抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用的制作方法

专利名称：抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本专利涉及双特异性单克隆抗体药物，特别涉及抗肿瘤血管新生的抗人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的双特异性单克隆抗体药物；
背景技术：
早在一个多世纪以前，就有文献报道过肿瘤生长伴随着新生血管生成(!^errara 2002)。但直到1939年，才由Ide及其同事首次提出，可能存在着某种肿瘤来源的血管生长刺激因子为肿瘤的生长提供血管供应(Ide et al. 1939)。数年后，由于观察到血管密度的增高会先于肿瘤的快速生长，Algire等人认为“肿瘤的快速扩散取决于丰富的血管供给”(Algire et al. 1945)。在上个世纪六十年代，Greenblatt、Shubik(Greenblatt et al. 1968)和Ehrmann、Knoth (Ehrmann et al. 1968)两个研究小组的实验相继提供初步证据，证实肿瘤的血管生成是由肿瘤细胞产生的某些可扩散因子介导。1971年，美国科学家福克曼(Judah Folkman)在《新英格兰医学杂志》中提出， 抗血管生成可能是一种有效的抗癌手段(Folkman 1971)。从七十年代早期开始，以这个前瞻性的假说为基础，福克曼及其研究小组致力于从人体和动物的肿瘤中分离某种‘肿瘤血管生成因子‘(Folkman et al. 1971)。1978年，Gullino也提出了抑制血管生成能避免癌症的观点(Gullino 1978)。随后，多种血管源因子(如，表皮生长因子EGF，转化生长因子TGF-α、TGF-β，肿瘤生长因子TNF-α和血管生长素等)先后被发现(Folkman et al. 1987)。血管内皮生长因子(VEGF)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，也可写作 VEGF-A)是一个血管生成的关键调节因子，对于VEGF基因家族在血管生成调节中所扮演的角色，人们已经深入研究了十多年之久Perrara 2002)。VEGF家族目前主要包括原型成员(VEGF-A)、胎盘生长因子(placenta growth factor, P1GF) (Maglione et al. 1991)、 VEGF-B (Olofsson et al. 1996), VEGF-C (Joukov et al. 1996), VEGF-D (Orlandini et al. 1996)。其中VEGF-A是诱导肿瘤血管生成作用最强、特异性最高的血管生长因子。VEGF 有3个高亲合性的酪氨酸激酶受体(RTKs)，分别为VEGFR-I (Flt-I) (Shibuya et al. 1990 ； de Vries et al. 1992)、VEGFR-2 (KDR、Flk-1) (Yoshiji et al. 1996 ；Ellis et al. 1998 ； Tomisawa et al. 1999)和 VEGFR3 (Flt_4) (Joukov et al. 1996)。KDR 是血管形成的主要调控分子，具有明显的化学趋化和促分裂作用，与血管岛、血管形成和造血有关。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1 2mm3。肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因，而在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，血管生成均发挥着重要作用。原位杂交研究已经发现VEGF mRNA在多种人类肿瘤中都有表达，包括肺癌(Volmet al. 1997)、乳腺癌(Yoshiji et al. 1996)、胃肠癌(Ellis et al. 1998)、肾癌(Tomisawa et al. 1999)和卵巢癌(Sowter et al. 1997)。多家实验室使用多种抗VEGF的手段均已实现了肿瘤生长的抑制，这些方法包括针对VEGF或其受体(VEGFRs)的抗体、可溶性受体， VEGFRs酪氨酸激酶的小分子抑制剂以及利用VEGF的突变异二聚体封闭其受体结合位点寸。1993年，费拉拉制备了 VEGF的鼠源性抗体，在体外实验中，鼠源性抗体可以显著抑制数种人类癌细胞系的生长。从此，VEGF抗体的临床应用价值开始显露。为了降低鼠源性抗体的免疫原性，费拉拉将鼠源抗体的骨架换做了人源抗体IgGl的部分，由此诞生了基因泰克公司“重磅炸弹级”药物一贝伐单抗(Avastin)。它是一种抗VEGF的人源化抗体(IgGl)，93 %的人源结构域和7 %的鼠源结合区域组成，是全世界第一个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物，2004年2月美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准该药用于治疗转移性结肠癌(mCRC)、小细胞分子肺癌(6BM)和转移性肾癌。阿瓦斯汀区别于已有抗癌药物，以VEGF为药物靶点，加之抗体的特异性结合能力，使其临床疗效显著。在人体试验中，即使对于晚期的癌症患者，注射阿瓦斯汀也可延长寿命数月。2007年ASCO会议Souglakos报道Avastin联合靶向EGFR的单克隆抗体 Cetuximab (西妥昔单抗)可以安全有效地治疗化疗失败的晚期转移性结直肠癌。基因泰克公司正在用Avastin对超过40种癌症进行适应症研究，希望可以生产出更多的单抗延伸产品。同时，他们也在研究将全抗体分子IgG切割之后，先将蛋白用原核细胞表达，然后再将其通过基因工程的手段连接为IgG。