一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法与流程

本发明属于基因重组发酵
技术领域：
，具体涉及一种乳酸脱氢酶突变体基因lbldh1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法。
背景技术：
：nadh依赖的乳酸脱氢酶(ldh)是一种乳酸菌发酵代谢中的一个关键酶，其以nadh作为辅酶，经过生化反应将丙酮酸还原成乳酸，同时将nadh氧化成nad。由于乳酸脱氢酶和丙酮酸的价格十分便宜，性质相对稳定，所以可以用于生物转化体系中nad的再生。大约80％生物催化的氧化还原反应都需要nad或者nadh作为辅酶，由于nad和nadh价格十分昂贵，所以生物催化反应中的辅酶都需要进行循环再生，以减少体系中辅酶的用量并提高反应的经济性。辅酶再生有多种方法，包括酶法、化学法、基因工程法等，其中酶法由于具备最温和，最经济的优势，成为了目前的研究热点，所以其在工业生物催化反应中具有广阔的运用前景。技术实现要素：本发明的目的是提供一种经优化后可以在大肠杆菌中高效可溶表达，且经过高压均质机处理后得到高酶活的粗酶液，用于生物催化反应中的辅酶再生。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种重组乳酸脱氢酶突变体，其特征在于：它是在将乳酸脱氢酶第63位谷氨酸突变为亮氨酸，将192位缬氨酸突变为蛋氨酸，将211位天冬氨酸突变为赖氨酸的突变体。进一步地，所述突变体的氨基酸序列如seqidno.2所示。进一步地，所述突变体由seqidno.1所示的核苷酸序列编码。一种乳酸脱氢酶突变体基因lbldh1，其特征在于：所述lbldh1的核苷酸序列如seqidno.1所示。一种重组载体，其特征在于：它包括前述乳酸脱氢酶突变体基因lbldh1；优选所述重组载体为重组pet-22b(+)载体、重组pet-28a(+)载体或重组pet-32a(+)载体。一种重组菌，其特征在于：它包括前述的重组载体。进一步地，所述重组菌为重组大肠杆菌；优选为重组e.colidh5α、重组e.colibl21(de3)、重组e.colitop10或重组e.colijm109。本发明还提供了一种前述重组菌发酵的方法：取重组菌的单克隆，接种到含有kan的lb液体培养基中，于摇床中培养过夜，取菌液接种到含有kan的lb液体培养基中，于摇床中扩大培养后，再加入终浓度为0.1mm的iptg诱导表达。培养完成后，收集菌体，按菌体湿重与破菌缓冲液1:3～1:10的比例混合，搅拌均匀后，用高压均质机进行菌体破碎，离心收集上清液即为粗酶液。进一步地，所述摇床中培养过夜的温度37℃、转速160rpm；和/或，所述摇床中扩大培养的温度37℃、转速200rpm；和/或，所述iptg的加入时间是od值达到0.6时；和/或，所述诱导表达的条件是温度25℃、转速200rpm，时间12h；和/或，所述收集菌体的条件是压力5000g、温度4℃，时间5min；和/或，所述破菌缓冲液是磷酸盐缓冲液、tris缓冲液，破菌缓冲液ph值范围是ph7.5～8.5，优选为8.0，浓度是10～100mm；和/或，所述高压均质机破菌压力为300-900bar，破菌次数2次。本发明还提供了一种乳酸脱氢酶突变体的分离纯化方法，其特征在于：它是将重组菌发酵得到的粗酶液上样到2mlnisepharose6ff小预柱上，待上样完成后用缓冲液淋洗到没有杂蛋白洗脱为止，然后用缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白峰，再将收集到的目的蛋白上样到superdex7510/300gl层析柱，用缓冲液进行分离，收集目的蛋白，用sds-page电泳检测为单一条带，与理论分子量一致，即完成纯化。进一步地，所述nisepharose6ff小预柱需要预先用50mmph8.0tris平衡；和/或，所述淋洗用缓冲液为50mmtris、500mmnacl、20mm咪唑组成的ph8.0的混合液；和/或，所述梯度洗脱用缓冲液为50mmtris、500mmnacl、250mm咪唑组成的ph8.0的混合液；和/或，所述分离用缓冲液为50mmph8.0tris。本发明重组乳酸脱氢酶突变体基因lbldh1在大肠杆菌中可获得可溶性高表达，与未进行突变及序列优化的重组乳酸脱氢酶相比，表达量提高了五倍以上；在高ph值下的活性损失更小；低温下可存放5天，活性无明显衰减，在乳酸发酵制备及nad/nadh循环中具有广阔的应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。