本发明涉及细胞模型构建
技术领域：
，尤其是涉及胰岛素抵抗细胞模型的建立方法。
背景技术：
：氢化可的松是人工合成也是天然存在的糖皮质激素，具有抗炎、免疫抑制、抗毒、抗休克及一定的盐皮质激素活性作用等，并有留水、留钠及排钾作用，血浆半衰期为8-12小时。胰岛素抵抗(insulinresistance，ir)是指机体靶组织对胰岛素的反应性低于正常的一种病理生理状态，是包括2型糖尿病、高血压病、肥胖、动脉粥样硬化等常见临床疾病在内的共同危险因素。建立胰岛素抵抗的细胞模型，可广泛用于从细胞水平上探讨胰岛素抵抗形成的机制、葡萄糖代谢障碍的病理生理学环节；而且便于观察干预因素对胰岛素抵抗的直接影响，可用于改善胰岛素抵抗药物的初步筛选。目前，普遍认为胰岛素抵抗发生的主要靶器官和靶组织是肝脏、肌肉和脂肪组织，因此，胰岛素抵抗体外细胞模型的常用细胞有hepg2人肝癌细胞、3t3-l1脂肪细胞、c2c12骨骼肌细胞细胞；建立胰岛素抵抗细胞模型的常用方法有高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖、游离脂肪酸、地塞米松、肿瘤坏死因子等诱导；较为成熟的胰岛素抵抗体外细胞模型主要有地塞米松诱导模型、游离脂肪酸诱导模型、肿瘤坏死因子诱导模型等，但均局限在脂肪细胞、肝细胞、骨骼肌细胞，针对氢化可的松和胰岛素联合诱导的心肌细胞的胰岛素抵抗细胞模型国内外未见报道。现有技术如授权公告号为cn101619304b的中国发明专利，公开了一种卵巢胰岛素抵抗模型的构建方法，包括以下步骤：小鼠处死后取出卵巢采用体外培养基在co2培养箱中进行体外培养；其中，在进行体外培养时向体外培养基中加入地塞米松进行诱导，建立地塞米松诱导的卵巢胰岛素抵抗模型。通过检测培养液葡萄糖含量评估胰岛素抵抗模型卵巢功能的变化情况，说明卵巢胰岛素抵抗模型建成。但是该卵巢胰岛素抵抗模型的部位是卵巢。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种建模方法简单、模型稳定性高、成本低、周期短的新型胰岛素抵抗细胞模型的建立方法。本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：胰岛素抵抗细胞模型的建立方法，包括心肌细胞培养、实验分组与造模、胰岛素抵抗心肌细胞模型的鉴定，通过向培养心肌细胞的培养基中加入氢化可的松和胰岛素联合诱导心肌细胞的胰岛素抵抗，得到胰岛素抵抗细胞模型，然后采用3h-d-葡萄糖掺入实验评价细胞的胰岛素敏感性，具体步骤为：心肌细胞培养：取sd大鼠，在无菌的条件下，开胸取出心脏，用d-hanks液冲洗3次后剪成约1mm3大小的碎块，加入混合酶消化液，取消化完毕后的上清液，200目细胞网筛过滤，所得细胞悬液差速贴壁后以1×106/ml的密度接种于6孔板，加入5-溴脱尿苷0.05-0.15mmol/l、烟酰胺0.005-0.02mmol/l、二胜肽0.001-0.01mmol/l，在二氧化碳孵育箱内以含5-15％血清的低糖dmem培养基培养；当培养基中细胞营养充足、ph适宜时，细胞自由伸展并紧密贴附在转瓶壁上，当细胞数过多，在转瓶转动时因震动、液流冲击及自身重力共同作用导致细胞大片脱落，因此，优化培养基成分，对维持心肌细胞良好的生长形态，快速增殖分化有很大帮助，烟酰胺、二胜肽的存在，使心肌细胞呈自由生长形态，与细胞瓶壁接触面较大，并且贴壁更紧密，因而不易脱落；实验分组与造模：常规进行心肌细胞原代培养48h后，换为无血清的低糖dmem培养基培养24h，之后随机分为对照组和试验组，每组8只，对照组，以低糖dmem培养基培养，试验组，以氢化可的松加胰岛素共同干预36h；氢化可的松为糖皮质类激素，能抑制外周组织对葡萄糖的摄取和利用，高浓度的糖皮质激素抑制胰岛素与其受体结合，并损伤外周组织胰岛素受体的葡萄糖转运系统，导致胰岛素抵抗；氢化可的松和胰岛素联合使用对诱导心肌细胞胰岛素抵抗有协同增益的作用，这可能是因为，胰岛素由胰岛β细胞产生的促进糖原、蛋白和脂肪合成的蛋白质激素，有促进细胞分化增殖作用，中和了氢化可的松对细胞活力的影响，同时在氢化可的松诱发的心肌细胞胰岛素抵抗过程中，加重胰岛素抵抗状态，使建立的心肌细胞胰岛素抵抗模型更稳定可靠；胰岛素抵抗心肌细胞模型：对照组和试验组心肌细胞干预结束后，各加入0.5-1.5ml低糖dmem培养液再孵育20-50min，然后加入3h-d-葡萄糖继续孵育0.5-1.5h，洗涤细胞后将细胞溶解，取100μl测定蛋白质浓度，用500-700μl/ml冷乙醇溶液洗涤2次，离心，弃去上清液，将沉淀物置于滤纸片上，洗涤后烤干，置于5-15ml闪烁液中，用液体闪烁仪测定放射性计数，得出3h-d-葡萄糖掺入率，单位为nmol/mg-1/h-1。