除了癌症外，VEGF也是治疗包括老年性黄斑变性(AMD)，糖尿病引起的眼底病在内的多种眼科疾病关键。为了治疗这些疾病，在Avastin的基础上，基因泰克公司又将其全抗体分子结构进行简化，保留能够中和VEGF的抗体片段，同时将给药途径由静脉注射改为玻璃体直接注射，由此成就另一药物一Avastin的孪生姊妹兰尼单抗(Lucentis)。 2006年，兰尼单抗被美国药监局批准用于治疗老年黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)，很快就成为治疗老年性黄斑变性，糖尿病引起的眼底病的首选药，占领北美市场80%以上的份额。血小板衍生生长因子及其受体血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)是普遍存在的一种由sis原癌基因编码的生长因子，最初从血小板α中分离得到，主要由巨核细胞合成，在组织损伤修复，血管生成和细胞分化过程中起到非常重要的作用(Heldin 1992)。PDGF分子是一个糖蛋白二聚体，可分为_AA，-BB和-AB三种类型。PDGF及其受体 (Platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)在多种人体月中瘤中都有比较高的表达，如胰腺癌，小细胞肺癌，胃癌和乳腺癌等。PDGFR是一种位于细胞表面的受体酪氨酸激酶(Rec印tor tyrosine kinase, RTK)，可分为两个亚型PDGFRα和PDGFR0 (Matsui et al. 1989)。PDGFRβ可以特异性的与PDGF-BB或-AB结合(Herdaran et al. 1991)而被激活。被激活后，两个PDGFR之间可以形成二聚体，并通过自身磷酸化激活下游的信号转到通路，以实现其调控细胞分化生长的功能。近年来，针对VEGF的靶向型药物对治疗癌症以及老年性黄斑变性(AMD)取得了非常显著的疗效O^errara et al. 2007)。但是这种针对VEGF的靶向治疗仍然存在许多不足， 还有很多改进的空间。例如有的病人对该疗法具有一种内在的耐药性，另外一些癌症病人经治疗后，短期内取得了较好的疗效，但是这种疗效只能维持比较短的时间，之后肿瘤又重新生长(Jain et al. 2005, Shojaei et al. 2007, Gaur et al. 2009)。对于这种对VEGF靶向治疗的抗性，又一种观点认为新生血管周细胞(pericytes)所分泌的PDGFRi^在其中起到了非常重要的作用(Abramsson et al. 2003，Mancuso et al. 2006,Bergers et al. 2008)。抗VEGF/PDGFR0双特异性抗体通过实验室培养的癌细胞模型和小鼠模型所获的证据表明，共同抑制VEGF/VEGFR 和PDGF/PDGFR的功能比单独针对VEGF/VEGFR能更有效的抑制肿瘤组织内新生血管的生长(Bergers et al. 2003，Erber et al. 2004，Pietras et al. 2005，Jo et al. 2006， Shen et al. 2007)。目前，已经有一部分小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)被证实能够用于治疗癌症(Hiles et al. 2008)。这些抑制剂能够与包括VEGFR和PDGFR在内的很多细胞内激酶结合，抑制其功能，从而达到治疗癌症的目的 (Fabian et al. 2005)。但是这些小分子抑制剂对人体具有一定的毒性，特别是其与化疗相结合的时候，毒性更大(Sosman et al. 2007，Roodhart et al. 2008)。相比抑制剂疗法，运用单一的，具有抗VEGF和PDGF信号通路双特异性的人源化抗体作为抗肿瘤药物，具有更大的优势和更光明的前景。参考文献Abramsson A, Lindblom P, Betsholtz C. Endothelial and nonendothelial sources of PDGF-B regulate pericyte recruitment and influence vascular pattern formation in tumors. The Journal of clinical investigation. 2003 ；112 :1142-51.Algire, G. H. , Chalkley, H. W. , Legallais, F. Y. & Park, H. D. Vascular reactions of normal and malignant tissues in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normal and neoplastic transplants. J. Natl Cancer Inst.1945,6,73-85.Bergers G, Hanahan D. Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nature reviews. 2008；8 :592-603.Bergers G, Song S, Meyer-Morse N, Bergsland E, Hanahan D.Benefits of targeting both pericytes and endothelial cells in the tumor vasculature with kinase inhibitors. J Clin Invest. 2003 ；111 :1287-95.de Vries, C. et al. The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science. 