CHO细胞株及其制备方法和使用该CHO细胞株制备猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用与流程

本发明涉及一种稳定高效分泌表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒的cho细胞株及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术：

猪圆环病毒2型(porcinecircovirus,pcv-2)被认为是猪断奶后多系统衰竭综合征(pmws)、增生性坏死性肺炎(pnp)、猪皮肤与肾病综合征(pdns)、猪呼吸系统疾病综合征(prdc)、繁殖障碍、先天性震颤及肠炎等疾病的主要病原，统称猪圆环病毒2型相关疾病，而且pcv-2感染引起免疫抑制，极易导致其它病原混合感染或继发感染，是目前严重危害养猪业的病原之一。在我国，目前几乎100％猪场为猪圆环病毒2型阳性。

pcv2是目前已知的最小的病毒之一，其基因组是一条共价闭合的单链dna，约1.76kb～1.77kb。pcv2有11个开放阅读框(openreadingframes，orfs)，然而仅有三个开放阅读框被认为可以编码蛋白。其中orf2又称为cap基因，位于互补链上，呈逆时针方向，负责编码唯一的结构蛋白cap，其氨基酸长度为233aa～234aa。cap蛋白也是pcv2的主要抗原，能诱导中和抗体的产生。

目前，国内外都有商品化的猪圆环病毒2型疫苗，主要分为3种。第1种是亚单位疫苗，主要表达pcv-2的orf2蛋白(也称cap蛋白)作为免疫原，再加上合适的疫苗佐剂配制疫苗；其代表性的产品包括勃林格殷格翰的circoflex疫苗。第2种是嵌合病毒灭活疫苗，即用pcv-2的orf2基因置换pcv-1的orf2基因，然后用构建的嵌合病毒制备灭活疫苗；其代表性的产品为富道公司的suvaxyn疫苗。第3种是全病毒灭活疫苗，梅里亚公司出品的circovace疫苗和国产圆环疫苗均属于此类。其中第一种亚单位疫苗由于不含有病毒基因组，因此被认为比其他2种疫苗要安全，且易于质控；所以第一种疫苗是目前国内重点开发的疫苗，如青岛易邦、武汉中博、金宇保灵等公司已经有相关的亚单位疫苗上市。

目前已上市的亚单位疫苗中，表达cap蛋白的方式主要是昆虫杆状病毒表达和大肠杆菌表达两种方式。大肠杆菌是原核表达系统中最常用的，虽然表达量高、成本低，但是该表达系统缺乏翻译后加工与修饰的过程，导致表达出来的蛋白与病毒天然抗原蛋白结构差异较大，因此免疫原性相对病毒天然抗原蛋白要弱；而且表达出来的蛋白需要经过繁琐的纯化、去内毒素后才能作为半成品使用，导致半成品制备成本显著增加。昆虫杆状病毒表达系统相对原核表达系统而言，蛋白表达后可以在一定程度上进行翻译后加工与修饰，但与病毒天然抗原蛋白结构仍有一定差异，蛋白表达后折叠与修饰不如哺乳动物细胞表达系统；而且该系统生产制备抗原时，细胞经病毒感染后细胞会裂解与死亡，对下游纯化等生产工艺增加难度；另外，该系统表达产量不高，一般表达产量很难达到500mg/l。

cho细胞是1957年美国科罗拉多大学theodoret.puck博士从一成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，cho细胞有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000l以上，可以大规模生产。

cho细胞类型较多，如：dg44、dxb11、cho-k1和cho-s等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是dhfr(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，宿主细胞株为dg44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，mtx)时，二氢叶酸还原酶被抑制，再通过反馈调节，使得该基因进行扩增，且其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围内即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是dg44的dhfr体系。gs(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，其以cho-k1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，它比dhfr系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可和使用。其原理是gs在atp水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏谷氨酰胺的培养基中加入gs抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(l-methioninesulfoximine，msx)，可使gs基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要：(1)不需要基因缺陷型的cho-k1细胞株作为宿主细胞；(2)cho-k1细胞更强壮，易于培养；(3)在培养基中无需加入谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，且有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题：一是提供一种可大规模工业化生产猪圆环病毒2型cap蛋白的方法；二是克服现有技术制备猪圆环病毒2型cap蛋白时翻译后加工与修饰不足的问题；三是克服现有技术在工业化生产中纯化工艺较复杂的问题。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种cho细胞株，所述cho细胞株含有能高效分泌表达猪圆环病毒2型cap蛋白的基因。