作为优选，心肌细胞培养步骤中，所用心肌细胞来自新生sd大鼠，进一步优选为新生3-4天的sd大鼠。作为优选，实验分组与造模步骤中，所用氢化可的松的加入量为0.5-3μmol/l，胰岛素的加入量为0.5-5×10-7mmol/l。进一步优选，实验分组与造模步骤中，所用氢化可的松的加入量为1μmol/l，胰岛素的加入量为1×10-7mmol/l。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过向培养心肌细胞的培养基中加入氢化可的松和胰岛素联合诱导心肌细胞的胰岛素抵抗，得到胰岛素抵抗细胞模型，然后采用3h-d-葡萄糖掺入实验评价细胞的胰岛素敏感性，为进一步研究心肌细胞胰岛素抵抗奠定基础；采用氢化可的松和胰岛素联合诱导心肌细胞建立心肌细胞胰岛素抵抗模型，通过检测培养液葡萄糖含量评估胰岛素抵抗模型心肌细胞的功能变化，实验结果显示，经氢化可的松处理后，心肌细胞对葡萄糖的摄取量下降，在胰岛素刺激下，氢化可的松处理的心肌细胞对葡萄糖的摄取量更明显下降，说明心肌细胞胰岛素抵抗模型成功；本发明细胞模型的建模方法简单，成本低廉，稳定性好，为胰岛素抵抗细胞模型的建立提供一种新的思路。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：实验动物：2-3d的sprague-dawley(sd)大鼠(河北医科大学实验动物中心提供)32只。药品与试剂：dmem低糖培养液、d-hanks、ⅱ型胶原酶干粉均为gibco公司产品；胰蛋白酶干粉为hyclone产品；新生牛血清、d-甘露醇、牛胰岛素、多聚甲醛为sigma公司产品；brdu为boster产品；多聚赖氨酸为amresco产品；apn抗体为abeam产品；pcr扩增试剂为promega产品；引物由上海生工生物工程有限公司合成；琼脂糖为北方同正产品；其他试剂均为分析纯。混合酶消化液配置方法，胰蛋白酶干粉0.08g，ii型胶原酶干粉0.032g，加入37℃预热的d-hanks液至80ml，摇匀，过滤除菌，即用即配。胰岛素抵抗细胞模型的建立方法，包括心肌细胞培养、实验分组与造模、胰岛素抵抗心肌细胞模型的鉴定，通过向培养心肌细胞的培养基中加入氢化可的松和胰岛素联合诱导心肌细胞的胰岛素抵抗，得到胰岛素抵抗细胞模型，然后采用3h-d-葡萄糖掺入实验评价细胞的胰岛素敏感性，具体步骤为：心肌细胞培养：取新生3-4天的sd大鼠，在无菌的条件下，开胸取出心脏，用d-hanks液冲洗3次后剪成约1mm3大小的碎块，加入混合酶消化液，取消化完毕后的上清液，200目细胞网筛过滤，所得细胞悬液差速贴壁后以1×106/ml的密度接种于6孔板，加入5-溴脱尿苷0.05-0.15mmol/l、烟酰胺0.005-0.02mmol/l、二胜肽0.001-0.01mmol/l，在二氧化碳孵育箱内以含5-15％血清的低糖dmem培养基培养；实验分组与造模：常规进行心肌细胞原代培养48h后，换为无血清的低糖dmem培养基培养24h，之后随机分为对照组和试验组，每组8只，对照组，以低糖dmem培养基培养，试验组，以氢化可的松+胰岛素共同干预36h；胰岛素抵抗心肌细胞模型：对照组和试验组心肌细胞干预结束后，各加入0.5-1.5ml低糖dmem培养液再孵育20-50min，然后加入3h-d-葡萄糖继续孵育0.5-1.5h，洗涤细胞后将细胞溶解，取100μl测定蛋白质浓度，用500-700μl/ml冷乙醇溶液洗涤2次，离心，弃去上清液，将沉淀物置于滤纸片上，洗涤后烤干，置于5-15ml闪烁液中，用液体闪烁仪测定放射性计数，得出3h-d-葡萄糖掺入率，单位为nmol/mg-1/h-1，见表1。表1心肌细胞3h-d-葡萄糖掺入率组别心肌细胞3h-d-葡萄糖掺入率(nmol/mg-1/h-1)对照组14.43试验组11.62从表1可以看出，试验组的心肌细胞3h-d-葡萄糖掺入率较对照组显著下降，说明试验组心肌细胞发生了胰岛素抵抗，心肌细胞胰岛素抵抗细胞模型建模成功。本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12