1992,255,989-991.Ehrmann, R. L. & Knoth, M.Choriocarcinoma. Transfilter stimulation of vasoproliferation in the hamster cheek pouch.Studied by light and electron microscopy. J. Natl. Cancer Inst.1968,41,1329-1341.Ellis, L. M. et al. Vessel counts and vascular endothelial growth factor expression in pancreatic adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 1998, 34, 337-340.Erber R,Thurnher A,Katsen AD,Groth G,Kerger H,Hammes HP,et al. Combined inhibition of VEGF and PDGF signaling enforces tumor vessel regression by interfering with pericyte-mediated endothelial cell survival mechanisms. FASEBJ. 2004 ；18 :338-40.Fabian MA, Biggs WH,3rd, Treiber DK, Atteridge CE, Azimioara MD， Benedetti MG，et al. A small molecule—kinase interaction map for clinical kinase inhibitors. Nat Biotechnol. 2005 ；23 :329-36.Ferrara, N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nature Rev. Cancer. 2002，2，795-803.Ferrara N，Mass RD，Campa C，Kim R. Target ing VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 2007 ；58 :491-504.Folkman J. Tumor angiogenesis :therapeutic implication[J]. N Engl J Med, 1971,285(21) :11821186.Folkman, J. & Klagsbrun, Μ. Angiogenic factors. Science. 1987, 235,442-447.Folkman，J.，Merler，E.，Abernathy, C. &Williams, G. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. J. Exp. Med. 1971，133，275-288·Gaur P，Bose D，Samuel S，Ellis LM. Targeting tumor angiogenesis. Semin Oncol. 2009 ；36 :12-9.Gullino，P. M. Angiogenesis and oncogenesis. J. Natl Cancer Inst. 1978，61， 639-643.Heidaran MA，Pierce JH, Yu JC, Lombardi D， Artrip JE, Fleming TP， Thomason A，Aaronson SA. Role of alpha β receptor heterodimer formation in β platelet-derived growth factor (PDGF) receptor activation by PDGF-AB. J Biol Chem. 1991 ；266 (30) :20232-7.Heldin CH. Structural and functional studies on platelet-derived growth factor. EMBO J. 1992 ；11 (12) :4251-9.Hiles JJ，Kolesar JM. Role of sunitinib and sorafenib in the treatment of metastatic renal cell carcinoma. Am J Health Syst Pharm. 2008 ；65 :123-31.Ide, A. G.，Baker，N. H. &Warren, S. L. Vascularization of theBrown Pearce rabbit epithelioma transplant as seen in thetransparent ear chamber. Am. J. Roentgenol. 1939，42，891-899.Jain RK. Antiangiogenic therapy for cancer :current and emerging concepts. Oncology. 2005 ；19 :7-16.Jo N，Mailhos C， Ju M， Cheung E, Bradley J， Nishijima K， et al. Inhibition of platelet-derived growth factor B signaling enhances the efficacy of anti-vascular endothelial growth factor therapy in multiple models of ocular neovascularization. Am J Pathol. 