一种利用多顺反子表达策略制备成熟L-谷氨酸氧化酶的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种成熟l－谷氨酸氧化酶的生产方法。
背景技术：
：l－谷氨酸氧化酶(lgox)可以催化l－谷氨酸氧化酶生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢。α-酮戊二酸是一种重要的生物化合物。作为三羧酸循环的重要中间代谢产物之，α-酮戊二酸参与氨基酸、糖类、蛋白质以及脂肪代谢等重要生理过程，并且在微生物的碳氮代谢调控中起着重要作用。由α-酮戊二酸在细胞代谢上的重要性，其被广泛用于食品、医药、精细化工和化妆品行业，市场需求量巨大。此外，lgox还被用于测定谷氨酸或制成测定谷氨酸的生物传感器，用于发酵和食品工业中的成分分析等。来源于streptomycessp.x-19-6成熟的lgox是一个含有六个亚基(α2β2γ2)的聚体蛋白，其中α亚基约为40kda，β亚基约为16kda，γ亚基约为12kda。该lgox在大肠杆菌中重组表达后仅能获得lgox前体，需通过特殊处理后才可获得成熟酶。目前，主要采用来源于streptomycesgriseus的商业化金属蛋白酶(sgmp)，对lgox前体进行酶切处理，产生α，β，γ链片段，随后自发形成六聚体结构α2β2γ2，即成熟的lgox。技术实现要素：针对目前大肠杆菌重组表达的lgox需经过商业化蛋白酶metalloendopeptidasefromstreptomycesgriseus(sgmp)(cas：9036-06-0)酶切处理的缺点，本发明的目的在于公开了一种简易制备成熟l－谷氨酸氧化酶的生产方法，即利用多顺反子表达系统，分别表达α，β，γ蛋白片段，快速获取具有六聚体结构α2β2γ2的成熟lgox，从而降低lgox的制备成本。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：多顺反子表达l-谷氨酸氧化酶的生产方法，包括以下步骤：(1)利用多顺反子表达系统构建含有l-谷氨酸氧化酶基因pet-duet－αβγ的重组表达载体；具体包括如下步骤:①引物fα和rα通过pcr得到α片段，将其导入到pet-duetmcs1区域内；②引物fγ和if通过pcr得到γ片段,引物ir和rβ通过pcr得到β片段；③γ片段和β片段通过重叠pcr得到γ+β片段，将其导入到pet-duetmcs2区域内；(2)将重组表达载体pet-duet－αβγ和pet-duet(图2)用限制性内切酶线性化后转入到e.colibl21(de3)感受态细胞中，通过抗性筛选并结合酶活测定，获得能够高效表达lgox的重组菌pet-duet－αβγ：(3)重组菌pet-duet－αβγ使用诱导剂1mmiptg诱导表达重组蛋白，以40％超声破碎细胞功率去处理时间为0.5h破碎细胞，离心，收集上清液，获得成熟lgox。谷氨酸氧化酶的序列从ncbi上获知，序列号为：ab085623.1。本发明中根据已知基因序列，利用多顺反子表达策略来构建表达谷氨酸氧化酶；多顺反子表达构建成熟l-谷氨酸氧化酶的mcs1区域的基因，核苷酸序列为：seqidno.1所示。多顺反子表达构建成熟l-谷氨酸氧化酶的mcs2区域的基因，核苷酸序列为：seqidno.2所示。多顺反子表达构建成熟l-谷氨酸氧化酶的mcs1区域的基因编码的谷氨酸氧化酶蛋白质，其氨基酸序列为seqidno.3所示。多顺反子表达构建成熟l-谷氨酸氧化酶的mcs2区域的基因编码的谷氨酸氧化酶蛋白质，其氨基酸序列为seqidno.4所示。所述的重组质粒，是将所述谷氨酸氧化酶基因克隆到pet-duet中所得。一个基因由一个启动子驱动构成独立表达单元(表达盒)，多个表达盒克隆到同一个载体中。其基本构建策略是在载体中引入多个启动子，每个启动子下游含合适的多克隆位点(mcs)和转录终止序列等。这样可同时将多个开放阅读框(orf)通过不同的多克隆位点克隆到载体中，实现同一载体表达多个目标基因的目的。本研究是由两个独立的t7启动子控制两个基因表达形成的pet-duet－αβγ。其中第一个t7启动子用来表达mcs1中的γ+β链；另一个t7启动子用来表达mcs2中的α链。由此实现在pet-duet里表达这三个目的基因(α,β,γ)的目的，快速获得成熟lgox，从而降低lgox的生产成本。有益效果：本发明利用多顺反子表达系统，在pet-duet为载体的大肠杆菌宿主中分别表达α，β，γ蛋白片段，快速获得成熟lgox，从而降低lgox的生产成本，多顺反子表达lgox催化效率(kcat/km)(4.4*103)较重组lgox(2.2*105)而言高了50倍。酶活从38.8u/ml提升到了60u/ml，以满足α－酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备。