一株抗地克珠利特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明涉及一株抗地克珠利特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。

背景技术：

地克珠利（diclazuril）是一种聚醚类药物，同时也是理想的抗球虫药物，具备高效低毒特点。地克珠利于1986年由比利时janssen公司研究开发，以杀菌灵在英国，德国等四十三个国家上市。地克珠利属于三嗪类广谱抗球虫药，可以有效预防和杀灭包括球虫在内的多种原虫。其中对柔嫩、堆型、布氏、巨型、和缓等6种最主要的艾美尔球虫的抗球虫指数均超过180，属于高效抗球虫药物，广泛用于鸡球虫病。

目前地克珠利检测多采用高效液相色谱法（hplc）、液相色谱与质谱联用法（lc-ms）、气质联用法（gc-ms）等。上述检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广，无法达到现场大批量快速检测的要求。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株抗地克珠利特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，为间接竞争elisa试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础。

本发明的技术方案，一株抗地克珠利特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株ss0711，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.14689，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2017年9月5日。

在本发明的一种实施方式中，抗地克珠利特异性单克隆抗体，其由所述保藏编号为cgmccno.14689，抗地克珠利特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株ss0711分泌产生。

在本发明的一种实施方式中，所述抗地克珠利特异性单克隆抗体的应用，将其应用于食品安全检测中地克珠利残留的分析检测。

在本发明的一种实施方式中，一种试剂盒，其含有所述的杂交瘤细胞株ss0711或者所述的抗地克珠利特异性单克隆抗体。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒，所述试剂盒用于检测地克珠利。

本发明提供的细胞株的制备基本步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：以带有羧基的地克珠利衍生物为起始反应物，通过碳化二亚胺法与蛋白载体相连，之后通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫balb/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇法使小鼠脾细胞和小鼠骨髓细胞融合，培养检测阳性细胞孔，并测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；ic50值和亲和力的测定通过elisa法。

在本发明的一种实施方式中，所述聚乙二醇采用的是peg2000。

在本发明的一种实施方式中，所述培养采用的是hat培养基。

在本发明的一种实施方式中，阳性细胞孔利用间接elisa方法进行检测，阳性细胞孔的抑制效果利用间接竞争elisa法检测。

本发明的有益效果：本发明获得的抗地克珠利单克隆抗体细胞株，对地克珠利有较好的检测灵敏度和亲和力，还提供了一种新的合成地克珠利免疫原的方法，半抗原的合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。本发明单克隆抗体的ic50＝0.49ng/ml，检测线性范围为0.16-1.55ng/ml，最低检测限值（lod）为0.08ng/ml。

生物材料样品保藏：一株抗地克珠利特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株ss0711，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，保藏编号为cgmccno.14689，分类命名为单克隆细胞株。

附图说明

图1免疫原的紫外吸收光谱表征。

图2单克隆抗体对地克珠利的标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明通过将地克珠利完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，hat选择性培养基培养，通过间接elisa和间接竞争elisa筛选细胞上清，最终得到了对地克珠利有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（cbs）：称取na2co31.59g，nahco32.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800ml混匀，调ph值至9.6，加双蒸水定容至1000ml，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.24gkh2po4，3.62gna2hpo4·12h2o，溶于800ml纯水中，用naoh或hcl调ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05%tween20的pbs；

tmb显色液：a液：na2hpo4·12h2o18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按体积比1︰5混合即为tmb显色液，现用现混。

实施例1：杂交瘤细胞株的制备

（1）完全抗原的合成：

半抗原的合成：在浓硫酸（50ml）和去离子水（10ml）的混合物溶液中加入了dic（1g，2.5mmol）的溶液。混合液在110℃反应24h。反应结束后，反应混合物用1l的去离子水稀释，以终止反应，然后用20ml的乙酸乙酯提取三次。有机层用nacl清洗，用mgso4烘干，然后在真空中蒸发，得到半抗原dic-hapten-1。具体合成路线如下：

完全抗原的合成：取5mg上述半抗原dic-hapten-1，再加入5.0mgedc（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和3.0mgnhs（n-羟基琥珀酰亚胺），使用dmf（n,n-二甲基甲酰胺）溶解，室温搅拌，活化6h；另取10mgklh（钥孔血蓝蛋白）溶解于3ml、0.05m、ph9.6的cb（碳酸盐缓冲溶液）溶液中，将上述活化液逐滴加入klh溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，-20℃分装保存。

（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的balb/c小鼠进行免疫。取地克珠利完全抗原（1mg/ml）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫balb/c小鼠，每只100μl。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免疫，准备融合。

（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规peg（聚乙二醇，分子量为2000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

b、收集sp2/0细胞，悬浮于rpmi-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、将脾细胞和sp2/0细胞按照计数比5-10:1的比例混合，离心后用peg融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入rpmi-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%co2的培养箱中培养。

（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行rpmi-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接elisa筛选出阳性细胞孔，第二步选用地克珠利为标准品，用间接竞争elisa对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对地克珠利有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株。

（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为igg2a型。

实施例2间接竞争酶联免疫吸附法的建立

将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于间接竞争酶联免疫吸附法方法的建立，具体步骤如下：

1、用碳酸盐缓冲液（cbs）稀释好的0.1μg/ml作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μl，37℃包被2h后，用pbst洗液洗板三次，每次每孔200μl，每次3min，拍干；

2、用含0.2%明胶的cbs进行封闭，每孔200μl，37℃封闭2h，用pbst洗液洗板三次，每次每孔200μl，每次3min，拍干；

3、用磷酸盐缓冲液（pbs）分别配置0，2，5，10，20，50，100，200μg/l的地克珠利标准溶液。将标准溶液分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μl，每个标准溶液重复3个孔，再每孔加入50μl1︰32000稀释的抗地克珠利单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

4、每孔加入100μl用含0.1%明胶的pbs1︰3000稀释的hrp标记的羊抗鼠igg二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

5、每孔加入100μltmb显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μl2mh2so4终止液，450nm测吸光值；

6、标准曲线绘制：用origin8.5绘制标准抑制曲线。

以间接竞争酶联免疫吸附法检测的吸光值为纵坐标，以地克珠利浓度为横坐标建立抗地克珠利单克隆抗体对地克珠利的标准抑制曲线，如图2所示。由所绘标准曲线可以计算出此单克隆抗体的ic50＝0.49ng/ml，检测线性范围为0.16-1.55ng/ml，最低检测限值（lod）为0.08ng/ml。

实施例3单克隆抗体应用

样品前处理及添加回收实验：对实际样品的添加回收实验，以鸡肉为例进行测试。首先，称取三份1.0g鸡肉，分别加入100μl、200μl及500μl地克珠利标准品溶液（100ng/ml），混匀，加入10ml乙腈，高速均质2min，超声提取10min，静置5min后，取200μl上清液用pbs稀释4倍后，作为elisa样品提取液，采用间接竞争elisa进行添加回收试验，其回收率分别为91%、97%、95%。

表1.单克隆抗体的亚型鉴定

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。