2006 ；168 :2036-53.Joukov, V. et al. A novel vascular endothelial growth factor，VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3)and KDR(VEGFR-2)receptor tyrosine kinases. EMBO J. 1996，15，1751.Mancuso MR，Davis R，Norberg SM, 0' Brien S，Sennino B，Nakahara T，et al. Rapid vascular regrowth in tumors after reversal of VEGF inhibition. J ClinInvest. 2006 ；116 :2610-21.Matsui T, Heidaran M，Miki T，Popescu N, La Rochelle W, Kraus M, Pierce J, Aaronson S.Isolation of a novel receptor cDNA establishes the existence of two PDGF receptor genes. Science. 1989 ；243 (4892) :800-4.Pietras K， Hanahan D.A multitargeted， metronomic and maximum-tolerated dose "chemo-switch"regimen is antiangiogenic,producing objective responses and survival benefit in a mouse model of cancer. J Clin Oncol. 2005 ；23 :939-52.Roodhart JM，Langenberg MH, Witteveen E，Voest EE.The molecular basis of class side effects due to treatment with inhibitors of the VEGF/VEGFR pathway. Curr Clin Pharmacol. 2008 ；3 :132-43.Shen J，Vil MD，Zhang H，Tonra JR，Rong LL，Damoci C，et al.An antibody directed against PDGF receptor β enhances the antitumor and the anti—angiogenic activities of an anti-VEGF receptor 2antibody. Biochem Biophys Res Commun. 2007 ； 357 :1142-7.Shibuya，M. et al. Nucleotide sequence and expression of a novel human receptor-type tyrosine kinase(fit)closely related to the fms family. Oncogene. 1990，8，519-527.Shojaei F,Ferrara N. Antiangiogenic therapy for cancer :an update. Cancer J. 2007 ；13 :345-8.Sosman JA, PuzanovI, Atkins MB. Opportunities and obstacles to combination targeted therapy in renal cell cancer. Clin Cancer Res. 2007 ； 13 764-9.Sowter, H. Μ. et al. Expression and localization of the vascular endothelial growth factor family in ovarian epithelial tumors. Lab. Invest. 1997, 77，607-614.Tomisawa，M. et al. Expression pattern of vascular endothelial growth factor isoform is closely correlated with tumour stage and vascularisation in renal cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 1999, 35,133-137.Yoshij i，H.，Gomez, D. E.，Shibuya, M. & Thorgeirsson，U. P. Expression of vascular endothelial growth factor, its receptor, and other angiogenic factors in human breast cancer. Cancer Res. 1996，56，2013-2016·

发明内容
