一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法与流程

本发明属于生物医学的技术领域，尤其是一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的成体干细胞，可刺激组织生长和修复，增强组织的再生能力，影响免疫调节，在细胞治疗领域有着极为广阔的应用前景。mscs可从骨髓、脐带血、脂肪、滑膜、胎盘、结缔组织等部位获得。目前，脐带以及脐带血以其非侵入式的获得方式，对捐献者不会造成任何伤害而成为一种理想的间充质干细胞来源。而与脐带血相比，脐带来源的间充质干细胞更易于获得和培养。

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，因具有采集方便、增殖分化能力强、免疫原性弱、无伦理问题等诸多优点，在组织工程、基因工程等领域日益受到关注。

对于间充质干细胞冻干粉提取制备，大多使用市场上各种冷冻干燥机对样品进行物理升华处理的方法。在冷冻干燥的过程中，容器内会被抽至真空，这就导致容器内盛放的样品由于抽气而从容器内大量溢出，导致样品减少，并且由于抽气导致冷冻干燥过程中产生大量气泡沾满容器内壁，影响了样品的质量、产量以及外观。尤其对于脐带间充质干细胞这种小量产的冻干粉制备来说，研究一种有效提高冻干粉的质量，减少冻干粉的损耗的方法具有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，采用针对小量或者比较贵重生物活性样品的冻干技术，方法简单有效，能减少样品损耗，提高样品质量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，其不同之处在于，包括以下步骤：

步骤a).脐带间充质干细胞的分离培养：取新鲜脐带，分离血管周围的沃顿胶后剪碎，消化液消化，用生理盐水稀释后离心，弃上清，加培养基混悬后转入培养皿，加入添加剂、双抗和两性霉素b，放入培养箱中培养；

步骤b).脐带间充质干细胞传代：待步骤a)培养的细胞长满后，进行传代；取步骤a)培养皿中部分培养基至离心管，向离心管中加入生理盐水和胰酶，混匀消化，待消化好后加入培养基终止消化，用移液管吹打培养皿底数次把细胞洗下来，然后收集到离心管离心，弃上清，加入含添加剂的培养基混悬，按所需细胞密度稀释后转入培养皿，放入培养箱中培养；

步骤c).脐带间充质干细胞冻干粉的制备：将步骤b)传代培养所得的细胞培养上清液抽至离心管中后冻存至固态状，使培养基完全冰冻结实；再将固态状的冰冻培养基放置于使用封口膜或保鲜膜紧封的冻存瓶中，再用注射器针头在封口膜或保鲜膜上扎孔，然后放置于冷冻干燥机上冷冻干燥至固体状，即制得脐带间充质干细胞冻干粉。

在上述技术方案中，所述步骤a)中的消化液消化，是先将剪碎的脐带放入ⅰ型胶原酶中，加入双抗和两性霉素b混合均匀后置于37℃培养箱中过夜，取出后加入胰酶，再次置于37℃培养箱中消化。

在上述技术方案中，所述步骤a)中的生理盐水的稀释倍数为4~6倍，离心条件为3000rpm离心15~20min。

在上述技术方案中，所述步骤b)按1：（3~5）进行传代。

在上述技术方案中，所述步骤b)中胰酶的终浓度为0.05%，离心条件为1800rpm离心5min。

在上述技术方案中，所述步骤c)中冻存条件为放置于低温冰箱或液氮罐中冻存。

在上述技术方案中，所述步骤c)中冷冻干燥机上冷冻干燥时间为12~24h。

在上述技术方案中，所述步骤c)中细胞培养上清液抽至离心管前进行脐带间充质干细胞的鉴定。

在上述技术方案中，所述脐带间充质干细胞的鉴定是用0.1%胰蛋白酶/柠檬酸消化液将步骤c)中细胞培养上清液中的细胞消化下来，用pbs缓冲液混悬，然后加入cd31-fitc、cd73-pe、drpercp及cd29-apc，避光孵育；再用pbs缓冲液清洗后，1800rpm离心5min，沉淀用pbs重悬后，用上流式细胞仪检测鉴定细胞表面抗原。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1）本发明在冷冻干燥机盛装样品的容器开口处覆盖封口膜或者保鲜膜，能够防止冷冻干燥过程中冻干粉样品飞溅到容器外，最大限度的减少样品的损耗，保证了样品的产量，对于小量样品或者比较贵重样品显得尤为重要；

2）本发明采用一次性封口膜或者保鲜膜覆盖容器，既提高了实验操作的便利性，也降低了实验成本；

3）本发明采用注射器针头在覆盖容器的封口膜或者保鲜膜上面扎孔，能够使冷冻干燥过程中抽气产生的气泡顺利排出，防止气泡沾满容器内壁，保证了样品的质量与外观。

附图说明

图1为本发明实施例1所得产物样品，图2为对比例1所得产物样品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用于限定本发明的范围。

本发明一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

步骤a).脐带间充质干细胞的分离培养：取新鲜脐带，分离血管周围的沃顿胶后剪碎；放入ⅰ型胶原酶中，加入双抗和两性霉素b，混合均匀后置于37℃的培养箱中过夜；取出后加入胰酶，加入胰酶的量根据胶原酶消化情况而定，再次置于37℃的培养箱中消化；用生理盐水稀释4~6倍后3000rpm离心15~20min，弃上清，加培养基混悬后转入培养皿中，加入添加剂、双抗和两性霉素b，放入培养箱中培养，根据培养状态适时适量换液；