本发明的技术方案中，优选地，所述cho细胞株为dg44、dxb11、cho-k1、或cho-s细胞株。

本发明的技术方案中，优选地，所述基因是将猪圆环病毒2型cap蛋白编码基因经过密码子优化后的核苷酸序列。

本发明的技术方案中，优选地，所述将猪圆环病毒2型cap蛋白编码基因经过密码子优化后的核苷酸序列如seqidno.1所示。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种cho细胞株的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将seqidno.1所示的基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有猪圆环病毒2型cap蛋白编码基因的重组质粒；2)再将所述重组质粒转染至cho细胞中，得到cho细胞株；3)通过培养、筛选、驯化步骤2)中所述cho细胞株，得到高效分泌表达猪圆环病毒2型cap蛋白的细胞株。

本发明的技术方案中，优选地，所述真核表达载体为pee6.4、pee12.4、pgl4.13、pcdna3.1优选地，所述真核表达载体为pee12.4。

本发明的技术方案中，所述cho细胞可以为dg44、dxb11、cho-k1、cho-s细胞株，优选地，所述cho细胞为cho-k1细胞。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种使用cho细胞株制备猪圆环病毒2型cap蛋白的方法，所述制备方法是1)将培养基cd-cho和培养基ex-cell302混合，以得到混合培养基，其中，培养基cd-cho和培养基ex-cell302的体积比为6:4；以及2)将如权利要求1～4任一权利要求所述的cho细胞株在所述混合培养基进行发酵培养，再通过纯化得到重组猪圆环病毒2型cap蛋白。。

根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种使用所述的cho细胞株在大规模制备猪圆环病毒2型cap蛋白中的应用。

根据本发明的第五方面，本发明还提供了一种猪圆环病毒2型cap蛋白在制备猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。

本发明构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达猪圆环病毒2型cap蛋白的cho细胞株，该细胞株表达cap蛋白产量高(产量高达1-1.5g/l)、易于纯化(本细胞株表达cap蛋白是分泌表达，细胞上清中杂蛋白少，只需要过一个镊柱就能使目的蛋白纯度达到80％或以上，且不含有内毒素，不需要去除内毒素的步骤)、易于大规模生产(工业生产时发酵规模可以达到1000l)。因此，本发明不仅提供了一种大规模工业化生产猪圆环病毒2型cap蛋白的方法，还大大降低了目前生产猪圆环病毒2型cap蛋白的成本。另外，由于生产猪圆环病毒2型亚单位疫苗中核心成分cap蛋白时使用的是细胞株，该细胞株是属于真核细胞表达，相比于杆状病毒表达，更接近于病毒本身在猪体内的增值，因此使用本细胞株表达出来的cap蛋白有合适的翻译后加工和修饰，与病毒本身的cap蛋白更接近，所以免疫原性相对要好；而且细胞株在培养时可控制性高、质控容易、定量简单，因此使用该方法制备的猪圆环病毒2型cap蛋白还具有以下优点：可大规模工业化生产、供量充足、质控容易；批次间稳定；生产中生物安全控制容易(发酵培养时使用的是无血清培养基，不存在病毒污染，也不存在散毒的风险)。

附图说明

图1表示pee12.4-opti-cap质粒图。

图2表示pee12.4-opti-cap双酶切鉴定结果：1-5是pee12.4-opti-cap质粒ecori&hindⅲ双酶切得到目的条带，大小约为660bp，双酶切结果正确。m：marker，dl10,000。

图3表示表达pcv2-cap蛋白的cho-k1单克隆细胞株发酵上清培养基蛋白检测(wersternblot检测)：1为10μl2b4株发酵上清，2为10μl3c3株发酵上清，3为10μl2g7株发酵上清，4为10μl6b11株发酵上清，m为marker

图4表示蛋白纯化结果：其中m表示蛋白marker，pcv2-cap表示纯化后的猪圆环病毒2型cap蛋白，上样量为10μl。

图5表示免疫后猪只抗体效价检测结果。

图6表示密码子优化前后序列比对结果。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

cho-k1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

细胞培养基和血清均购自美国gibco公司；

真核表达载体pee12.4购自上海林渊生物科技有限公司；

lipofectamineltx购自美国thermofisher公司；

甲硫氨酸亚砜亚铵((l-methioninesulfoximine，msx))购于sigma公司；

bca蛋白质定量试剂盒购自美国thermofisher公司；

isa201vg购自法国赛比克公司；

实施例1：猪圆环病毒2型cap蛋白密码子优化及pee12.4-opti-cap重组质粒构建

通过对猪圆环病毒2型cap蛋白核苷酸序列进行密码子优化，得到opti-cap序列，如seqidno.1所示，该工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

将优化后的序列与优化前的序列(如seqidno.2所示)进行比对，发现有118个核苷酸不同，约19.6％的核苷酸不同。具体见图6所示。

实施例2：pee12.4-opti-cap重组质粒构建

2.1pcr扩增目的片段opti-cap

2.1.1pcr反应

(1)引物设计及合成

上游引物:5’-cggaagcttatgggcaagaacggcatcttcaatac-3’

下游引物:5’-ggcgaattctcaatggtgatggtgatggtgc-3’

