正向引物，0.2μm反向引物，1μl模板dna，2.5u热启动tag酶，用ddh2o补足至50μl；步骤2)中pcr扩增反应条件为：91℃预变性2min；96℃变性30s，62℃退火1min，73℃延伸3min，35个循环；77℃最后延伸5min。步骤7)中所述继续培养15h，是在在气升式发酵罐中进行的，过程中持续以0.9vvm的速率向培养液中通入无菌空气。步骤6)所述的筛选阳性克隆，是通过提取转化子的dna，而后利用测序方式实现的。步骤8)所述变性缓冲液包括以下成分：80mmtris-hcl，7murea，10mmdtt，0.9mmedta。步骤8)所述复性缓冲液包括以下成分：70mmtris-hcl，2.2murea，1.3mm胱氨酸，4mm半胱氨酸。所述层析为阴离子交换层析，上样后、洗脱目的蛋白之前，先以含有0.2mnacl、67mmtris-hcl的溶液洗脱杂蛋白；用于洗脱目的蛋白的溶液包括以下成分：0.5mnacl，32mmtris-hcl。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>厦门华厦学院<120>一种白细胞介素-6的制备方法<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttctagcaagctgggtcagatc22<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cggatgatgcatgacttggacc22<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tctggagctagaatcaagga20<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atcgtcatgcattgtcagaat21<210>5<211>47<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ccatctgctcagcgcatggaactagcttgtactaagagcagtcggct47当前第1页12