发明目的本发明提供抗VEGF-PDGFR双特异性抗体，其运用基因工程等技术手段，将识别 VEGF和识别PDGFR β的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体。技术方案抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗PDGFR β单链抗体构成。FC段末端通过(GGGGQ 3连接抗PDGFR β单链抗体。抗VEGF 单克隆抗体由 Anti-VEGF A Fab VH-CH、Anti-VEGF A Fab VL-CL 禾口 Fc 组成；其中 Anti-VEGF A Fab VH-CH 的氨基酸序列表为 SEQ NO. 3、Anti-VEGF A Fab VL-CL 的氨基酸序列表为SEQ NO. 4、Fc的氨基酸序列表SEQN0. 5。所述的抗PDGFR β 单链抗体由 Anti-PDGFR β scFv VL 和 Anti-PDGFR β scFv VH 通过(GGGGS)3连接而成组成；其中Anti-PDGFR^ scFv VL的氨基酸序列表为SEQ NO. 1、 Anti-PDGFR β scFv VH 的氨基酸序列表为 SEQ NO. 2。抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。有益效果1、本专利涉及的双特异性抗体是运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别 PDGFRii的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体，并且具有很好看肿瘤活性。 2、本专利涉及的双特异性抗体可以特异性结合VEGF-A和PDGFR β分子，抑制其刺激新生血管生长的生物学功能。实验表明，该双特异性抗体单独结合VEGF-A或PDGFR β的能力与抗VEGF-A或抗PDGFRβ单克隆抗体近似，并且其具有很强的同时与这两种抗原结合的能力。实验表明，同时抑制VEGF-A和PDGFR β比单独抑制两者中的一种能够更好的抑制肿瘤血管的生长，因此使用该双特异性抗体即能有效的抑制肿瘤组织的生长，又能避免同时使用两种单克隆抗体时用药量的增加，给患者带来的不可预知的风险。


图1.抗VEGF-PDGFRii双特异性抗体结构示意图。该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗PDGFRii单链抗体(scFv)构成；图2.抗VEGF-PDGFRii双特异性抗体重链表达载体；图3.抗VEGF Fab轻链表达载体；图4.抗VEGF_PDGFR0双特异性抗体(bsAb)同时结合hVEGF-A和PDGFR β测试 (Biacore)。第一步，流动相中的bsAb与固定相中的hVEGF-A结合；第二步，hVEGF-A-bsAb 复合物与流动相中的PDGFR β结合0nM PDGFR β (蓝线)，500nM PDGFR β (红线)。图5.抗VEGF-PDGFR β双特异性抗体抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人脑血管周细胞(HBVP)生长体外试验A.在2nM VEGF-A存在的条件下，HUVECs中分别加入 anti-VEGF mAb (bevacizumab)，anti-VEGF scFv 和 anti-VEGF-PDGFR β bsAb,培养 48 小时；B.在 0. 4nM PDGFR β 存在的条件下，HBVP 中分别加入 anti-PDGFR β mAb, anti-PDGFR β scFv 和 anti-VEGF-PDGFR β bsAb。(η = 4)；图6. HUVECs和HBVP共培养，测试抗VEGF-PDGFR β bsAb对血管内皮细胞生长，及内皮细胞-周细胞结合的抑制作用A. Bevacizumab，Bevacizumab+anti PDGFR β 和anti-VEGF-PDGFR β bsAb (同为25nM)对新生血管生长的抑制效果；B.不同浓度的 Bevacizumab和anti-VEGF-PDGFR β bsAb对新生血管生长的抑制效果。图7.重组双特异性单克隆抗体在哺乳动物细胞中表达与生产流程图。构建好的表达载体转入细胞后，在96孔板中培养，筛选稳定表达的细胞株。筛选得到的细胞株逐级放大培养，最后在生物反应器中进行大规模生产。
具体实施例方式实施例1抗VEGF-PDGFRbeta双特异性抗体的制备方法1.抗VEGF-PDGFRbeta双特异性抗体(bsAb)核苷酸序列设计和合成根据该bsAb 重链 VHvegf-CHI腳-CH2VEGF-CH3VEGF-(GGGGS) 3-VHPDGFKbeta-(GGGGS)3-VLPDGFEbeta的氨基酸序列和连接形式设计重链核苷酸序列，并在该序列5’端加入Me I 酶切位点，KOZAK序列及前导序列，在其3’端加入)(h0 I酶切位点。设计3个3’端含 EcoRI酶切位点的寡核苷酸引物，分别合成重链VHvkf-CHIvkf, CH2VEeF-CH3VE(;F-(GGGGS)3和 VHPDeFKbeta-(GGGGS) 3-VLPDeFKbeta片断，应用 PCR直接连接法(SDL PCR)合成全长 2118bp 的 bsAb 重链基因。根据人抗VEGF-A IgGl轻链氨基酸序列，设计5，端含Not I酶切位点，KOZAK序列及前导序列，3’端含hi I酶切位点的PCR引物，应用PCR法扩增全长639bp的人抗VEGF-A 轻链基因。2.抗 VEGF-PDGFRbeta bsAb 表达载体的构建将该bsAb重链基因用Me I和Xho I双酶切，将轻链基因用Not I,Psi I双酶切后，用T4连接酶将重链基因连接到经Mc I和B10 I处理的真核表达载体中；将轻链基因连接到经Not I和hi I处理的真核表达载体中。这两个表达载体(包含phoA启动子)接着被转入BL21感受态大肠杆菌菌株。转化后的BL21菌株选取阳性克隆，在含50ug/mL的LB培养基QmL)中于37°C过夜培养。之后菌株转入2L含50ug/mL的CRAP培养基中于30°C培养M小时。菌液3000转常温离心弃上清，所得的大肠杆菌用Qiagen公司的质粒提取试剂盒裂解并提取质粒，获得含重链和轻链的表达载体。纯化后的两个表达载体用电穿孔法同时转入CHO细胞中，在新霉素(neo)存在的条件下悬浮培养。重组抗体用亲和层析法(Protein Α)和分子筛层析分离提纯分子量为 200kDa左右的完整双特异性抗体分子。提纯后的各个组分通过SDS-PAGE法鉴定。