(2)加样体系50μl，如下表所示：

pcr扩增程序：

2.1.2pcr产物进行胶回收

(1)标记好样品收集ep管、吸附柱以及收集管；

(2)称取标记好的空的ep管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的dna条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5ml离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5ml离心管中加入600μlpcbuffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱cb2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μl平衡液bl，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱cb2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱cb2放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入600μl漂洗液pwbuffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱cb2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlelutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱cb2，盖上离心管盖子，保留离心管中的dna样品；

(12)将步骤11中的dna样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收dna片段。

2.2pcr产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的1.5mlep管，在1.5mlep管中按照下表进行加样、混匀：50μl反应体系

(2)将步骤(1)中的1.5mlep管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的dna片段，方法同1.2.1中pcr产物胶回收。

2.3连接反应

(1)准备洁净的1.5mlep管若干，做好标记，置于ep管架上待用。

(2)在1.5mlep管按照下表进行加样、混匀。

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；

(4)取出步骤(3)中ep管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；

(5)取出步骤(4)中的ep管，置于4℃保存。

1.2.4转化反应

(1)将10μl连接反应液快速加入100μl感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μl液体lb培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μl上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；

(6)观察转化结果。

2.5质粒抽提与双酶切鉴定

2.5.1质粒抽提

(1)用10μl移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的lb液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mlep管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的ep管中加入250μl质粒提取试剂p1buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μlp2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μlp3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μlbufferdw1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μlwashsolution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μlelutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中dna溶液。

2.5.2双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的1.5mlep管，按照下表进行加样：20μl反应体系

(2)将步骤(1)中的ep管20μl反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图2：酶切鉴定构建正确。

(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。

2.6无内毒素质粒大提

2.6.1无内毒素质粒提取

(1)测序正确的克隆接种至100ml含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；

(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50ml离心管中，室温8,000rpm/min、离心5min，收集菌体，弃掉上清培养基；

(3)向步骤(2)的离心管中加入8ml溶液p1，用移液器充分重悬菌体；

(4)向步骤(3)的离心管中加入8ml溶液p2，立即温和颠倒离心管6-8次，室温静置5min；

(5)向步骤(4)的离心管中加入8ml溶液p4，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右。8,000rpm/min室温离心5-10min，使白色沉淀离至管底；

(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器cs1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50ml离心管中；

(7)柱平衡：向吸附柱cp6中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液bl，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱cp6中。室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱cp6重新放入同一个收集管中；

(9)向步骤(8)吸附柱cp6中加入10ml漂洗液pw，室温8,000rpm/min离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(10)重复操作步骤(9)一次；

(11)向步骤(10)吸附柱cp6中加入3ml无水乙醇，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉废液；

(12)将步骤(11)吸附柱cp6重新放回收集管中，室温8,000rpm/min离心5min。将吸附柱cp6开盖，置于室温放置数分钟晾干；

(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50ml离心管中，在吸附膜中央加入1-2ml缓冲液tb，室温静置5min，室温8,000rpm/min离心2min，将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，测浓度，-20℃保存。

(14)取1-2μl所得到的质粒dna溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据。

实施例3：pee12.4-opti-cap重组质粒转染cho-k1细胞与单克隆筛选的建立

3.1cho-k1细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；dmem/f12(含10％血清，1％双抗)、dmem/f12与pbs置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mlpbs洗细胞一次，并弃去pbs。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2ml0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mldmem/f12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用dmem/f12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至3×10⁵个/ml，取2ml混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％co2细胞培养箱中孵育过夜。

(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的dmem/f12，2ml/孔。

(9)稀释质粒：用opti-mem稀释质粒，125μlopti-mem中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μlplus，混匀，室温静置5min。

(10)稀释lipofectamineltx：125μlopti-mem中加入9μllipofectamineltx，然后加入2.5μlplus，轻轻混匀，室温静置5min。

(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。

(12)将六孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养4-6h。

(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mldmem/f12(含10％血清、1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。

3.2加压筛选

转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mldmem/f12(含10％血清、1％双抗+25μmmsx)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。

3.3单克隆筛选

(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。

(2)取出六孔板，弃掉培养基，pbs洗一次，然后加入300μl0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，加入2mldmem/f12(含10％血清、1％双抗+25μmmsx)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(3)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。

(4)用dmem/f12(含10％血清、1％双抗+25μmmsx)重新悬浮细胞，计数。

(5)铺板：稀释细胞至5个/ml，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％co2细胞培养箱中孵育4-6h。

(6)记录单个细胞的孔。

(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，pbs洗一次，加入100μl0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，加入2mldmem/f12(含10％血清、1％双抗+25μmmsx)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。

