一种高效去除猪未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，具体是一种高效去除猪未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法。

背景技术：

随着动物胚胎工程生物技术的不断完善及广泛应用，极大地推动了畜牧业与生物医学等领域的快速发展。利用胚胎工程技术不仅可以改良家畜的品种、生产药用蛋白、制备人类疾病模型，还可以为动物胚胎发育机理的研究提供丰富的试验材料。由于猪在生理、解剖结构、卵母细胞成熟、胚胎发育时间等方面与人类有许多相似之处。因此在生物医学研究领域猪已被胚胎生物学家和遗传学家作为重要的模式动物。

目前，猪卵母细胞体外成熟是推动体外受精、体细胞克隆、胚胎移植等现代动物胚胎生物技术在畜牧业与生物医学中广泛应用的重要基础，而卵丘细胞在卵母细胞体外成熟及胚胎后续发育中发挥着非常重要的作用。研究发现卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用参与调控猪卵母细胞细胞核和细胞质成熟。因此，针对发现卵母细胞和卵丘细胞特异性表达的基因的研究，将卵母细胞及其周围致密的卵丘细胞独立分开是开展以上生物学研究的重要前提。所以，发明一种简单、经济、高效的去除未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法就显得十分重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于：提供一种简单、经济、高效的去除未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法，回收效率高且死亡率低，为今后开展关于猪卵母细胞与卵丘细胞相互作用的研究提供丰富的试验材料。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种高效去除猪未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法，包括以下步骤：

(1)溶液的配制：:配制以氯化钠作为溶质，tcm199作为溶剂配制成含有1wt％nacl的液体；配制步骤(1)的液体前后分别测量液体的渗透压，再将上述所配制的液体进行过滤，分装到1.5ml离心管中，加热至38.5℃备用；

(2)卵丘卵母细胞复合体去除外围卵丘细胞：将卵泡液中的卵丘卵母细胞挑到盛有洗卵液的培养皿中；利用口吸管针将上述挑选出的卵丘卵母细胞移入到提前预热好盛有400μl1wt％nacl液体的1.5ml离心管中，将含有卵丘卵母细胞的离心管置于涡旋振荡器中涡旋振荡5分钟，用离心机将离心管进行瞬时离心，然后将涡旋震荡后带有卵母细胞的液体转移到培养皿中；借助口吸管针将除去卵丘颗粒细胞的卵母细胞转移至tcm199操作液中，且快速清洗3遍，并置于盛有tcm199液滴中恢复5分钟，从而完成去除未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的收集。

步骤(1)中，配制液体之前测量tcm199的渗透压值为300osm，配制之后的液体渗透压值为600osm。

步骤(2)中，洗卵液的制备方法为：用100ml去离子水溶解1gpva，待pva完全溶解，冷却后再取9.55gdpbs粉末，加去离子水，使溶解，定容至1l，高压前盖锡箔纸。高压结束后冷却，以1ml/l的比例加酚红和双抗。在超净台内，使用0.22μm滤器过滤，除菌后分装至50ml离心管中，4℃保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过1wt％nacl处理去除猪未成熟卵母细胞外围卵丘细胞。与其他方法相比更加节省时间，此方法能够在更短的时间内获得足够的实验材料，为深入的探讨卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用的研究提供了基础保障。同时，配制后的液体都会采用0.22μm滤器进行除菌过滤，使所用的液体排除细菌污染的干扰。综合上述的优点，本发明的这种去除卵丘细胞的方法具有省时、成本低、安全高效等优势。

附图说明

图1为不同处理条件下成功去除卵丘颗粒细胞的最优条件。其中，图1a:400μl体系,50coc,涡旋3档,5min；图1b:400μl体系,50coc,涡旋2档,5min；图1c:400μl体系,100coc,涡旋3档,5min

图2为不同方法对卵母细胞成熟率和死亡率的影响。

具体实施方式

以下实施例所使用的材料、试剂及其来源

1.实验材料

本研究使用的材料包括：离心管(1.5ml，axygen)、涡旋振荡器(ika,vortex2)、离心机(eppendorf)、加热台(model100，columnheater)、铅块、0.22μm滤器(millexgp)、10ml注射器(健士)、体式显微镜(nikonsmz1000)、枪头(200μl，axygen)、200μl移液器(eppendorfresearchplus)、培养皿(falcon，351008)、计时器。

2.试剂

本研究使用的试剂包括：tcm199(sigma，m7528)、氯化钠(分析纯)。

本发明以直径为3-6mm猪有腔卵泡中的卵丘卵母细胞复合体为研究对象，发明了一种简单、高效去除猪未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的方法，并且能够显著降低裸露卵母细胞的死亡率，该方法包括以下步骤：

1.1溶液的配制

①首先，配制以氯化钠作为溶质，tcm199作为溶剂配制成含有1wt％nacl的液体；

②在配制步骤(1)的液体前后分别测量液体的渗透压，配制液体之前测量tcm199的渗透压值为300osm，配制之后的液体渗透压值为600osm；

③将上述所配制的液体采用10ml注射器和0.22μm滤器进行过滤。

④将过滤好的液体分装到1.5ml离心管中并置于热台上加热至38.5℃备用。

1.2卵丘卵母细胞复合体去除外围卵丘细胞，卵丘卵母细胞复合体简称cocs

①首先，利用体视显微镜，将卵泡液中的cocs挑到盛有洗卵液的培养皿中；

②利用口吸管针将上述挑选出的cocs移入到提前预热好盛有400μl1wt％nacl液体的1.5ml离心管中。

③涡旋振荡器打开并调节至3档，将含有cocs的离心管置于涡旋振荡器中涡旋振荡5分钟。

④振荡后，用离心机将离心管进行瞬时离心，然后将涡旋震荡后带有卵母细胞的液体用200μl的移液器转移到培养皿中。

⑤借助口吸管针将除去卵丘颗粒细胞的卵母细胞转移至tcm199操作液中，且快速清洗3遍，并置于盛有tcm199液滴中恢复5分钟，从而完成去除未成熟卵母细胞周围卵丘细胞的收集。