实施例2抗原抗体结合实验抗原抗体结合实验均使用Biacore T 100系统(GE Healthcare)高密度的 VEGF-A (1000RU)通过共价结合固定于CM4芯片上，bsAb稀释至IOOnM并注入系统，使其以 10uL/min的流速流过固定于芯片上的VEGF-A表面，共5分钟。PDGFR β (500ηΜ)随后以 30uL/min的流速注入，共10分钟。实验结果中的结合曲线由Biacore Evaluation Software vl. 1. 1自动生成。共结合实验得到的曲线与该双特异性抗体分别与VEGF-A或PDGFRii结合生成的曲线基本一致，说明该抗体能够同时特异性结合VEGF-A和PDGFRii。见图4.抗 VEGF-PDGFR β双特异性抗体(bsAb)同时结合hVEGF-A和PDGFR0测试(Biacore)。第一步，流动相中的bsAb与固定相中的hVEGF-A结合；第二步，hVEGF-A-bsAb复合物与流动相中的 PDGFR β 结合0nM PDGFR β (蓝线)，500nM PDGFR β (红线)。实施例3
抗体抑制血管实验比较HUVECs细胞接入96孔板，密度为每孔1000个细胞左右，于EGM-2MV培养基中37°C 培养48小时，之后细胞于含1乘胰岛素-转铁因子-硒纳的无血清培养基中37°C培养。M 小时后移除原培养基，换含有2. 6nM hVEGF-A及不同浓度(0. 0005nM-500nM)的抗VEGF-A 全抗(bevazimumab)，抗VEGF-A Fab或bsAb，37°C培养M小时。之后细胞中加入IuCi/孔的3H-胸苷，37°C培养M小时。HBVPs细胞接入96孔板中，密度为每孔500个细胞左右。细胞于含血清及PGS的培养基中37°C培养48小时，之后换无血清培养基37°C培养M小时。加入0. 4nM PDGFR β 以刺激细胞生长，同时加入不同浓度梯度QOOOnM-O. 02ηΜ)的抗PDGFR β全抗体，抗PDGFR β scFv或bsAb，继续37°C培养24小时。每孔加入IuCi 3H-胸苷，培养6小时。细胞DNA中插入的3H-胸苷量用I^ackard Top count测量，数据分析由GraphPad Prism software完成。该实验结果表明，抗VEGF-PDGFR β bsAb对VEGF或PDGFR β介导的内皮细胞生长有显著的抑制作用。而且该bsAb对VEGF介导的细胞生长，或者PDGFR β 介导的细胞生长的抑制作用与分别使用bevacizumab或anti-PDGFR β单抗效果相近。见图5.抗VEGF-PDGFR β双特异性抗体抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人脑血管周细胞(HBVP)生长体外试验A.在2nM VEGF-A存在的条件下，HUVECs中分别加入anti_VEGF mAb (bevacizumab)，anti-VEGF scFv 禾口 anti-VEGF-PDGFR β bsAb,培养 48 小时；B.在 0. 4nM PDGFRβ 存在的条件下，HBVP 中分别加入 anti-PDGFRβ mAb，anti-PDGFRβ scFv 和 anti-VEGF-PDGFRβ bsAb。(η = 4)HUVECs细胞附着于Cytodex 3微载体上过夜培养，之后接种人间质干细胞，并将微载体置于含纤维蛋白胶(fibrin gel)的12孔板中QOO个微载体/孔)。加入含 2ng/mL人HGF的EGM-2培养基，每两天更换新鲜培养基。从第8天开始，加入不同浓度的 bevacizumab, anti-PDGFR β 单抗或抗 VEGF-PDGFR β bsAb。培养 7 天后，细胞用 4% 的 PFA 于4°C固定过夜。HUVECs细胞用抗PECAM抗体及相应的偶联有荧光集团的二抗染色；周质细胞用anti-α SMA-Cy3染色。实验显示，同时加入bevacizumab和anti-PDGFR β单抗对内皮细胞出芽生长(模拟血管新生)有显著的抑制作用；另外加入抗VEGF-PDGFR β bsAb 对内皮细胞出芽生长的抑制作用与同时使用两种单抗效果近似。图6. HUVECs和人间质干细胞共培养，测试抗VEGF-PDGFR β bsAb对血管内皮细胞生长，及内皮细胞_周细胞结合的抑制作用A. Bevacizumab，Bevacizumab+anti PDGFR β 和 anti-VEGF-PDGFR PbsAb (同为25nM)对新生血管生长的抑制效果；B.不同浓度的Bevacizumab和anti-VEGF-PDGFR β bsAb对新生血管生长的抑制效果。实施例4抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体对人鼻咽癌CNE裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验取生长旺盛期的瘤组织剪切成1. 5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。 使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1 次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体，每天 1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式
TV = 0. 52XaXb2其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/c(% )，计算公式如下T/C(% ) = Tetv/CetvX 100%Tetv 治疗组RTV ；Cetv 阴性对照组RTV表3.抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体对人鼻咽癌CNE裸鼠异种移植肿瘤生长的抑
制作用