附图说明图1乳酸脱氢酶突变体纯化前后对比图(泳道1：marker；泳道2：破菌上清液；泳道3：纯化后)图2序列优化前后重组蛋白表达水平对比图(泳道1：marker；泳道2：原有序列；泳道3：优化序列)图3不同ph值条件下的相对酶活具体实施方式实施例1、重组乳酸脱氢酶突变体的制备一、制备方法1、乳酸脱氢酶突变体基因lbldh1编码的重组乳酸脱氢酶突变体序列的设计根据菌株lactobacillusbulgaricus的基因组测序结果，对lbldh1基因的序列进行点突变优化，将63位谷氨酸突变为亮氨酸，将192位缬氨酸突变为蛋氨酸，将211位天冬氨酸突变为赖氨酸，然后采用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子，优化后的序列如seqidno.1所示，表达得到的乳酸脱氢酶突变的氨基酸序列如seqidno.2所示。seqidno.1gaattcatgaccaaaatttttgcgtatgcgattcgtgaagatgaaaaaccgttcctgaaagaatgggaagatgcgcacaaagatgtggaagtggaatacaccgataaactgctgaccccggaaaccgtggccctggccaaaggtgccgatggtgttgttgtttaccagcagctggattacaccgcgctgaccctgcaggcgctggcagataacggtattaccaaaatgagcctgcgtaacgtgggtgtggataacattgatatggcgaaagcgaaagaactgggtttccagattaccaacgtgccggtttacagcccgaacgcgattgcggaacacgccgcgattcaggcggcccgcattctgcgtcaggataaagccatggatgaaaaagtggcccgtcatgatctgcgttgggcaccgaccattggccgtgaagttcgcgatcaggtggttggtgtgattggtaccggccacatcggccaggttttcatgcagattatggaaggcttcggcgcgaaagttattgcgtatgatattttccgcaacccggaactggaaaagaaaggctattacatggactcactggacgacctgtacaaacaggcggacgtgattagcctgcacgttccgaaagttccggcgaacgttcacatgatcaacgacgaaagcatcgcgaaaatgaagcaggacgtagttatcgttaacgtaagccgtggtccgctggttgacaccgacgcggttatccgtggtctggacagcggcaagatctttggttacgcaatggacgtttacgaaggtgaagttggcatctttaacgaagactgggaaggcaaggagtttccggacgcacgtctggctgacctgatcgctcgtccgaacgttctggtgaccccgcacaccgctttctacactactcacgccgttcgcaacatggtagttaaagccttcgacaacaacctggaactggttgaaggcaaagaagccgaaactccggttaaagttggctaactcgagseqidno.2efmtkifayairedekpflkewedahkdveveytdklltpetvalakgadgvvvyqqldytaltlqaladngitkmslrnvgvdnidmakakelgfqitnvpvyspnaiaehaaiqaarilrqdkamdekvarhdlrwaptigrevrdqvvgvigtghigqvfmqimegfgakviaydifrnpelekkgyymdslddlykqadvislhvpkvpanvhmindesiakmkqdvvivnvsrgplvdtdavirgldsgkifgyamdvyegevgifnedwegkefpdarladliarpnvlvtphtafytthavrnmvvkafdnnlelvegkeaetpvkvg在优化后的lbldh1序列的两端分别加入ecorⅰ和xhoⅰ酶切位点，将优化后的序列直接进行全基因合成，得目的片段。2、乳酸脱氢酶突变体重组质粒的构建将目的片段用ecorⅰ和xhoⅰ酶进行双酶切后，连接到同样用ecorⅰ和xhoⅰ酶双酶切后的pet28a(+)载体上，连接好的质粒导入到感受态大肠杆菌dh5α中，进行梯度稀释后涂平板，然后将平板放置到37℃培养箱过夜培养，次日挑取单克隆接种到5ml含有卡拉霉素(kan)的lb培养基中，37℃、160rpm，培养过夜，提取质粒。将质粒送测序，测序正确的质粒命名为pet28a-lbldh1。