实施例4：cho-k1细胞株驯化成悬浮培养

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；dmem/f12(含10％血清、1％双抗，25μmmsx)置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mlpbs洗细胞一次，并弃去pbs。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2ml0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mldmem/f12(含10％血清、1％双抗，25μmmsx)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用100％dmem/f12(含10％血清、1％双抗，25μmmsx)悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至5×10⁵个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％co2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(9)每隔24h计数细胞密度及活力。

(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。

(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％dmem/f12(含10％血清、1％双抗，25μmmsx)，ex-cell302置于co2细胞培养箱中预热至37℃。

(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50ml离心管中，常温200g离心5min。

(13)将dmem/f12(含10％血清、1％双抗，25μmmsx)和ex-cell302按1：1混合，重新悬浮细胞，计数。

(14)稀释细胞至5×10⁵个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％co2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(16)每隔24h计数细胞密度及活力。

(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×10⁶个细胞/ml，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×10⁵个/ml。

(18)经驯化，2b4，3c3，2g7，6b11单克隆细胞株均满足要求，表明驯化成功。

实施例5：细胞摇瓶发酵

(1)60％的cd-cho+40％的ex-cell302混合的培养基(其中cd-cho和ex-cell302均为无血清培养基)对上4种细胞株进行摇瓶发酵验证。单克隆细胞株编号为2b4，3c3，2g7，6b11。

(2)从co2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

(3)稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/ml接种60ml培养基于一个250ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％co2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/l的时候，添加葡萄糖到4g/l；每天取1ml样品，上清用于检测蛋白表达情况。

(5)补料(约第四天)：补充79.6g/lcdefficientfeedcagt，添加基础培养基的10％。

(6)第5天开始，将co2培养箱温度调整至32℃。

(7)第九天，补充79.6g/lcdefficientfeedcagt，添加基础培养基的10％。

(8)第十二天，收获细胞上清。

(9)wersternblot检测单克隆细胞株pcv2-cap蛋白的表达水平。如图3所示，1为10μl2b4株发酵上清，2为10μl3c3株发酵上清，3为10μl2g7株发酵上清，4为10μl6b11株发酵上清，m为marker。其中3c3株和6b11株的猪圆环病毒2型cap蛋白产量最高，初步估算，其表达产量高达1-1.5g/l，适合大规模生产所需。注：由于wersternblot使用的是猪圆环病毒2型cap蛋白的单克隆抗体，因此图中出现的两条带均为表达的猪圆环病毒2型cap蛋白，它们的差别在于本身的糖基化程度不同。

实施例6：蛋白纯化

(1)取geexcle填料4ml，用buffera(20mmnah2po4，500mmnacl，0.05％tween20，ph7.4)平衡5个柱体积；

(2)将4ml填料加入到细胞上清中，于滚瓶机上4℃混匀1h；

(3)将填料和细胞上清转移到空层析柱中，流穿细胞上清；

(4)洗涤：用含20mm咪唑的buffera洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(5)洗脱：用含250mm咪唑的buffera洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(6)洗涤：用含500mm咪唑的buffera洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(7)透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×pbs透析至少1,000倍，取80μl留样检测。

(8)图4所示sds-page检测3c3株发酵上清纯化结果，其中m表示蛋白marker，pcv2-cap表示纯化后的猪圆环病毒2型cap蛋白，上样量为10μl。

(9)蛋白浓度和纯度测定：采用bca法测定蛋白浓度，2b4、6b11单克隆细胞株蛋白得率约为0.8-1.2g/l；采用hplc方法检测纯度，纯度都能达到80％以上。

实施例7：疫苗制备与免疫实验

7.1疫苗制备

将50μgcho-k1细胞表达的猪圆环病毒2型cap蛋白加入到isa201vg佐剂中(抗原相和佐剂重量比为1:1)，乳化、质检合格后置于4℃保存。

7.2免疫实验

筛选2-4周龄长白猪(猪圆环抗体抗原均阴性、蓝耳抗原阴性，每组5头)进行试验，一组作为对照组，一组免疫1ml7.1制备的疫苗，一组免疫市场上某公司生产的亚单位疫苗，初免三周后加强免疫一次，免疫前、二免前、二免后14天分别采集血清，并用韩国金诺试剂盒测定抗体效价。结果如图5所示，实验组在二免前、二免后14天s/p值均高于市场苗免疫组，这说明使用cho细胞表达的pcv2-cap蛋白制备的疫苗比目前市售产品免疫原性较好。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110>浙江海隆生物科技有限公司

<120>cho细胞株及其制备方法和使用该cho细胞株制备猪圆环病毒2型cap蛋白及其应用

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>612

<212>dna

<213>密码子优化后的pcv2cap基因序列

<400>1

atgggcaagaacggcatcttcaataccagactgtcccgcacatttggctataccatcaag60

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<213>密码子优化前的pcv2cap基因序列

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<213>pcv2cap蛋白序列

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190195200