一种悬浮驯化293T细胞的方法与流程

本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种悬浮培养细胞的方法。

背景技术：

体外细胞的培养方法包括贴壁培养和悬浮培养，贴壁培养(是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养；悬浮培养通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法；其中悬浮培养又可分为微载体悬浮培养及全悬浮培养。与贴壁培养相比，悬浮培养具有如下优点：(1)可连续扩大生产量；(2)有利于细胞培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件(温度、ph、氧分压和co2等)；(3)培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究；(4)易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会；(5)可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期；(6)悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物学特性。

293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有ad5e1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种e1区缺陷互补细胞系。它是加拿大mcmasteruniversity的f.l.graham与j.s.miley于1976年用dna转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293细胞属于贴壁细胞系，在无ca2+或含ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中，现有技术中，实验证实细胞传代次数过多对293细胞单层培养方式下细胞的生长产生了明显的影响。293t细胞由293细胞派生，同时表达sv40大t抗原，含有sv40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用ca3(po4)2转染效率可高达50％。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293t细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式。

现阶段工业化单层培养293t细胞时，培养基中均加一定比例的牛血清(包括胎牛血清或新生牛血清)细胞才能正常生长，牛血清不仅价格贵，而且牛血清来源于自然生物体，牛源本身携带和采集加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，使用会存在生物安全风险。另外，牛血清是一种天然混合物，其具体成份目前还没有完全分析清楚，生物制品生产中使用后对下游纯化工艺造成困难，如果有残留通常会引起接种者的副反应而影响产品质量。生物制品生产中细胞培养如能采用无血清全悬浮工艺，培养规模就容易线性放大，避免了细胞贴壁培养和使用牛血清带来的工艺缺陷，可提高病毒产量和产品质量，但是驯化无血清全悬浮培养型细胞株是目前最关键的技术瓶颈之一。

技术实现要素：

针对以上原因，本发明提供了一种贴壁细胞进行悬浮培养的方法，本方法通过逐级降低胎牛血清的浓度，充分利用了悬浮培养的优点，使得贴壁细胞可以进行简化、高效、大量的培养。

本发明提供了一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞的方法，该方法包括：(1)复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的哺乳动物细胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的哺乳动物细胞，连续培养该哺乳动物细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及(3)重复步骤(2)中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量，直至最后血清含量为0，最后把悬浮细胞放到摇床上摇动培养。

优选地，所述步骤(1)中的哺乳动物为293t细胞。

优选地，所述步骤(2)和(3)中的所述无血清培养基包括freestyle。

优选地，所述步骤(2)中所述血清添加量为10％；所述步骤(3)中所述逐渐降低的血清添加量分别为5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0。

优选地，所述步骤(2)和(3)中的连续培养所述哺乳动物细胞至适应所述添加了一定量血清的无血清培养基的程序为连续培养3代。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明操作简单，方便使用，费用低，安全性好。

2)293t细胞悬浮培养的体外扩增培养方法无需特殊设备，操作简单可行。

3)293t细胞悬浮培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景。

4)本发明的悬浮培养基，支持293t细胞长期传代培养，无需长期而复杂的适应过程。

5)本发明的悬浮培养基不含血清，组份明确，有利于产物的分离纯化，提高产品品质。

附图说明

图1为本发明显微镜下观察293t细胞贴壁培养和悬浮培养图片，放大倍数100倍。

具体实施方式

具体实施例

1.所用的试剂

1)细胞株：293t细胞，从atcc细胞库购买；

2)dmem培养液，corning，货号：10-013-cvr；

3)freestyle培养液，gibco，货号：12338-018；

4)胰蛋白酶，gibco，货号：27250，配制成0.25％胰蛋白酶溶液(edta-na0.3g/l)；

5)anticlumpingagent,invitrogen,货号：0010057ae。

2.所用仪器设备和器皿

1)摇床，kuhner，型号：isf1-xc；

2)co2培养箱，thermofisherscientificcorporation，型号：3111；

3)离心机，eppendorf，型号：5810r；

4)相差倒置显微镜，olympus，olympusckx41；

5)细胞培养瓶(corning，t25货号：430639，t75货号：430641)；

6)锥形细胞瓶150ml，江苏海门，规格：150ml。

实施例1.贴壁培养型293t细胞系的培养

从公司细胞库中选取经检定无菌、支原体、外源病毒均为阴性的贴壁培养型293t细胞一支复苏培养，培养液为10％胎牛血清(以下血清浓度均为体积百分含量)的dmem，培养条件：37℃5％co2的培养箱培养。细胞复苏后活力为98.6％，细胞培养48h形成了致密单层，按1∶4比例分瓶传代培养在48h也成致密单层，细胞边缘清晰，形态扁平，呈上皮型。

实施例2.低血清贴壁培养型293t细胞系的驯化

a)将步骤(1)所述生长正常的贴壁培养型293t细胞分别用含胎牛血清10％的dmem培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在37℃5％co2培养，在48-72h内细胞形成致密单层；

b)将培养液换成freestyle培养基后加10％胎牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；

c)培养液中胎牛血清降为5％，按b步骤中的方法，传代比例降为1：3再培养三代；

d)培养液中胎牛牛血清降为2％，在培养液中再加体积百分含量20％上一代次培养了该细胞48-72h的培养液继续培养三代；

传代标准同步骤c)；细胞在48h-72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型293t细胞系；

实施例3.低血清全悬浮培养型293t细胞系的驯化

a)将步骤(2)驯化的低血清贴壁培养型293t细胞，用freestyle无血清培养基按体积比1：1比例混合后，加2％胎牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至2-5×10⁵/ml，125r/min、37℃5％co2摇床培养；

b)重复步骤a)，每培养三代降低血清浓度，胎牛血清浓度依次从2％到1％到0.5％；

c)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×10⁶/ml时，800-1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×10⁶/ml时，800-1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×10⁶/ml时，800-1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h细胞密度均达2×10⁶/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型293t细胞系。

实施例4.无血清全悬浮培养型293t细胞系的驯化

a)在无血清培养基中加0.2％胎牛血清，将步骤(3)中得到的低血清全悬浮培养型293t细胞直接稀释到密度5×10⁵/ml，置125r/min、37℃5％co2摇床培养；

b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×10⁶/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×10⁵/ml接种培养，血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×10⁶/ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型293t细胞系。

表1.293t细胞悬浮驯化操作过程中培养基配方表