3、乳酸脱氢酶突变体重组基因工程菌的构建及诱导表达将测序正确的重组质粒pet28a-lbldh1导入到感受态大肠杆菌bl21(de3)中，进行梯度稀释后涂平板，然后将平板放置到37℃培养箱过夜培养，次日挑取单克隆接种到5ml含有kan的lb培养基中，37℃、160rpm培养过夜，取1ml菌液接种到500ml含有kan的lb培养基中，37℃、200rpm培养，待od值达到0.6时，加入终浓度为0.1mm的iptg，25℃、200rpm诱导表达12h。培养完成后，5000g、4℃离心5min收集菌体。取离心收集的菌体，称量湿重后，按照菌湿重与缓冲液1:10的比例加入50mmph8.0的tris缓冲液进行重悬，待液体搅拌均匀后，用高压匀质机800bar进行破菌2次，破菌液10000g离心10min，收集上清液即可得到粗酶液。4、乳酸脱氢酶突变体的分离纯化取破菌上清液5ml，上样到预先用50mmph8.0tris平衡好的2mlnisepharose6ff小预柱上，待上样完成后用50mmtris500mmnacl20mm咪唑ph8.0的缓冲液淋洗到没有杂蛋白洗脱为止，然后用50mmtris500mmnacl250mm咪唑ph8.0的缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白峰；将收集到的目的蛋白上样到superdex7510/300gl层析柱进行分离，缓冲液为50mmph8.0tris，收集目的蛋白峰经过sds-page电泳检测为单一条带，与理论分子量一致，具体结果见图1。以下通过实验例的方式验证本发明的有益效果：实验例1乳酸脱氢酶及其突变体粗酶液活性测定和表达水平比较1、原料乳酸脱氢酶突变体粗酶液按照权利要求的方法制备；乳酸脱氢酶粗酶液的制备方法，除了乳酸脱氢酶未经过63位谷氨酸突变、192位缬氨酸突变和211位天冬氨酸突变以外，其余同实施例1。乳酸脱氢酶的氨基酸如seqidno.3所示，其对应的核苷酸序列如seqidno.4所示seqidno.3efmtkifayairedekpflkewedahkdveveytdklltpetvalakgadgvvvyqqldytaetlqaladngitkmslrnvgvdnidmakakelgfqitnvpvyspnaiaehaaiqaarilrqdkamdekvarhdlrwaptigrevrdqvvgvigtghigqvfmqimegfgakviaydifrnpelekkgyyvdslddlykqadvislhvpdvpanvhmindesiakmkqdvvivnvsrgplvdtdavirgldsgkifgyamdvyegevgifnedwegkefpdarladliarpnvlvtphtafytthavrnmvvkafdnnlelvegkeaetpvkvgseqidno.4gaattcatgactaaaatttttgcttacgcaattcgtgaagatgaaaagccattcttgaaggaatgggaagacgctcacaaggacgtcgaagttgaatacactgacaagcttttgaccccagaaactgttgctttggcaaagggtgctgacggtgttgttgtttaccaacaacttgactacaccgctgaaactctgcaagctttggcagacaacggcatcactaagatgagcctgcgtaacgttggtgttgacaacatcgacatggctaaggctaaggaacttggcttccaaatcaccaacgttccagtttactcaccaaacgccatcgcagaacacgctgctatccaagctgcccgcatcctgcgtcaagacaaggctatggacgaaaaggttgcccgtcacgacttgcgttgggcaccaactatcggccgtgaagttcgcgaccaagttgttggtgttataggtactggccacatcggtcaagtcttcatgcaaatcatggaaggcttcggcgctaaggttatcgcttacgacatcttccgcaacccagaattggaaaagaagggctactacgtagactcacttgacgacctgtacaagcaagctgacgttatttccctgcacgttcctgacgttccagctaacgttcacatgatcaacgacgagtcaatcgctaaaatgaagcaagacgtagttatcgttaacgtatcacgtggtccattggttgacactgacgcggttatccgtggtttggactcaggcaagatcttcggttacgcaatggacgtttacgaaggtgaagttggcatcttcaacgaagactgggaaggcaaggagttcccagacgcacgtttagctgacttaatcgctcgtccaaacgttctggtaactccacacactgctttctacactactcacgctgttcgcaacatggtagttaaggccttcgacaacaaccttgaattggttgaaggcaaggaagctgaaactccagttaaggttggctaactcgag2、检测方法酶活检测：取粗酶液用50mmph8.0的tris缓冲液稀释后，加入到混合均匀的总反应体系(50mmtris缓冲液ph8.0，0.3mmnadh，8mm丙酮酸钠)中，于30℃反应，在340nm处检测反应体系的吸收值变化。