附图说明图1.α+β+γ片段的pcr示意图；图2.mcs1和mcs2导入pet-duet示意图；图3.pet-duet－lgox(αβγ)酶切验证；其中:1：dl10000核酸marker；2:酶切验证；3:酶切验证；图4重组lgox和多顺反子表达lgox的sds－page电泳图；其中(a)1：low蛋白marker2:重组lgox；(b)1：low蛋白marker2:pet-duet空载对照3:多顺反子表达lgox图5.多顺反子表达lgox的最适反应温度和热稳定性；图6.多顺反子表达lgox的最适反应ph值和ph稳定性。具体实施方式实施例1α+β+γ克隆及表达载体的构建1.1α+β+γ基因的pcr扩增根据streptomycessp.x-119-6在genbank中登记的l-谷氨酸氧化酶基因序列，并根据多顺反子表达来设计引物进行pcr扩增:(1)引物fα和rα得到α片段，pcr扩增体系如下体系成分体积streptomycessp.x-119-6基因组1μl(20ng)引物fα和rα1μl,1μl5×primestarbuffer10μl2.5mmdntp4μlprimestar2μlddh2o32μl总体积50μlpcr扩增条件如下扩增条件预变性94℃5min变性94℃30s退火60℃30s延伸72℃90s30个循环终末延伸72℃10min保温4℃10min(2)引物fγ和if得到γ片段，pcr扩增体系如下体系成分体积streptomycessp.x-119-6基因组1μl(20ng)引物fγ和if1μl,1μl5×primestarbuffer10μl2.5mmdntp4μlprimestar2μlddh2o32μl总体积50μlpcr扩增条件如下(3)引物ir和rβ得到β片段，pcr扩增体系如下体系成分体积streptomycessp.x-119-6基因组1μl(20ng)引物ir和rβ1μl(20ng)5×primestarbuffer10μl2.5mmdntp4μlprimestar2μlddh2o32μl总体积50μlpcr扩增条件如下扩增条件预变性94℃5min变性94℃30s退火55℃30s30个循环延伸72℃90s终末延伸72℃10min保温4℃10min(4)引物fγ和rβ得到β+γ片段，pcr扩增体系如下体系成分体积β，γ1μlfγ和rβ1μl5×primestarbuffer10μl2.5mmdntp4μlprimestar2μlddh2o32μl总体积50μlpcr扩增条件如下扩增条件预变性94℃5min变性94℃30s退火58℃30s30个循环延伸72℃90s终末延伸72℃10min保温4℃10min1.2lgox基因表达载体的构建将扩增获得的基因片段(α片段和β+γ片段)进行pcr产物纯化后，连接pet-duet线性化载体转入e.coli感受态细胞中，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s后。快速转移到冰浴中冷却3min，向每管中加入液体800μllb培养基，37℃摇床80～90rpm温育45min，复苏细胞。4000rpm离心3min，剩余200μl感受态细胞涂布于含lb/amp平板上，平板倒置于37℃培养箱培养。阳性重组子采用菌落pcr和酶切鉴定。将阳性克隆子送金斯瑞有限公司进行测序。将重组质粒命名为pet-duet-lgox-αβγ。本发明利用多顺反子表达构建含有l－谷氨酸氧化酶α、β、γ链片段序列的重组表达载体pet-duet－αβγ。将γ+β链转到pet-duet中的mcs1中利用第一个t7启动子来表达。将α链转到pet-duet中的mcs2中利用另一个t7启动子来表达。体系成分体积pet-duet(线性化)4μlα、β+γ片段1μl5*buffer2μl酶1μlddh2o2μl总体积10μl实施例2重组lgox在大肠杆菌bl21中的诱导表达及其蛋白的纯化2.1重组lgox在大肠杆菌bl21中的诱导表达将含有pet-duet-lgox-αβγ的重组菌接入lb培养基中37℃培养至od600约为0.6时，加入终浓度1mmol/l的iptg，于25℃下诱导培养6h。该酶在大肠杆菌中实现了表达且粗酶液可达到38.8u/ml。2.2重组蛋白的纯化将诱导表达后的发酵液进行离心，然后收集菌体，用a液(20mmol/l磷酸钠，500mmol/lnacl，5mmol/l咪唑，ph8.0磷酸盐缓冲液)悬浮，超声破碎(功率285w，超声1s，间歇3s，共10min)收集上清。采用histrap亲和层析柱纯化重组蛋白，用b液(20mmol/l磷酸钠，500mmol/lnacl，500mmol/l咪唑，ph8.0磷酸盐缓冲液)梯度洗脱，收集活性部分。纯化后的lgox采用sds-page检测蛋白纯度。