步骤b).脐带间充质干细胞传代：待步骤a)培养的细胞长满后，按1：（3~5）进行传代。吸取步骤a)培养皿中部分培养基至离心管，培养皿中剩余的培养基转至废液缸。向离心管中加入生理盐水和胰酶，其中胰酶优选终浓度为0.05%，混匀消化适量时间，看到细胞飘起来或于镜下观察确认细胞消化好后加入培养基终止消化；用移液管吹打培养皿底数次把细胞洗下来，然后收集到离心管中，1800rpm离心5min，弃上清，加入含添加剂的培养基混悬，按所需细胞密度稀释后转入培养皿，放入培养箱中培养；

步骤c).脐带间充质干细胞冻干粉的制备：将步骤b)传代培养所得的细胞培养上清液抽至离心管中放置低温冰箱或者液氮罐中冻存至固态状，使培养基完全冰冻结实；再将固态状的冰冻培养基放置于使用封口膜或保鲜膜紧封的冻存瓶中，再用注射器针头在封口膜或保鲜膜上扎若干个孔，然后放置于冷冻干燥机上冷冻干燥至固体状，优选冷冻干燥时间为12~24h，因为冻干过程中时间不到位易造成样品融化产气及溶解产气损耗，导致减产，冻干时间过长成本极高。冻干后得到脐带间充质干细胞冻干粉。

优选地，所述步骤c)中细胞培养上清液抽至离心管前需进行脐带间充质干细胞的鉴定，经鉴定证明培养的细胞为脐带间充质干细胞后，再进行所述步骤c)冻干粉的制备。

脐带间充质干细胞的鉴定采用如下方法：用0.1%胰蛋白酶/柠檬酸消化液将步骤c)中细胞培养上清液中的生长状态良好的细胞消化下来，用50μlpbs缓冲液混悬，然后加入10μlcd31-fitc、10μlcd73-pe、10μldrpercp及5μlcd29-apc，避光孵育15min；再用pbs缓冲液清洗后，1000rpm离心5min，沉淀用500μlpbs重悬后，用上流式细胞仪检测鉴定细胞表面抗原。

实施例1

制备一种脐带间充质干细胞冻干粉，其方法如下：

步骤a).脐带间充质干细胞的分离培养：用无菌瓶取回新鲜脐带，分离血管周围的沃顿胶后剪碎；放入2mg/mlⅰ型胶原酶15ml中，加入200μl双抗和200μl两性霉素b，混合均匀后置于37℃的培养箱中过夜；取出后加入胰酶10ml，再次置于37℃的培养箱中消化30min；用生理盐水稀释5倍后3000rpm离心20min，弃上清，加培养基混悬后转入3个培养皿中，每皿加入1ml添加剂、200μl双抗和200μl两性霉素b，放入培养箱中培养，根据培养状态适时适量换液；

步骤b).脐带间充质干细胞传代：待步骤a)培养的细胞长满后，按1：3进行传代。每皿吸取步骤a)培养皿中3ml培养基至50ml离心管，剩余的转至废液缸。向离心管中加入生理盐水和胰酶，胰酶终浓度为0.05%，混匀消化1min，看到细胞飘起来或于镜下观察确认细胞消化好后每皿加入3ml培养基终止消化；用移液管吹打培养皿皿底6次把细胞洗下来，然后收集到50ml离心管中，1800rpm离心5min，弃上清，每皿加入18ml含添加剂的培养基混悬，按所需细胞密度稀释后转入培养皿，放入培养箱中培养；

步骤c).脐带间充质干细胞冻干粉的制备：先取步骤b)3代培养所得的细胞培养上清液进行脐带间充质干细胞的鉴定，鉴定结果证明培养的细胞为人间充质干细胞后，将细胞培养上清液抽至离心管中放置低温冰箱或者液氮罐中冻存至固态状，使培养基完全冰冻结实；再将固态状的冰冻培养基放置于使用封口膜或保鲜膜紧封的冻存瓶中，再用注射器针头在封口膜或保鲜膜上扎若干个孔，然后放置于冷冻干燥机上冷冻干燥24h至固体状，冻干后得到脐带间充质干细胞冻干粉。

对比例1

对比例1采用的是常规冷冻干燥方法制备脐带间充质干细胞。除步骤c)中冷冻干燥过程中冻存瓶不使用封口膜或保鲜膜紧封瓶口，不使用注射器针头在封口膜或保鲜膜上扎若干个孔外，其它制备步骤均与实施例1相同。

由图1可见，本发明实施例1制备方法得到的脐带间充质干细胞冻干粉外观为白色粉末状，冻干瓶内壁无气泡。由图2可见，对比例1制备的脐带间充质干细胞冻干粉与实施例1相比损失了60%，样品几乎所剩无几，且冻干瓶内壁有大量起泡，严重影响了冻干粉的外观及产量。这主要是因为本发明在冷冻干燥机盛装样品的冻干瓶开口处采用封口膜或者保鲜膜紧封瓶口，能够防止冷冻干燥过程中冻干粉样品飞溅到容器外，从而能减少样品的损耗，保证了样品的产量。采用注射器针头在封口膜或者保鲜膜上面扎孔，能够使冷冻干燥过程中抽气产生的气泡顺利排出，防止气泡沾满容器内壁，从而保证了样品的质量与外观。

由此可见，冷冻干燥容器应用了封口膜并在封口膜上用注射器针头扎孔所制备得到的脐带间充质干细胞冻干粉无论从产量、质量还是外观上都有了明显优化。本发明在冷冻干燥机盛装样品的容器开口处覆盖封口膜或者保鲜膜，能够防止冷冻干燥过程中冻干粉样品飞溅到容器外，最大限度的减少样品的损耗，保证了样品尤其是小量样品或者比较贵重样品的产量；用注射器针头在覆盖容器的封口膜或者保鲜膜上面扎孔，能够使冷冻干燥过程中抽气产生的气泡顺利排出，防止气泡沾满容器内壁，保证了样品的质量与外观。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。