表达水平的检测：取粗酶液采用sds-page电泳进行检测，对比序列优化前后蛋白的表达水平。3、检测结果酶活结果见表1，其中酶活性单位(u)定义为：在上述条件下，每一分钟催化1μmolnadh所用的酶量即为1u，结果见表1。表1按酶活检测体系及条件进行检测的比活性酶单位酶活2-8℃存放5天后单位酶活原始序列292u/ml285u/ml优化序列1540u/ml1507u/ml结果显示：与未进行突变的重组乳酸脱氢酶相比，本发明突变的乳酸脱氢酶的酶活提高了五倍以上，且粗酶液在低温下可以存放5天，酶活无明显损失。表达水平的结果如图2所示，本方法突变后的重组蛋白的表达水平明显优于未突变的蛋白的表达水平。实施例2：乳酸脱氢酶及其突变体粗酶液在不同ph值范围下的活性检测1、原料乳酸脱氢酶突变体粗酶液按照权利要求的方法制备；乳酸脱氢酶粗酶液的制备方法，除了乳酸脱氢酶未经过63位谷氨酸突变、192位缬氨酸突变和211位天冬氨酸突变以外，其余同实施例1。2、检测方法酶活检测的反应体系同实验例1，调节体系中tris缓冲液至不同ph值以适应不同ph值条件下的酶活检测，在ph6.0～7.5之间时，则将体系中的tris替换为磷酸盐缓冲液。3、检测结果结果见图3。由图3可以看出，对原有序列进行氨基酸突变后，其最适ph值提高了一个单位在ph值8.0附近，优化后的突变体对于高ph值有更好的耐受性，更有利于酶在偏碱性环境下的运用。序列表<110>四川自豪时代药业有限公司<120>一种乳酸脱氢酶突变体基因lbldh1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法<130>gy003-18p1478<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1014<212>dna<213>目标蛋白的核苷酸序列(artificial)<400>1gaattcatgaccaaaatttttgcgtatgcgattcgtgaagatgaaaaaccgttcctgaaa60gaatgggaagatgcgcacaaagatgtggaagtggaatacaccgataaactgctgaccccg120gaaaccgtggccctggccaaaggtgccgatggtgttgttgtttaccagcagctggattac180accgcgctgaccctgcaggcgctggcagataacggtattaccaaaatgagcctgcgtaac240gtgggtgtggataacattgatatggcgaaagcgaaagaactgggtttccagattaccaac300gtgccggtttacagcccgaacgcgattgcggaacacgccgcgattcaggcggcccgcatt360ctgcgtcaggataaagccatggatgaaaaagtggcccgtcatgatctgcgttgggcaccg420accattggccgtgaagttcgcgatcaggtggttggtgtgattggtaccggccacatcggc480caggttttcatgcagattatggaaggcttcggcgcgaaagttattgcgtatgatattttc540cgcaacccggaactggaaaagaaaggctattacatggactcactggacgacctgtacaaa600caggcggacgtgattagcctgcacgttccgaaagttccggcgaacgttcacatgatcaac660gacgaaagcatcgcgaaaatgaagcaggacgtagttatcgttaacgtaagccgtggtccg720ctggttgacaccgacgcggttatccgtggtctggacagcggcaagatctttggttacgca780atggacgtttacgaaggtgaagttggcatctttaacgaagactgggaaggcaaggagttt840ccggacgcacgtctggctgacctgatcgctcgtccgaacgttctggtgaccccgcacacc900gctttctacactactcacgccgttcgcaacatggtagttaaagccttcgacaacaacctg960gaactggttgaaggcaaagaagccgaaactccggttaaagttggctaactcgag1014<210>2<211>335