从sds-page上来看。多顺反子表达与在大肠表达的重组的前体lgox相比，其主要蛋白显示的大小位置不同(图4)。实施例3lgox酶活的测定和lgox酶学性质的研究3.1多顺反子表达lgox酶活的测定利用苯胺显色法进行检测(辣根过氧化物酶，4-氨基安替吡啉，苯胺，谷氨酸、磷酸缓冲液和适量酶)，于37℃下反应10min，测定其在550nm下的吸光值变化。以吸光值的变化来表示l-谷氨酸氧化酶的酶活力大小。一个酶活力单位定义:37℃下1min反应生成1μmol过氧化氢所需的酶量。3.2多顺反子表达lgox酶学性质的研究(1)最适反应温度和温度稳定性按照酶活测定方法，将等量的纯酶25，32，37，42，47，52℃下测定酶活，以所测的不同反应温度下最高酶活100％。考查不同温度对lgox活性的影响。将等量的纯酶在以上温度下保温6，12，24h后测定余酶活，以初始酶活为100％,考查其热稳定性，结果表明最适温度为42℃且在27℃下其稳定性较佳。(2)最适反应ph和ph稳定性按照酶活测定方法，将等量的纯酶置于ph为4-9(ph4-5的柠檬酸缓冲液；ph6-9的磷酸钠缓冲液)的缓冲液中，在最适反应温度下测定酶活，以所测的不同ph下最高酶活为100％，最适ph为6。在ph值为6.0的情况下，多顺反子表达lgox催化效率(kcat/km)(4.4*103)较重组lgox(2.2*105)而言高了50倍。而且，多顺反子表达lgox酶活从38.8u/ml提升到了60u/ml,ph在7-9的条件下稳定性较好，结果见表1所示。表1.一般重组表达的lgox和多顺反子表达成熟的lgox的性质差异性能重组lgox多顺反子表达lgoxkcat/km(m–1s–1)4.4×1032.2×105酶活38.8u/ml60u/ml本实验利用多顺反子表达系统制备成熟l－谷氨酸氧化酶，分别表达α，β，γ蛋白片段，快速获取具有六聚体结构α2β2γ2的成熟lgox，顺反子表达的效果和sgmp酶处理之后形成的稳定谷氨酸氧化酶效果是相同的。解决了目前大肠杆菌重组表达的lgox需经过商业化蛋白酶酶切处理的缺点，大大降低了生产谷氨酸氧化酶的成本。l－谷氨酸氧化酶(lgox)可以催化l－谷氨酸氧化酶生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢。也进一步对低成本生产α-酮戊二酸提供了理论基础。使α-酮戊二酸被广泛用于食品、医药、精细化工和化妆品行业成为可能。此外，lgox还被用于测定谷氨酸或制成测定谷氨酸的生物传感器，用于发酵和食品工业中的成分分析等。由于多顺反子表达谷氨酸氧化酶的策略使酶活提高且稳定性增强，故传感器中酶膜的成本被降低且在应用过程中更为稳定。序列表<110>南京工业大学<120>一种利用多顺反子表达策略制备成熟l-谷氨酸氧化酶的方法<141>2018-10-23<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1134<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>1atggccaacgagatgacctacgagcagctggcccgcgaactgctgctggtcggccccgcg60cccaccaacgaggacctcaagctgcggtacctcgacgtgctgatcgacaacggactcaat120ccccccggaccgcccaagcgcatcctgatcgtcggcgccggtatcgccggcctggtcgcc180ggtgacctgctgacccgcgccggacacgacgtgacgatcctggaggccaacgccaaccgg240gtcggcgggcggatcaagaccttccacgccaagaagggcgagccgtcgccgttcgccgac300cccgcgcagtacgcggaggcgggcgcgatgcgcctgcccagcttccacccgctgaccctg360gcgctgatcgacaaactcggcctgaagcgacggctgttcttcaacgtcgacatcgatccg420cagaccggcaaccaggacgcgccggtccccccggtgttctacaagtcgttcaaggacggc480aagacctggaccaacggcgcgcccagcccggagttcaaggagccggacaagcgcaaccac540acctggatccgcaccaaccgcgagcaggtgcggcgcgcccagtacgccacggacccctcc600agcatcaacgagggcttccacctcaccggctgcgagacccggctgaccgtctcggacatg660gtcaaccaggcgctggagccggtgcgcgactactactccgtgaagcaggacgacggaacg720cgggtcaacaagccgttcaaggaatggctggcgggctgggccgacgtcgtccgcgacttc780gacggctattcgatggggcgcttcctgcgcgagtacgcggagttcagcgacgaggccgtc840gaggcgatcggcaccatcgagaacatgacctcgcgcctccacctggcgttcttccacagc900ttcctggggcgcagcgacatcgacccccgcgccacgtactgggagatcgagggcggcagc960cgcatgctgccggaaacgctggccaaggacctgcgggaccagatcgtgatgggccagcga1020atggtgcggctggagtactacgaccccggccgcgacgggcaccacggcgaactcaccggt1080cccggcggaccggccgtcgccatccagaccgtccccgagggcgaaccgtactga1134<210>2<211>796<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>2catatggcggcgacccagacctggaccggtgacctggcgatcgtcaccatcccgttctcc60agcctgcggttcgtcaaggtgaccccgccgttctcgtacaagaagcgccgcgccgtcatc120gagacccactacgaccaggccaccaaggtgctgctggagttctcgcggcgctggtgggag180ttcaccgaggcggactggaagcgggagctggacgcgatcgcaccgggtctgtacgactac240taccagcagtggggcgaggacgacgccgaggccgcgtgataagaaggagatatatatggg300cggggtgcggccggccaccaacgcctacggcggcggttccaccaccgacaaccccaaccg360cttcatgtactacccctcccacccggtgcccgggacccagggcggtgtggtgctggccgc420ctactcctggtcggacgacgccgcccgctgggactccttcgacgacgccgagcgctacgg480ctacgccctggagaacctccagtcggtgcacggccgccggatcgaggtcttctacaccgg540cgccggccagacccagagttggctgcgcgacccgtacgcgtgcggagaggcggcggtcta600caccccgcaccagatgaccgccttccacctcgacgtggtccggcccgaggggccggtgta660cttcgccggtgagcacgtgtcgctgaagcacgcctggatcgagggagcggtggaaaccgc720cgtacgggccgccatcgccgtcaacgaggcacccgtgggggacacgggcgtcaccgcggc780cgccggttgactcgag796<210>3<211>376<212>prt<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>3alaasnglumetthrtyrgluglnleualaarggluleuleuleuval151015glyproalaprothrasngluaspleulysleuargtyrleuaspval202530leuileaspasnglyleuasnproproglyproprolysargileleu354045ilevalglyalaglyilealaglyleuvalalaglyaspleuleuthr505560argalaglyhisaspvalthrileleuglualaasnalaasnargval65707580glyglyargilelysthrphehisalalyslysglygluproserpro859095phealaaspproalaglntyralaglualaglyalametargleupro100105110serphehisproleuthrleualaleuileasplysleuglyleulys115120125argargleuphepheasnvalaspileaspproglnthrglyasngln130135140aspalaprovalproprovalphetyrlysserphelysaspglylys145150155160thrtrpthrasnglyalaproserprogluphelysgluproasplys165