其中，洗卵液的制备方法为：用100ml去离子水溶解1gpva，待pva完全溶解，冷却后再取9.55gdpbs粉末，加去离子水，使溶解，定容至1l，勿搅拌，高压前盖锡箔纸。高压结束后冷却，以1ml/l的比例加酚红和双抗。在超净台内，使用0.22μm滤器过滤，除菌后分装至50ml离心管中，4℃保存，用前38.5℃预热。

其中，在去除卵母细胞外围卵丘细胞的步骤中，对于1.5ml离心管中移入多少体积的液体、离心管中放置多少枚cocs以及涡旋振荡器的档位都进行了前期研究，其主要方法为：在实验室中，以直径为3-6mm猪有腔卵泡中的卵丘卵母细胞复合体为实验材料，首先，确定多少体积的液体移入1.5ml离心管较为合适，分别选取了离心管中存放800μl和400μl两种体积的液体，将离心管中分别放置100枚cocs，涡旋振荡器的档位调节至3档，振荡5分钟。经过反复多次的试验，得到如下结果：存有800μl液体的离心管中cocs成功去除卵丘颗粒细胞的成功率为3％，而存有400液体的离心管中cocs成功去除卵丘颗粒细胞的成功率为87.5％；

然后在离心管中放置cocs数目选择放面，在离心管中都存放400μl剂量的液体，两个离心管中分别放置50和100枚cocs，涡旋振荡器的档位调节至3档，振荡5分钟。经过反复多次的试验，得到如下结果：放置50枚cocs的离心管中cocs成功去除卵丘颗粒细胞的成功率为79.5％(图1,a)，而放置100枚cocs的离心管中cocs成功去除卵丘颗粒细胞的成功率为87.5％；

最后也对涡旋振荡器的档位方面进行了试验，在离心管中都存放400μl体积的液体，两个离心管都放置50枚cocs，涡旋振荡器分别调节至2档和3档，振荡5分钟后来检测振荡档位的变化是否能对去除卵丘的颗粒细胞有好的效果。经过反复多次的试验，得到如下结果：涡旋振荡器调节至2档时，离心管中cocs成功去除卵丘颗粒细胞的成功率为75％，如图1，b所示，而涡旋振荡器调节至3档时，离心管中cocs成功去除卵丘颗粒细胞的成功率为79.5％。结合以上的方案，最终选择将离心管中存放400μl的液体，放置100枚cocs，涡旋振荡器调节至3档并振荡5分钟为最佳方案，如图1,c所示。

本发明是通过1wt％nacl处理去除猪未成熟卵母细胞外围卵丘细胞。与其他方法相比更加节省时间，此方法能够在更短的时间内获得足够的实验材料，为深入的探讨卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用的研究提供了基础保障。同时，配制后的液体都会采用0.22μm滤器进行除菌过滤，使所用的液体排除细菌污染的干扰。综合上述的优点，本发明的这种去除卵丘细胞的方法具有省时、成本低、安全高效等优势。

对比试验

一种口吸管去除猪未成熟卵母细胞外围卵丘细胞的方法，即将玻璃口吸管针制作与卵母细胞直径相同的口径，机械性地脱去cocs外围卵丘细胞，使用该方法获得的卵母细胞死亡率高，且去除卵丘细胞效率很低。

随后将这两种去除未成熟卵母细胞外围卵丘细胞的方法与卵丘细胞包裹完整的卵母细胞进行体外成熟培养，以此分析用1wt％nacl去除卵丘细胞方法是否影响卵母细胞的细胞核成熟。

为此，将用两个种方法所得到的裸露卵母细胞分别进行体外成熟，以卵丘细胞包裹完整的卵母细胞为对照组，培养42小时后，将排出第一极体的卵母细胞挑选出来，分别统计了细胞核成熟率和死亡率。

结果分析：

图2为不同方法对卵母细胞成熟率和死亡率的影响。其中，

图2a-2c:对照组，即卵丘细胞包裹完整的卵母细胞，a为成熟后排出第一极体的卵母细胞；b为成熟后未排出第一极体的卵母细胞；c为成熟后死亡的卵母细胞；

图2d-2f:实验组，即1wt％nacl去除cocs外围颗粒细胞，d为成熟后排出第一极体的卵母细胞；e为成熟后未排出第一极体的卵母细胞；f为成熟后死亡的卵母细胞；

图2g-2i:实验组，即口吸管去除cocs外围颗粒细胞，g为成熟后排出第一极体的卵母细胞；h为成熟后未排出第一极体的卵母细胞；i为成熟后死亡的卵母细胞。

从图2可以看出，用1wt％nacl处理过后的卵母细胞(图2d-2f)与对照组(图2a-2c)的卵母细胞核成熟率和死亡率非常相似。而用口吸管针机械性地将cocs外围卵丘颗粒细胞的方法(图2g-2i)与对照组相比，排出第一极体的效率显著降低；在死亡率方面与对照组相比，死亡率是显著升高的。因此，用1wt％nacl处理过后的卵母细胞对卵母细胞的成熟率并无影响。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。