<212>prt<213>目标蛋白的氨基酸序列(artificial)<400>2gluphemetthrlysilephealatyralailearggluaspglulys151015propheleulysglutrpgluaspalahislysaspvalgluvalglu202530tyrthrasplysleuleuthrprogluthrvalalaleualalysgly354045alaaspglyvalvalvaltyrglnglnleuasptyrthralaleuthr505560leuglnalaleualaaspasnglyilethrlysmetserleuargasn65707580valglyvalaspasnileaspmetalalysalalysgluleuglyphe859095glnilethrasnvalprovaltyrserproasnalailealagluhis100105110alaalaileglnalaalaargileleuargglnasplysalametasp115120125glulysvalalaarghisaspleuargtrpalaprothrileglyarg130135140gluvalargaspglnvalvalglyvalileglythrglyhisilegly145150155160glnvalphemetglnilemetgluglypheglyalalysvalileala165170175tyraspilepheargasnprogluleuglulyslysglytyrtyrmet180185190aspserleuaspaspleutyrlysglnalaaspvalileserleuhis195200205valprolysvalproalaasnvalhismetileasnaspgluserile210215220alalysmetlysglnaspvalvalilevalasnvalserargglypro225230235240leuvalaspthraspalavalileargglyleuaspserglylysile245250255pheglytyralametaspvaltyrgluglygluvalglyilepheasn260265270gluasptrpgluglylysglupheproaspalaargleualaaspleu275280285ilealaargproasnvalleuvalthrprohisthralaphetyrthr290295300thrhisalavalargasnmetvalvallysalapheaspasnasnleu305310315320gluleuvalgluglylysglualagluthrprovallysvalgly325330335<210>3<211>335<212>prt<213>乳酸脱氢酶的氨基酸序列(lactobacillaceaelactobacillus)<400>3gluphemetthrlysilephealatyralailearggluaspglulys151015propheleulysglutrpgluaspalahislysaspvalgluvalglu202530tyrthrasplysleuleuthrprogluthrvalalaleualalysgly354045alaaspglyvalvalvaltyrglnglnleuasptyrthralagluthr505560leuglnalaleualaaspasnglyilethrlysmetserleuargasn65707580valglyvalaspasnileaspmetalalysalalysgluleuglyphe859095glnilethrasnvalprovaltyrserproasnalailealagluhis100105110alaalaileglnalaalaargileleuargglnasplysalametasp115120125glulysvalalaarghisaspleuargtrpalaprothrileglyarg130135140gluvalargaspglnvalvalglyvalileglythrglyhisilegly145150155160glnvalphemetglnilemetgluglypheglyalalysvalileala165170175tyraspilepheargasnprogluleuglulyslysglytyrtyrval180185190aspserleuaspaspleutyrlysglnalaaspva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