170175argasnhisthrtrpileargthrasnarggluglnvalargargala180185190glntyralathraspproserserileasngluglyphehisleuthr195200205glycysgluthrargleuthrvalseraspmetvalasnglnalaleu210215220gluprovalargasptyrtyrservallysglnaspaspglythrarg225230235240valasnlysprophelysglutrpleualaglytrpalaaspvalval245250255argasppheaspglytyrsermetglyargpheleuargglutyrala260265270glupheseraspglualavalglualaileglythrilegluasnmet275280285thrserargleuhisleualaphephehisserpheleuglyargser290295300aspileaspproargalathrtyrtrpgluilegluglyglyserarg305310315320metleuprogluthrleualalysaspleuargaspglnilevalmet325330335glyglnargmetvalargleuglutyrtyraspproglyargaspgly340345350hishisglygluleuthrglyproglyglyproalavalalailegln355360365thrvalprogluglygluprotyr370375<210>4<211>271<212>prt<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>4alaalathrglnthrtrpthrglyaspleualailevalthrilepro151015pheserserleuargphevallysvalthrproprophesertyrlys202530lysargargalavalilegluthrhistyraspglnalathrlysval354045leuleuglupheserargargtrptrpgluphethrglualaasptrp505560lysarggluleuaspalailealaproglyleutyrasptyrtyrgln65707580glntrpglygluaspaspalaglualaalaglyglyvalargproala859095thrasnalatyrglyglyglyserthrthraspasnproasnargphe100105110mettyrtyrproserhisprovalproglythrglnglyglyvalval115120125leualaalatyrsertrpseraspaspalaalaargtrpaspserphe130135140aspaspalagluargtyrglytyralaleugluasnleuglnserval145150155160hisglyargargilegluvalphetyrthrglyalaglyglnthrgln165170175sertrpleuargaspprotyralacysglyglualaalavaltyrthr180185190prohisglnmetthralaphehisleuaspvalvalargproglugly195200205provaltyrphealaglygluhisvalserleulyshisalatrpile210215220gluglyalavalgluthralavalargalaalailealavalasnglu225230235240alaprovalglyaspthrglyvalthralaalaalaglyargarggly245250255alaalaalaalathrgluprometarggluglualaleuthrser260265270<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>5ccatggccaacgagatgacctacgagcag29<210>6<211>46<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>6gaattctcaatgatgatgatgatgatggtacggttcgccctcgggg46<210>7<211>45<212>dna<213>人工序列(2ambysto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