组别剂量起始体重(g)起始终末体重(g)终末瘤重(g)抑瘤率(mg/kg)动物数动物数阴性对照一23.081222.67121.102一顺铂1021.43820.3370.29073.68%恩度2.522.57822.1780.60545.10%抗622.13822.1480.49455.17%VEGF/PDGFΚβ双特异性抗体卨抗323.75824.0080.42761.25%VEGF/PDGFΙφ双特异性抗体中抗1.523.40823.7080.54650.45%VEGF/PDGFΙφ双特异性抗体低结果见表3顺钼组10mg/kg，对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为73. 68%, 但对实验动物的体重具有显著性的影响；恩度组2. 5mg/kg，对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为45. 10% ；抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体高、中、低剂量组对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤的抑瘤率为55. 17%，61. 25%，50. 45%，对实验动物体重无显著性影响。抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体对人鼻咽癌CNE裸小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明，与阴性对照组相比，抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体:3mg/kg组对人鼻咽癌CNE移植瘤的生长有最好的抑制作用；与阳性对照顺钼组相比，对实验动物的体重没有影响，未见明显的毒副反应。实施例5抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体对人甲状腺癌SW-579裸小鼠异种移植肿瘤生长抑制试验取生长旺盛期的瘤组织剪切成1. 5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧皮下。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-200mm3后动物随机分组。 使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每2天1 次，每次测量同时还需称量鼠重。实验组尾静脉注射抗VEGF/PDGFR β双特异性抗体，每天1次，阴性组同时给等量生理盐水。肿瘤体积计算公式TV = 0. 52XaXb2其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/c(% )，计算公式如下T/C(% ) = Tetv/CetvX 100%Tetv 治疗组RTV ；Cetv 阴性对照组RTV表4.抗VEGF/PDGFRi3双特异性抗体对人甲状腺癌SW-579裸鼠异种移植肿瘤生
长的抑制作用
权利要求
1.抗VEGF/PDGFRi3双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗PDGFR β单链抗体构成。
2.根据权利要求1所述的抗VEGF/PDGFRi3双特异性抗体，其特征在于FC段末端通过 (GGGGS)3连接抗PDGFR^单链抗体。
3.根据权利要求1所述的抗VEGF/PDGFRi3双特异性抗体，其特征在于抗VEGF单克隆抗体由 Anti-VEGF A Fab VH-CH、Anti-VEGF A Fab VL-CL 和 Fc 组成；其中 Anti-VEGF A Fab VH-CH的氨基酸序列表为SEQ NO. 3、Anti-VEGF A Fab VL-CL的氨基酸序列表为SEQ NO. 4、Fc的氨基酸序列表SEQ NO. 5。
4.根据权利要求1或2所述的抗VEGF/PDGFRi3双特异性抗体，其特征在于所述的抗 PDGFR β 单链抗体由 Anti-PDGFR β scFv VL 和 Anti-PDGFR β scFv VH 通过(GGGGS) 3 连接而成组成；其中Anti-PDGFR β scFv VL的氨基酸序列表为SEQ NO. l、Anti_PDGFR β scFv VH的氨基酸序列表为SEQ NO. 2。
5.抗VEGF/PDGFRi3双特异性抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及双特异性单克隆抗体药物，特别涉及抗肿瘤血管新生的抗人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和人血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的双特异性单克隆抗体药物；抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体，其特征在于该抗体由抗VEGF单克隆抗体为基础，并在其FC段末端连接抗PDGFRβ单链抗体构成。本发明涉及的双特异性抗体是运用基因工程等技术手段，将识别VEGF和识别PDGFRβ的抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性的与这两者结合，其抑制肿瘤组织血管新生的效果明显优于单独使用抗VEGF抗体，并且具有很好看肿瘤活性。
文档编号A61K39/395GK102250246SQ20111015432
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月10日 优先权日2011年6月10日
发明者叶亚东, 朱文华, 滕凌, 潘鹂, 路易斯易格那罗, 霍世元 申请人:常州亚当生物技术有限公司